全 文 ：·药材·
浙江产香茶菜属植物 8个居群的 RAPD分析
方　芳 1, 2 ,郭水良 2 ,黄　华 2 ,毛晓燕 2 ,郭卫东 2
( 1. 浙江大学生命科学学院 ,浙江 杭州　 310028;　 2. 浙江师范大学生命与环境科学学院 ,浙江 金华　 321004)
摘　要: 目的　从 DNA分子水平上探讨香茶菜属植物种群变异特点。方法　从 70个随机引物中筛选出 10个具有
较高多态性检测能力的引物。用这 10个随机引物对浙江境内 3种香茶菜的 8个居群进行了 RAPD分析 ,对得出的
RAPD结果应用 S PSS10. 0进行的聚类分析和应用 CANOCO3. 10进行的除趋势对应分析。结果　共检测出 144个
位点 ,其中单态位点 11个 ,占 7. 64% ,多态位点 133个 ,占 92. 36%。分析结果表明 ,浙江产香茶菜不同种、同一种的
不同居群间存在明显的遗传分化 ,其中种间的差异要大于种内 ,大萼香茶菜 Isodon macrocaly x居群间的差异要比
香茶菜 I . amethy stoides居群的小。 结论　香茶菜形态与化学成分的变异有一定的遗传学基础。
关键词: 香茶菜属 ;居群 ; RAPD;遗传多样性
中图分类号: R282. 710. 3　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2003) 06 0553 04
RAPD analysis of eight populations in plants of Isodon ( Schrad. ex Benth. ) Kudo
from Zhejiang Province
FANG Fang
12
, GUO Shui-liang
2
, HUANG Hua
2
, M AO Xiao-yan
2
, GUO Wei-dong
2
( 1. Colleg e of Life Sciences, Zhe jiang Univ er sity , Hang zhou 310028, China;　 2. Co lleg e of Life and
Env ironment Sciences, Zhe jiang No rma l Univ er sity , Jinhua 321004; China )
Abstract: Object　 To study the popula tion va riations f rom plants o f Isodon ( Schrad. ex Benth. ) Ku-
do at DN A level. Methods　 Eight plant populations of Isodon ( Schrad. ex Benth. ) Kudo collected f rom
Zhejing Province w ere analy zed by RAPD. The results fo r eight populations f rom three species of Isodon
( Schrad. ex Benth. ) Kudo w ere analy zed by clustering analysis SPSS10. 0 and Detrended Co rrespondence
Analysis ( DCA) CANOCO 3. 10. Ten o f the 70 random primers w ere tested to possess the st ronger detect-
ing ef fect of polymorphous character. Results　 A to tal of 144 bands was amplified by the 10 primers,
7. 64% o f the total bands was 11 monomo rphic, 92. 36% of the to tal bands w as 133 polymo rphic. The re-
sul ts indicated that the genetic va riations existed wi thin the popula tions of the same species o r th e dif ferent
species in Zhejiang Province, and the variances wi thin the populations of I. macrocaly x were sligh tly
smaller than those o f I. amethystoides. Conclusion　 There are some genetic backg rounds in the variations
o f the morpho logy and the chemical compounds in the species of I . amethystoides.
Key words: Isodon ( Schrad. ex Benth. ) Kudo; popula tion; RAPD; genetic div ersity
　　唇形科香茶菜属〔Isodon ( Sch rad. ex Benth. )
Kudo〕植物是民间常用的草药 [1 ] ,在我国 24个省区
内广泛分布。 该属中富含的二萜类化合物具有抗菌
消炎、抗肿瘤、增强机体免疫功能和抗 HIV-I病毒
等活性 [2, 3 ] ,因此具有很高的药用价值。目前 ,国内外
出现了香茶菜属植物研究开发的热潮。
自 20世纪 90年代以来 , RAPD技术已被证明
是植物遗传多样性研究和系统学研究的一个简便有
效的工具 ,并被广泛地应用于属下等级的分类及进
化等方面的研究 [4, 5 ]。 陈林姣等采用 RAPD技术对
溪黄草及其 4种药用近缘种进行了研究 ,为它们的
鉴别提供了科学依据并初步探讨了其亲缘关系 [6 ]。
·553·中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　第 34卷第 6期 2003年 6月
收稿日期: 2002-12-21基金项目:浙江省自然科学基金 ( 301028)资助项目 ;金华市科委计划项目 ( 2001-1-271)资助 ;浙江省中青年学科带头人基金资助项目作者简介:方　芳 ( 1969- ) ,女 ,浙江省金华市人 ,高级实验师 , 1991年毕业于浙江师范大学生物教育专业 ,获学士学位 , 1991年至今 ,在浙江师范大学生命与环境科学学院工作 , 2000年至今为浙江大学生命科学学院在读硕士生 ,研究方向为药用植物学 ,植物生理学等 ,曾参加和主持浙江省自然科学基金项目等 8项 ,发表论文 10多篇。
Tel: ( 0579) 2282269 ( O)　 E-m ail: s ky85@ mai l. zjnu. net . cn
香茶菜居群的形态变异很大 [ 7～ 9] ,陈玉俊等发现浙
江省不同产地的香茶菜地下部分中二萜类含量明显
不同 [ 10 ] ,并且在胃复春片 (其主要组成是香茶菜 )中
发现不同形态和来源的香茶菜 ,其有效成分存在差
异。但是 ,目前尚不知形态与植物成分上的差异是否
有遗传学基础。本实验采用 RAPD技术分析浙江境
内 3种香茶菜及同一种内不同居群间的遗传多态性
和遗传关系 ,旨在揭示香茶菜种下遗传变异特点 ,从
而为筛选有遗传基础的高二萜类含量香茶菜居群提
供理论指导。
1　材料和方法
1. 1　材料:实验所用材料于 2001-05— 2002-06月从
浙江省不同野生居群移植于浙江师范大学苗圃内栽
培所得 ,并由浙江师范大学生命与环境科学学院郭水
良博士鉴定 ,材料名称及来源见表 1。 从每一个居群
的多个个体中选取新鲜幼叶提取总 DNA。
表 1　香茶菜居群及其来源
　　 Table 1　 Populations and their resources in plants
of Isodon ( Schrad. ex Benth. ) Kudo
编号 种类 居群来源
1 大萼香茶菜 Isodon m acrocalyx 金华北山
2 大萼香茶菜 I. m acrocalyx 临安西天目山
3 显脉香茶菜 I. nervosa 金华南山
4 香茶菜 I. amethystoides 金华北山
5 香茶菜 I. amethystoides 金华南山
6 香茶菜 I. amethystoides 台州三门
7 香茶菜 I. amethystoides 温州雁荡山
8 香茶菜 I. amethystoides 丽水白云山
1. 2　实验方法
1. 2. 1　总 DNA的提取: DN A提取方法参考 SDS
法 ,并修改 ,方法如下: ( 1)分别用清水和蒸馏水将叶
片洗净 ,用无菌吸水纸吸干 ; ( 2)称取 0. 3～ 1. 0 g叶
片 ,剪碎后在液氮中迅速研磨成细粉末状 ,分装至
1. 5 mL离心管中; ( 3)加入 600μL的 SDS提取液
( 100 mmol /L Tris-HCl pH8. 0, 50 mmo l /L EDT A
pH8. 0, 500 mmol /L NaCl, 100 mmol /L β -巯基乙
醇 , 3% SDS) ,匀浆器上振荡混匀 , 65℃水浴保温 30
min; ( 4)置冰上 ,加入等体积 5 mol /L醋酸钾 ,冰浴
30 min; 4℃条件下 12 000 r /min离心 10 min; ( 5)
将上清液转入新离心管中 ,加 0. 6倍体积异丙醇 ,混
匀后置冰上 10 min。 4℃条件下 12 000 r /min离心
10 min; ( 6)弃去上清液 ,沉淀溶于 500μL的 T E缓
冲液中 ,常温下静置 20 min左右 ; ( 7)加入等体积的
氯仿 -异戊醇 ( 24∶ 1) , 4℃ 12 000 r /min离心 10
min; ( 8)取上层水相 ,用 50 μL 的 10 mg /mL
RNaseA在 37℃下消化 30 min以除去 RNA; ( 9)加
等体积的氯仿-异戊醇 ( 24∶ 1)再抽提 1次;取上层水
相加 0. 6倍体积异丙醇 ,轻轻混匀后 ,室温放置 10～
15 min; ( 10) 4℃条件下 , 12 000 r /min离心 15min,
弃去上清液 ,可见离心管底部有微量白色沉淀 ,加
500μL预冷的 70%乙醇洗 2次后 ,室温干燥; ( 11)溶
于 100μL的 TE中 ,低温 ( - 20℃ )保存备用。
1. 2. 2　 DNA纯度和质量的检测: 总 DNA的纯度和
质量的检验采用琼脂糖凝胶电泳检验和紫外吸收检
验。在 Ultro spec 4000全自动紫外可见分光光度计
上 , 测定提取的总 DNA 样品 A260、 A280值; 以
A260 /A280值估测其纯度。同时用 0. 8%琼脂糖凝胶 ( EB
0. 5μg /m L)电泳 ,也可以测定 DNA样品的纯度。
1. 2. 3　引物及其筛选:本实验所用的引物购自上海生
工生物工程公司 ,一共 70个引物 ,分别记为 S40～
S50、 S301～ S360。 任取一个模板 ,对所有引物进行
PCR扩增 ,根据扩增条带数的多少对引物作初步筛
选。筛选的原则是扩增条带数多且条带数清晰的引物。
1. 2. 4　扩增反应:以所提 DNA为模板 , 10碱基的
寡核苷酸为引物 ,在 Hybrid PCR Express热循环仪
上进行 RAPD扩增。 反应体系 ( 25μL)包括模板
DNA 1μL(约 30～ 50 ng ) ; 2 mmol /L MgCl2 ; 400
μmol /L dN T P;引物 30 ng; Taq酶 1 U。 PCR反应
缓冲液 , dN TP及 Taq酶均为上海生工生物工程公
司产品。
扩增程序: 94℃预变性 5 min; PCR循环 40
次 ,每循环 94℃变性 1 min, 36℃退火 1 min, 72℃
延伸 2 min;最后 72℃延伸 7 min。
PCR结果检测: PCR产物用含有 0. 5μg /mL
溴化乙锭 ( EB)的 1. 4%琼脂糖凝胶电泳检验。 以
1× TBE为电极缓冲液 ,电压为 4V /cm ,稳压电泳 2
h。电泳结果在紫外透射仪上观察、记录、拍照。照相
机配红色滤光片。
1. 3　数据处理:每个 PCR扩增反应重复一次以上 ,
选取可重复的 DNA带 (包括强带和弱带 )记录。 每
个样品的扩增带按“有”或“无”记录。“有”赋值为 1,
“无”赋值为 0。 在 SPSS10. 0软件中 ,采用 sokal
snea th 1作为居群间遗传分化的相似系数计算居群
间遗传相似程度 ,以此为基础 ,用最近邻体法对 8个
居群聚类分析 ,根据聚类图特点 ,分析居群遗传分化
特点。同时应用除趋势对应分析 ( Dedentred Co rre-
spondence Analysis)比较 8个居群在遗传组成上的
相似关系 ,进行除 趋势对应分析时 ,应 用了
CANOCO3. 10和 CANODRAW3. 0软件。
·554· 中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　第 34卷第 6期 2003年 6月
2　结果与分析
2. 1　模板 DNA的纯度和质量的检测: DN A紫外
分光光度计测定的结果可见 8个 DNA样本 A260 /
A280值在 1. 8～ 2. 0,均可用做 RAPD分析。用 0. 8%
琼脂糖凝胶电泳对 8个 DNA样本进行检测 , RN A
被完全降解 , DN A呈一亮带 ,很少降解。
2. 2　 RAPD扩增结果:对 70个随机引物 ( 10个核苷
酸长 )进行扩增 ,有 25个引物有扩增产物产生 ,其多
态性随引物的不同而表现出差异。从中筛选出 10个
能够产生清晰并呈现多态性条带的引物 ,用以对 8份
材料进行 RAPD扩增 ,并对这 10个引物的扩增结果
进行统计分析 (表 2)。在供试材料中共获得 144条扩
增产物 ,引物的扩增带数在 8～ 24条 ,平均每个引物
扩增的 DNA带数为 14. 4条 ;其中 133条带具有遗
传多态性 ,约占总数的 92. 36% ,每个引物可扩增的
多态带不等 ,从 8～ 24条变化 ,平均为 13. 3条。对大
萼香茶菜和香茶菜两个种内的不同居群分别进行统
计 ,结果见表 3。大萼香茶菜两个居群共扩增出 93条
DNA带 ,其中 44条为多态性带 ,占 47. 31% 。香茶菜
5个居群共扩增出 125条 DNA带 ,多态性带占
76. 80% 。表 3统计结果还表明 ,浙江产 3种香茶菜的
5个居群多态性带占总数的 76. 80%。 这表明不同品
种的香茶菜和同一种内不同居群的香茶菜之间都存
在较高的多态性 ,遗传变异较大。 图 1为 S43和 S
339两个引物对 8个不同样本的扩增结果。由图 1可
见 ,产生的 DNA片段主要分布在 0. 941～ 4. 973 kbp
区域 ,少数片段小于 0. 941 kbp。
表 2　香茶菜 RAPD所用的引物及其扩增结果
　 Table 2　 Primers used for RAPD and amplified bands
of Isodon ( Schrad. ex Benth. ) Kudo
引物 序列 ( 5′→ 3′) 扩增带数 多态带数 多态性带数 /%
S43 GT CGCCGTCA 　　 16 　　 15 　　 93. 75
S44 TCTGGTGAGG 17 16 94. 12
S45 TGAGCGGACA 13 12 92. 31
S48 GT GTGCCCCA 20 20 100. 00
S301 CT GGGCACGA 9 7 77. 78
S313 ACGGGAGCAA 9 8 88. 89
S317 GACACGGACC 12 9 75. 00
S328 GGG TGGGT AA 8 7 87. 50
S337 CCTTCCCACT 24 24 100. 00
S339 G TGCGAGCAA 16 15 93. 75
总和 144 133
平均数 14. 4 13. 3 92. 36
2. 3　香茶菜的聚类分析:居群间的 RAPD片段 (即
遗传相似度 )能够在一定程度上反映居群间 DNA
表 3　大萼香茶菜 2个居群、香茶菜 5个居群的遗传多样性比较
Table 3　 Comparison of genetic diversity between two popu-
lations of I. macrocalyx and five populations
of I. amethystoides based on their RAPD data
引物
　大萼香茶菜 2个居群　 　　香茶菜 5个居群　　
扩增
带数
多态性
带数
多态性
带数 /%
扩增
带数
多态性
带数
多态性
带数 /%
S43 　 11 　 3 　 27. 27 　 14 　 13 　 92. 86
S44 9 5 55. 56 13 12 92. 31
S45 9 6 66. 67 11 8 72. 73
S48 14 7 50. 00 17 15 88. 24
S301 6 3 50. 00 8 5 62. 50
S313 4 1 25. 00 8 5 62. 50
S317 9 2 22. 22 10 5 50. 00
S328 5 2 40. 00 7 4 57. 14
S337 19 11 57. 89 21 20 95. 24
S339 7 4 57. 14 16 9 56. 25
总数 93 44 125 96
平均数 9. 3 4. 4 47. 31 12. 5 9. 6 76. 80
材料编号见表 1; M 1为 Lambda DN A /EcoRⅠ + Hind Ⅲ标准
相对分子质量 ; M 2为 Lambda DNA /HindⅢ标准相对分子质量
Sam ples 1- 8 w ere li sted in Table 1; M 1 is s tandard molecular
w eigh t of Lambda DNA /EcoRⅠ + Hind Ⅲ ; M 2 is s tandard
molecular w eight of Lambda DNA /HindⅢ
图 1　由 S43( A)和 S339(B)扩增产生的 RAPD带型
Fig. 1　 RAPD bands amplified by S43 (A) and S339 ( B)
的差异。 根据每个引物对 3种香茶菜 8个居群的基
因组的 DNA扩增结果 ,编码后采用 sokal sneath 1
作为居群间的遗传相似度值 ,聚类策略采用最近邻
体法 ,结果见图 2。基于 RAPD分析所获得的数据 ,
应用除趋势对应分析 ( DCA) ,对 8个居群进行排序
得到图 3。 图 3也同样反映出 8个居群在遗传上有
明显的分化 ,与大萼香茶菜相比 ,香茶菜居群间的遗
传差异明显大一些。
3　讨论
除趋势对应分析 ( DCA)作为一种成熟的生态
学多元统计分析方法 ,在生态学上得到了广泛地应
·555·中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　第 34卷第 6期 2003年 6月
图 2中的 8个居群见表 1。
Above popu lations 1- 8 w ere li sted in Table 1
图 2　基于 RAPD分析数据的香茶菜属
8个居群遗传分化聚类图
Fig. 2 Cluster dendrogram revealing genetic dif f eren-
tiat ion among eight populat ions of Isodon
( Schrad. ex Benth. ) Kudo based on RAPD data
图 3中的 8个居群见表 1。
above populat ions 1- 8 w ere li sted in Table 1
图 3　基于 RAPD数据的香茶菜属
8个居群遗传分化 DCA排序图
Fig. 3　DCA ordination of genetic diff erentiat ion
among eight populat ions of Iosdon ( Schrad.
ex Benth. ) Kudo based on RAPD data
用 ,该方法的目的在于将对象间的相似关系应用二
维、三维图加以表达。与主成分分析方法相比 , DCA
排序更适用于非线性数据。 其次 , DCA的特点在于
应用连续的观点反映对象的差异。事实上 ,居群间的
遗传分化并非明显地间断 ,特别是这种分化与地理
梯度连续在一起时 ,群体的差异多数表现出连续性 ,
而传统的聚类分析以间断的形式表现出居群间的差
异 ,这并不完全符合客观实际。 从研究结果分析 ,采
用排序也能够较客观地反映出居群间的遗传分化 ,
相信这一方法会在药用植物遗传分化的研究中将被
广泛地应用。
RAPD分析结果还表明 ,不同产地的香茶菜属
居群存在明显的遗传分化 ,当结合系数在 20时 , 8
个居群可分成 3类: Ⅰ { 4, 5, 6, 7, 8}、Ⅱ { 1, 2}和Ⅲ
{ 3} ,正好与传统的分类结果相吻合 ,分别属于香茶
菜、大萼香茶菜和显脉香茶菜。从聚类分析的结果可
以估计香茶菜、大萼香茶菜和显脉香茶菜 3个种之
间的亲缘关系。大萼香茶菜与香茶菜之间的距离要
比显脉香茶菜到香茶菜的距离小。从植物体的叶形、
根状茎特点等方面 ,大萼香茶菜与香茶菜更为接近 ,
但在传统的分类上 ,香茶菜与显脉香茶菜属于香茶
菜组 ( Sect. Amethystoides ) ,而大萼香茶菜属于皱
叶香茶菜组 ( Sect. Rabdosia )。 而本研究的 RAPD
结果表明 ,大萼香茶菜与香茶菜在遗传上更为相近。
关于这 3个种的亲缘关系 ,需要作更深入的研究。
香茶菜的 5个居群间存在一定的遗传分化。 聚
类图上 4, 5, 6, 7, 8居群中 ,其中 4号居群和 5号居
群分别采自金华的北山和南山 ,地理上最近 ,气候基
本一致 ,这两个居群间的差异最小。 6, 7, 8号居群采
自台州三门、温州雁荡山和丽水白云山 ,地理位置相
对较远 ,这 3个居群在遗传上的距离也大一些。在聚
类图上 ,香茶菜 5个居群的结合系数大于 15,而 1, 2
两个金华北山和临安西天目山的大萼香茶菜居群结
合系数在 10左右。 由此可见 ,香茶菜在居群水平上
的遗传分化程度要比大萼香茶菜大一些 ,香茶菜在
植物体形态、二萜类含量上的差异 ,很有可能具有遗
传学基础 ,特别是台州三门产香茶菜与其他地区的
香茶菜居群遗传上有较大的差异 ,将来的工作将进
一步了解台州三门产香茶菜居群的形态特点和二萜
类含量情况。
References:
[1 ]　 Fang Y Y. Flora of Zhejian g (浙江植物志 ) [M ] . Tomus 5,
Tomus 6. Hang zhou: Zh ejiang Science and Tech nology Pub-
lis hing House, 1989.
[2 ]　 Sun H D, XU Y L, Jiang B. Di terpenoides f rom Isodon
species (香茶菜属植物二萜化合物 ) [M ]. Beijing: Science
Press , 2001.
[3 ]　 Gui M Y, Jin Y R, Wang B Z. Studies on ch emical cons-
ti tuen ts of Rabdosia japonica v ar. g laucocalyx [ J] . Chin
Pharm J (中国药学杂志 ) , 1999, 34( 8): 516-518.
[4 ]　 Zhou Y P, Ge S, Wang X D. The Molecula r Marker among
Systemat ic and Evolut ionary Botany (系统与进化植物学中的
分子标记 ) [M ] . Beijing: Science Press , 2001.
[5 ]　 Shi S H, Tang S Q, Chen Y Q, et al . Ph ytog enetic relation-
ships am ong elev en yellow-flow ered Camel l ia species based
on random amplif ied polymorphic DN A [ J] . Acta Ph ytota x -
ono S in (植物分类学报 ) , 1998, 36( 4): 317-322.
[6 ]　 Chen L J, Ch en Y Q, Qu L H, et al . RAPD analysis on Chi-
n ese medicine Xih uangcao and i ts related species [ J ]. Acta J
S un Yat-Sen Univ— Nat Sci (中山大学学报· 自然科学版 ) ,
1999, 38( 1): 102-106.
[7 ]　 Wang Z Y, Ch en D C, Ch en Z L, et al . Variat ion of Rab-
dosia eriocalyx and i ts ecological chemis t ry [ J] . Acta Bot Sin
(植物学报 ) , 1998, 30( 5): 528-533.
[8 ]　 Feng Y X, Song W Z, Chen H. Leaf SEM observation and
id ent ifi cation of tw elve Rabdosia species [ J] . Chin Pharm J
(中国药学杂志 ) , 1991, 26( 3): 147-151.
[9 ]　 Li H W . Tax bnomic review of Isodon ( Labiatae ) [ J] . J
Arnold Arboretum , 1998, 69: 289-400.
[10 ]　 Chen Y J, X U M J, GU W. Quan ti tativ e determinat ion of
di terpenoids of radical in Rabdosia ameth ystoides f rom v arious
areas [ J ]. Lish izhen Med Mater Med Res (时珍国医国药 ) ,
2000, 11( 4): 294.
·556· 中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　第 34卷第 6期 2003年 6月