全 文 ：人参炔醇对 HL-60 细胞体外诱导分化作用的研究
王泽剑1 ,吴英理2 ,林　琦1,陈红专1,陆　阳1X
( 1. 上海第二医科大学药物研究所, 上海　200025; 2. 上海第二医科大学附属瑞金医院血液病研究所,上海　200025)
摘　要: 目的　通过细胞形态学和增殖动力学研究人参炔醇对 HL-60 细胞诱导分化作用。方法　采用台盼蓝染色
及细胞计数器测定细胞存活量,流式细胞仪检测人参炔醇对细胞周期和分子标志表达的影响, 观察信号通路阻断
剂对人参炔醇诱导细胞分化的影响。结果　人参炔醇使 HL-60 细胞倍增时间延长, 诱导 HL-60 向单核细胞分化,
细胞集中于 G 1期,显著上调细胞表面 CD14 分子表达,并中度上调 CD11b 分子表达, RpcAMPS 及 H7 均可使人参
炔醇诱导的 HL-60 细胞 NBT 阳性率降低。结论　人参炔醇诱导 HL-60 向单核细胞分化 ,与细胞内腺苷酸环化酶
( cAMP ) , 蛋白激酶 C ( PKC) 信号通路活化有关。
关键词: 三七; 人参炔醇; HL-60; 细胞分化
中图分类号: R286. 91　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2003) 08 0736 03
Effect of panaxynol on differentiation of HL-60 cells line in vitro induced
WANG Ze-jian
1
, WU Ying-li
2
, LIN Qi
1
, CHEN Hong-zhuan
1
, LU Yang
1
( 1. Institute of M ateria Medica; 2. Institute of Hemato lo gy of Ruijin Hospit al,
Shangha i Second M edical Univ ersit y, Shanghai 200025, China)
Key words : Panax notoginseng ( Bur k. ) F . H. Chen; panaxyno l; HL-60; cell differ ent iat ion
　　三七 Panax notoginseng ( Bur k. ) F . H. Chen
在中国民间具有悠久的药用历史,具有止血活血、消
肿止痛的功效,常用于治疗多种外伤性疾病。现代临
床实践证明三七在中枢神经系统、心血管系统、内分
泌系统和免疫系统具有广泛的药理活性; 基础研究
表明三七及其活性成分具有抗肿瘤、抗应激、抗氧化
的作用。以往对三七化学成分和活性研究多集中在
三七正丁醇部位 (皂苷成分) , 曾报道从三七醇提物
的石油醚部位分离出人参炔醇 ( panaxynol ) 和人参
环氧炔醇 ( panaxydo l) [ 1]。人参炔醇对多种肿瘤细
胞具有十分明显的增殖抑制作用[ 2]。为进一步阐明
其在防治肿瘤过程中的作用及机制,本实验以维甲
酸为阳性对照,研究了人参炔醇对体外培养 HL-60
细胞的影响。
1　材料和方法
1. 1　材料与试剂: HL-60 细胞系由中国科学院上
海细胞所提供。人参炔醇按报道方法制备[ 1] ,波谱及
色谱分析均显示为单体化合物, 纯度≥98%。将其溶
于无水乙醇, 终浓度为 0. 1% ,储备在 4 ℃ 冰箱中
备用。台盼蓝、溴化乙锭、NBT 购自上海生工试剂公
司。维甲酸由上海第二医科大学附属瑞金医院血液
病研究所提供。FITC 标记的 CD11b, FIT C 标记的
CD13, PE 标记的 CD14 鼠抗人单克隆抗体为
DaKo 公司产品。T PA, RpcAMPS, H7 均为 Sigma
公司产品。RPM I1640、胎牛血清为 Gibco 公司产
品。
1. 2　仪器: FACS-420 型流式细胞仪为 Coulter 公
司产品; 颗粒计数形态分析仪 ( Part icle Count and
Size Analy zer) 为 Beckman 公司产品; 细胞甩片机
( Cytopro ) 为 Viescor 公司产品; CM120 型电镜为
荷兰菲利浦公司产品。
1. 3　方法:将 HL-60细胞培养于含 10% 灭活胎牛
血清及青霉素 100 U / mL、链霉素 100 Lg/ mL 的
RPM I1640培养液中,置 CO 2孵箱中悬浮培养。实验
分 3 组: 正常对照组、人参炔醇组、维甲酸组。根据
细胞毒性试验选用人参炔醇组浓度分别为 4, 8, 16
Lmol/ L ,维甲酸 ( 0. 1 Lmol/ L ) 为阳性对照。每组设
3个平行。
1. 3. 1　细胞生长测定: 加药后连续 3 d, 逐日取各
组细胞,台盼蓝染色观察,细胞计数器计数。
细胞倍增时间 TD= tlog2/ ( logN t -logN 0) [3]
式中 t 为培养时间, N 0, N t分别代表接种后及培养 t h
后的细胞数。
1. 3. 2　电镜观察: 加药 72 h 后分别取处理组和对
·736· 中草药　Chinese T raditional and Herbal D rug s　第 34 卷第 8 期 2003年 8月
X 收稿日期: 2002-08-13基金项目:上海市教委学科建设专项基金资助项目 ( S970204)作者简介:王泽剑( 1972—) ,男,河南郑州人,上海第二医科大学在读博士,主要研究方向:治疗防尔茨海默病的新药开发。
T el: ( 021) 63846590-776464　E-mail : w an gzej ian0@ Yahoo. com. cn
照组细胞悬液离心, 弃上清, 沉淀细胞用 2. 5% 的
戊二醛磷酸缓冲液固定, 48 h 后琼脂糖凝胶包埋,
锇酸染色,制片后电镜下观察细胞形态。
1. 3. 3　NBT 实验: 加药 72 h 后取处理组和对照组
细胞悬液离心, 弃上清, 沉淀重悬于无血清培养基
中, 1 000 r/ min 离心 5 min,弃上清。每管加入 1 mL
含 0. 1 % NBT 和 100 ng / mL T PA 的无血清培养
基, 37 ℃ 放置 25 min, 吸少量细胞悬液, 甩片, 干
燥,常规瑞氏-姬姆萨染色, 在油镜下计数 200 个细
胞,含蓝紫色斑为阳性细胞,计算阳性率[ 4] ;阻断剂
组在人参炔醇 16 Lmol/ L 组加药孵育的同时加 Rp-
cAMPS 或 H7, 其终浓度分别为 100 Lmol/ L 和 50
Lmol/ L , 72 h 后观察阻断剂对人参炔醇诱导细胞
NBT 反应的影响。
1. 3. 4　流式细胞仪检测: 加药 72 h 后收集细胞并
计数, PBS 洗涤, 取部分细胞用 70% 乙醇固定, 用
于 DNA 含量测定, 另一部分细胞分别与不同的 CD
单抗孵育 30 min 之后固定, 上样前离心去除固定
液,调细胞浓度为 106/ mL, 流式细胞仪检测, Bios
Consort30软件系统处理数据。
2　结果
2. 1　对细胞生长的影响:见表 1。人参炔醇和维甲
酸均可使 HL-60 细胞增殖数量下降, 倍增时间延
长,对细胞生长有明显抑制作用。经台盼蓝染色,各
组细胞均未发现坏死细胞。
表 1　人参炔醇对 HL-60 细胞倍增时间的影响 ( x±s, n= 3)
Table 1　Effect of panaxynol on double time
of HL-60 cells ( x±s, n= 3)
组　别 剂　量
/ ( Lmol·L - 1)
细胞倍增时间/ h
24 h 48 h 72 h
对照 - 23. 6±4. 41 23. 1±2. 35 25. 4± 4. 27
维甲酸 0. 1 33. 4±4. 37* 39. 0±2. 47* * 54. 8± 8. 54* *
人参炔醇 4 30. 8±4. 54 37. 2±4. 42* 39. 8± 2. 23*
8 38. 3±6. 47* 54. 4±4. 54* * 64. 2± 6. 27* *
16 40. 4±2. 27* * 54. 0±6. 28* * 68. 7±10. 47* *
　　与对照组比较: * P< 0. 05　* * P < 0. 01
　　* P < 0. 05　* * P< 0. 01 v s cont rol group
2. 2　电镜观察结果: 对照组 HL-60 细胞呈圆形或
不规则椭圆形,胞质内核糖体丰富,可见粗面内质网
及线粒体, 胞核大而胞浆极少, 常见 1～2 个大核
仁,核内常染色质明显; 人参炔醇处理 72 h 后, HL-
60 细胞胞体稍有增大,核浆比下降,核形状不规则,
呈肾形,核内异染色质数量明显增加,胞质中除一般
细胞器外,还可见发育良好的高尔基体和微丝结构。
2. 3　对 HL-60 细胞分化的影响:见表 2。人参炔醇
和维甲酸均对 HL-60细胞具有诱导分化作用。人参
炔醇对 HL-60 具有剂量、时间依赖的诱导分化作
用, 16 Lmol/ L 的人参炔醇作用 72 h 可诱导 58%
的 HL-60 细胞分化。预先给予 cAMP 依赖蛋白激
酶的特异性阻断剂 RpcAMPS 后可显著的抑制
NBT 反应阳性率, NBT 阳性细胞为 12. 7% , 与人
参炔醇 16 Lmol/ L 组相比差异有显著统计学 ( P<
0. 01) ; 预先给予 PKC 阻断剂 H7 后, NBT 阳性细
胞为 42. 7%, 与人参炔醇组相比有显著性差异
( P< 0. 05) , 提示 RpcAMPS 和 H7 均可抑制人参
炔醇对 HL-60 细胞诱导分化作用,以 RpcAMPS 作
用较为显著。
表 2　人参炔醇对 HL-60 细胞 NBT 反应
阳性率的作用 ( x±s, n= 3)
Table 2　Ef fect of panaxynol on NBT positive reduction
of HL-60 cells ( x±s, n= 3)
组 　
别
剂　量
/ ( Lmol·L- 1)
反应阳性率/ %
24 h　 48 h　 72 h　
对照 　- 2. 4±1. 41 4. 2±2. 47 2. 5±1. 07
维甲酸 　 0. 1 12. 2±3. 43* 31. 7±4. 75* * 55. 2±8. 47* *
人参炔醇 4 12. 5±4. 07* 16. 7±5. 84* * 30. 4±8. 79* *
8 12. 7±4. 85* 23. 5±5. 46* * 47. 4±4. 58* *
16 14. 8±4. 25* * 38. 4±9. 28* * 58. 3±6. 35* *
　　与对照组比较: * P < 0. 05　* * P < 0. 01
　　* P < 0. 05　* * P < 0. 01 v s cont rol group
2. 4　流式细胞仪检测结果: 见表 3和 4。人参炔醇
可剂量依赖性增加 G 0/ G 1期细胞数, S 期细胞数相
应减少, G 2 / M 期细胞数增加,细胞被阻滞于 G0 / G 1
期和 G 2 / M 期,提示细胞增殖受抑制。维甲酸组诱
导 HL-60 细胞凋亡,凋亡率 16. 7% ,而人参炔醇各
剂量组均未发现对 HL-60细胞有诱导凋亡作用。人
参炔醇中度增加 HL-60 细胞表面 CD11b 分子表
达, 并剂量依赖性促进 CD14 分子表达, 降低 CD13
的表达, 维甲酸可明显促进 CD11b 分子表达, 下调
CD13 分子表达,对 CD14 分子表达无影响。
表 3　人参炔醇对 HL-60 细胞周期的影响 ( x±s, n= 3)
Table 3　Ef fect of panaxynol on cycle
of HL-60 cells ( x±s, n= 3)
组　别 剂　量
/ ( Lmol·L- 1)
细胞周期分布/ %
G 0/G 1 S G 2/M
对照 - 29. 2±4. 4 　64. 1±2. 4 　1. 5±4. 3
维甲酸 0. 1 43. 7±4. 7* 54. 8±8. 4* * 1. 7±2. 4
人参炔醇 4 30. 8±4. 5 41. 2±4. 5* * 27. 8±2. 2* *
8 45. 3±6. 7* 37. 2±4. 4* * 17. 4±6. 7* *
16 65. 3±2. 2* * 18. 4±6. 2* * 15. 1±4. 4* *
　　与对照组比较: * P < 0. 05　* * P < 0. 01
　　* P < 0. 05　* * P < 0. 01 v s cont rol group
3　讨论
　　HL-60是人早幼粒白血病细胞系,易于观察形
·737·中草药　Chinese T raditional and Herbal D rug s　第 34 卷第 8 期 2003年 8月
表 4　人参炔醇对 HL-60 细胞 CD 分子
表达的影响 ( x±s, n= 3)
Table 4　Ef fect of panaxynol on expression
of CD of HL-60 cells ( x±s, n= 3)
组 　
别
剂　量
/ ( Lmol·L- 1)
细胞表面分子/ %
CD11b　 CD13 CD14
对照 - 6. 2±2. 1 84. 8±9. 3 12. 4±1. 8
维甲酸 0. 1 60. 2±6. 5* * 51. 5±7. 7* * 17. 1±3. 5
人参炔醇 4 15. 8±4. 5* 58. 5±6. 5* * 35. 5±3. 4* *
8 21. 3±3. 7* * 29. 7±4. 8* * 64. 4±4. 5* *
16 25. 4±8. 2* * 16. 5±2. 4* * 78. 2±4. 2* *
　　与对照组比较: * P< 0. 05　* * P < 0. 01
　　* P < 0. 05　* * P< 0. 01 v s cont rol group
态,因此常作为诱导分化研究的模型之一, 不同的分
化诱导剂可分别诱导 HL-60 细胞向粒细胞或单核
巨噬细胞分化 [ 5]。台盼蓝染色显示人参炔醇各组均
无坏死细胞, 流式细胞仪结果显示人参炔醇在诱导
分化过程中,对 HL-60 细胞增殖及 DNA 合成具有
明显的抑制作用,未见凋亡峰, 进一步说明该剂量、
时间范围内人参炔醇可直接抑制 HL-60 细胞增殖,
但并不杀伤细胞。
形态分化客观地反映分化诱导剂对细胞的分化
作用; 细胞功能分化可反映药物诱导分化的可能机
制。由于分化 HL-60 细胞中过氧化物酶的作用,
NBT 接受来自 NADPH 的氢,变成蓝紫色的甲瓒,
并沉积于有过氧化物酶的部位,因此,通常以 NBT
还原能力判断 HL-60细胞是否分化成熟[ 6]。有效的
诱导剂 N BT 反应阳性率应大于 50% ,因此,人参炔
醇可作为诱导分化剂。
人参炔醇对 HL-60 细胞的 DNA 合成具有明
显的抑制作用, G 1期细胞数显著增加, S 期细胞相应
减少。CD11b 是细胞表面 B2整合素的 A亚基, 在未
分化的髓系细胞仅微量表达,是 HL-60 细胞分化早
期的分子标志, 为粒细胞和单核细胞所共有[ 5, 7] ;
CD13是细胞表面的氨肽酶 N,为细胞髓系标志,与
急性髓系白血病的肿瘤浸润及肿瘤细胞对凋亡诱导
剂的耐受有关, 目前发现 CD13 的高表达涉及部分
病人化疗后的维甲酸综合征及白细胞增多, CD13
表达的下降可提高肿瘤细胞对凋亡诱导剂的敏感
性[ 8, 9] ; CD14 为镶嵌在细胞膜蛋白上的磷脂成分,
其功能可能是髓系特异的生长因子受体, 在粒系仅
微量表达,随单核细胞逐渐成熟 CD14 表达相应增
加,被认为是单核/巨噬细胞的标志 [ 9] , 实验结果提
示经人参炔醇处理的 HL-60 细胞其恶性程度降低,
并向单核/巨噬细胞方向分化,该时间范围内未见到
细胞凋亡,可能与孵育时间较短有关。
以往研究表明 HL-60 细胞向单核/巨噬细胞方
向分化通常与细胞内腺苷酸环化酶、蛋白激酶 C 通
路的活化有关 [ 9, 10]。本实验结果提示: 人参炔醇对
HL-60 细胞的诱导分化作用与细胞内 cAMP, PKC
通路的活化有关,以 cAMP 依赖的蛋白激酶系统活
化为主。人参炔醇对细胞内信号通路的影响是直接
作用还是间接作用仍须进一步研究。
致谢:上海第二医科大学附属瑞金医院血研所王振义教
授对本实验设计的指导,上海第二军医大学细胞生物学教研
室易静教授对本研究的电镜技术支持。
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