全 文 ：中草药 第 卷第 期 年 月 ·
含量的影响 结果见表 。
表 , 龙衣不 同提取部位对 。小鼠摘细胞膜和
红细胞膜 含 的影响 ‘ 士 , 一
一 士 , 碑一
组 别 剂量 · 一 ‘ 瘤细胞膜 红细胞膜
生理盐水 一 士 士
环磷酞胺 士 士
冷醇提取部位 士 ‘ 士 ‘
士 铃 士 “
士 ‘ 士
热醇提取部位 士 , 士 ,
士 甘 士 赞
士
,
士 苍
与生理盐水组 比较 · 尸 。
丹
表 和 结果表明 , 青龙衣两个提取部位均能
明显降低癌细胞膜表面 含量 , 与生理盐水 比较
差异显著 尸 , 并能显著升高红细胞膜表面
的 含量 , 与生理盐水 比较差异显著 尸 ,
表明青龙衣两个提取部位抗肿瘤作用机制很可能是
通过影响细胞膜来实现的 。
讨论
通过生物膜研究疾病 , 是 目前探讨疾病发病机
制的重要途径之一 。 参与许多生物学现象的调
控 , 包括激素的作用 、 酶的催化 、 细胞间的识别和薪
着 、 免疫反应 、物质转运 、 突触的传递 、 神经的再生及
神经 中枢的高级神经活动等圈 。 研究表明 , 肿瘤细胞
膜表面 含量与正常细胞表面的含量相 比有显著
增加 。 肿瘤细胞膜上 的异常增加与肿瘤恶性程
度有关困 。 本实验结果表明青龙衣冷 、 热醇提取部位
均能显著降低荷瘤小 鼠癌细胞表面 含量 , 说明
其具有一定抗肿瘤转移能力比“ 〕, 其作用是抑制了正
常细胞转变为肿瘤细胞 。 本实验结果还表明青龙衣
不 同提取部位均能显著增加 红 细胞膜表面 含
量 。 提示青龙衣抗肿瘤的机制可能是抑制 了肿瘤的
血行转移 , 即抑制了 从红细胞膜表面的脱落 , 从
而延缓正常的红细胞的免疫功能低下的过程 。
青龙衣两个提取部位中主要含有胡桃酿 、 昔类
和少量多糖类物质 , 抗肿瘤作用明显 。 由本实验看 ,
青龙衣两个提取部位能延长荷瘤小 鼠生命 , 对小 鼠
肉瘤生长也有明显 的抑制作用 。 从免疫器官的影响
来看 , 具有降低免疫器官指数的趋势 , 因此可 以推测
是其毒性作用的表现 。但与环磷酞胺 比较 , 作用又较
小 尸 , 推测与其含有多糖类物质有关 。
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实 验 方 法 学 〕 氏 ,
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中国生物制品杂志 , , 一
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尔滨医科大学学报 , ,
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复方 对人肝星状细胞 价平滑肌肌动蛋 白 表达的调节作用
王 琳‘ , , 王 宝恩 , , 青培根“ , 汪 建‘ , 乔延江‘ , 谈学海
北京 中医药大学中药学院 , 北京 北京友谊医 院 肝病研究中心 , 北京 。 中国医学科学院
中国协和医科大学药用植物研究所 , 北京 北京华大基因研究 中心 , 北京
摘 要 目的 研究复方 对人肝星状细胞 一 中 一平滑肌肌动蛋白 一 基因表达的调节作用 。 方法
应用基于 一 的实时定量荧光 方法 , 研究复方 分别作用 、 、 后 , 一 细胞中 一
收稿 日期 一 一
荃金项 目 中国科学院创新工程项 目 一 一
年毕业于北京中医药大学 , 而后在北京中医药大学任教 , 并从事证作者简介 王 琳 一 , 女 , 山 四太原人 , 助教 , 傅士研究生 , , 仕
候学的研究工作 , 年考取北京中医药大学与北京华大基因研究中心联合培养的博士 , 导师为 肖培根院士和王宝恩教授
研究方向为中药基因组学
。
一 中草药 第 卷第 期 年 月
含量的变化情况 。 结果 复方 在 和 可 以显著降低 一 细胞中 。一 含量 。 结论
复方 可抑制 一 细胞中 一 基因的表达 , 提示其抗肝纤维化作用可能与其抑制 一 细胞的活化有关 。
关键词 复方 实时定量 人肝星状细胞 一平滑肌肌动蛋 白
中图分类号 文献标识码 文章编号 一 一 一
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肝星状细胞是肝纤维化形成时细胞外基质表达
和沉积的主要细胞来源
。 在正常的肝脏 中 , 星状细胞
处于静息状态 , 它 的主要功能是贮存维生素 , 同
时可能与维持正常的基底膜有关
。 当肝脏受到损伤
时 , 肝星状细胞 由静息状态被激活成为具有增殖 、 纤
维分泌和收缩等活性 的肌成纤维细胞 , 并大量表达
一平 滑 肌 肌 动 蛋 白 一 ,
。 目前普遍认为 , 一 是肝星状细胞活化
的重要标志一
。
复方 是北京友谊医 院王宝恩教授研制 的 ,
由丹参 、 黄茂
、
鸡血藤等中药组成的抗纤维化 中药复
方 。 实验研究表明 , 该药具有抑制炎症 、 降低肝组织
中胶原含量 , 减少肝纤维化相关 因子表达等抗肝纤
维化作用 , 能有效逆转慢性肝病所致肝纤维化和早
期肝硬化阵 〕。本研究采用实时定量荧光 方法 ,
观察该药对人肝星状细胞 中 一 表达的
影响 , 以期进一步探讨其作用机制
。
材料与方法
药品与试剂 复方 由北京友谊医院提供 ,
批号 。 高糖 培养基 、链霉素
、
谷氨酞胺
、 、 和
一
均购 自 。 胎牛血清为 产品 。
青霉素为 产品 。 为 公 司产
品 。 荧光染料 购 自上海开放科技发
展有限公司 。 热启动的 聚合酶购 自北京
天为时代科技有限公司 。
细 胞 株 人 肝 星 状 细 胞 株 一 由美 国
教授和纽约 医学
院惠赠 。 细胞用含 胎牛血清 、 一谷
氨酞胺 、 青霉素 和 链霉素的 培养
基培养 。
主要仪器 型
培养箱 由美 国 公 司生产
实时定量 系统为美国 一 公
司产品 低温离心机为德国 产品 。
方法
总 的提取和 合成 取对数生长
期 的 一 细胞 , 胰 酶消化 , 用含 胎 牛血清的
接种于细胞培养皿 中 , 培养 后 , 将培养
液小心移除 , 加人含复方 终质量浓度为
, 该剂量作用于 一 细胞 后 , 细胞存
活率 的新鲜培养液 对照只加同体积培养
液 。 加药后 、 、 , 用 提取细胞 总
, 后用 和 一 逆转 录合
成 。
实时定量荧光 检测 采用
实 时定量 系统对 产物进行扩增和检
测 。 人的 一 和 引物采用 软
件设计 , 引物序列见表 。 采用 拌 反应体
中草药 第 卷第 期 年 月 · ·
系 , 包含 拌 ,
拼 , 引物 扭 拌 , 热启 动
聚合酶 , 无镁离子 的 缓冲液
拜 , · 拜 ,
拌 , 拜 。 在阴性对照管中 , 加人
拼 以代替 。 反应程序为 ℃ 预变
性 , ℃ 变性 , ℃ 一 或
退火 , ℃ 延伸
。
程序设定在
每个循环延伸后 , 收集荧光 , 并 以荧光强度 单位
为 为纵坐标 , 循环数为横坐标 , 绘制曲线 , 以
此计算每个样品的阑值 , 值 。
分别以含 目的基因 一 和 的 一
质粒 已经测序鉴定 为模板标准品 , 以
倍系列稀释 , 进行扩增 。 以标准品拷贝数的对数为横
坐标 , 其 为纵坐标绘制标准曲线 。 将待测样品
值与标准曲线对照 , 即获得待测样品基因拷贝数 。 为
消除样 品间因总 含量不同所致实验误差 , 用
对结果进行校正 。 在 扩增完成后 , 绘
制 产物溶解 曲线 温度变 化 ℃ , 以 分析
产物是否存在非特异性扩增 。
表 人 一 和 基因引物序 列
以一
引物名称 序列 , , 扩增产物长度
。一 正向
反向
正向 兀
反向 ℃
·
数 据 统 计 采 用
软件 , 采用 检验 比较组间差异 。
结果
标准曲线和溶解曲线
拷贝数从 护一 。, 内 , 标准 曲线呈很好线性
关系 , 方程为 一 , 一 。
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图诩
一
阳川川 四
圈 一 蓦因扩增产物的溶解 曲线
一
图 所示为所有标准品和待测样品的溶解曲线
图 。 纵坐标 一 表示荧光强度随温度的
变化情况 , 横坐标为不 同温度 值 。 由于本实验
所采用 的荧光染料 只与双链
结合 , 因此其荧光强度随温度变化的情况可 以显示
相应 产物的溶解温度 ,
值 , 即每个产物溶解 曲线 中 , 最大峰值出现 的
位置 。 因为不同 含量的双链 其 值是
不 同的 , 由此可 以初 步判断 反应产物的特异
性
。 图 结果表明所有标准品和待测样品溶解 曲线
均呈现单一而窄的峰 , 而阴性对照无明显峰出现 , 提
示本研究 中样 品未 出现污染 , 所有扩增产物均为特
异性扩增产物
。 此外 , 本实验还用 琼脂糖凝胶
电泳对 产物进行分析 , 结果亦显示无非特异
性扩增产物 结果未列出 。
复方 对 一 细胞中 一 基因表达的
影响 结果 见 表 。 与对 照组 比较 , 复方 作用
、 、 , 均 可使 一 细胞 中 一
含量降低 。 其中药物作用 和 后 , 药物组与对
照组差异显著 、 。
表 复方 对 一 细胞 一
表达的影响 ‘士 , 一
一
一 士 , 二
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循环数
组别
剂量 一 的相对拷贝数
图 一 标准质粒扩增 的荧光数据
一
图 所示 为不 同拷 贝数 护 , 的
标准品 连接有 目的基因的质粒 在每个循环时的荧
光强度
。 以标准品的 值为纵坐标 , 以其拷贝数的
对数为横坐标 , 绘制标准曲线 , 结果表明在 目的基因
· 一 ‘
对照 一
复方
士 士 士
士 士 苍 士 “
与对照组比较 ’ 二 尸
补 怪 百 哪
讨论
肝星状细胞是介导肝纤维化发生 的关键 因素 。
肝脏受到各种损伤时 , 肝星状细胞活化为具有高度
· · 中草药 第 卷第 期 年 月
增殖活性和 一 表达 阳性 的肌成纤维细胞 , 合
成大量细胞外基质 尤其是 型和 型胶原 , 导致
肝纤维化发生 。 一 细胞是活化的人肝星状细胞
株 , 它有典型 的星状细胞特征 , 在培养状态下 , 可表
达 一 蛋 白〔 〕。
本实验运用 了一种可信 、 准确而相对经济的基
于 的实时定量 技术 , 检测了复
方 对 一 细胞 中 一 表达 的影
响
。
为保证反应的特异性 , 减少非特异性扩增和获得
正确的扩增产物 , 本实验对包括引物 、 离子浓度和反
应程序等在内的各种条件进行了优化 。结果显示 , 本
次实验 的 反应具有高度 的特异性 , 扩增产物
为均一的 目的片段 。 标准曲线亦显示 , 在 , 一
护 内 , 曲线呈非常好的线性关系 。 实验结果表
明 , 复 方 作 用 和 后 , 一 细 胞 中
一 的水平显著降低 尸
、 。
这说明该药可抑制 一 细胞 中 一 基 因的表
达 , 提示其抗肝纤维化 的作用可能与其抑
·
制肝星状
细胞的活化有关 。
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仁〕 , 玩 万 , ,
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多 胃肠病学和肝病学
杂志 , , 一
仁 , 眼 , , 。
介。 仁〕 , 己 口 中华肝脏病杂志 , ,
一
仁 」 , , ,
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一 仁〕
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月动 砚理 , ,
一
川苟嗓对人脐静脉内皮细胞 增殖的影响
徐晓玉 , 杨 丽 蓉 , 陈 刚
重庆医科大学中医药学院 , 重庆
川芍为活血化癖代表性 中药 , 临床应用甚广 。川
芍嗓 , 为川芍主要有效
成 分之 一 。 前期研 究表 明 , 川芍嗓注射液 能抑 制
肺癌荷瘤小 鼠移植瘤 的生长和肺转移 , 可降
低肿瘤组织微血管密度和抑制肿瘤细胞血管内皮生
长因子 的表达 。 本试验 旨在进一步探讨川
芍嗓含药血清对人脐静脉内皮细胞 的增
殖和对 诱导的 的增殖是否具有抑
制作用 , 为深入研究川芍嗦抗血管生成的机制 , 应用
川芍嗓治疗血管新生性疾病 肿瘤 、 类风湿性关节
炎 、增殖性视网膜病变等 〕提供实验依据 。
材料与方法
药 品与试剂 盐酸川芍嚓注射液 , 无锡市第七
制 药 有 限 公 司 产 品 , 规 格 , 批 号
。 一 培养基 , 美国 新生小
牛 血清 中美合资兰 州 民海生物工程有 限公 司
一胸腺嚓吮核昔 一 试剂盒 中国科学 院
上海原子核研究所 四氮哇蓝 、 二 甲基亚
矾 、胰酶等 , 均为美国 公司产品 。
主要仪器 型 二氧化碳培养箱
, 美 国 , 型 液 体 闪 烁 计 数 仪
, 美 国 , 型多头细胞样 品收集器 绍兴
卫 星医疗设备制造有限公 司 ,
班 自动酶标仪 澳大利亚 , 倒置相差显
微镜 日本 。
川芍嗦含药血清的制备 取 雌性
大 鼠 只 , 随机分为 组 , 芍嚓 、
组 , 空 白对照组 生理盐水 , 各组
给药 , 每 日 次 连续 。 末次给药 后 , 乙醚
麻醉 , 无菌条件下经腹主动脉取血 。 血液于 ℃ 静
置 , 离心 , 取上清液滤过除
菌 , ℃ 冷藏备用 。
收稿 日期 一 一
甚金项 目 国家 自然科学基金资助项 目 。。
作者简介 徐晓玉 一 , 女 , 四川人 , 教授 , 博士生导师 , 主要从事活血化癖药及补益药的 中药药理学研究 , 主持国家 自然科学基金等
科研项 目 项 , 发表学术论文 篇 。 一