全 文 ：丹参脱病毒及组培快繁技术研究
温春秀1 ,谢晓亮1 ,吴志明1,田　伟1,方　阵2

( 1. 河北省农林科学院 药用植物研究中心, 河北 石家庄　050051; 2. 三九医药股份有限公司,广东 深圳　518029)
　　丹参S alv ia mi ltiorrhiz a Bge. 为唇形科鼠尾草
属多年生草本药用植物,为常用大宗中药材,主治心
血管系统疾病, 具有活血祛瘀、消肿止痛、养血安神
的功能[ 1]。近年来研究表明,丹参可有效地抑制体外
肿瘤细胞的增殖, 能高效拮抗乙肝病毒核心抗原
( HBeAg ) , 有较好的抗艾滋病毒( HIV)作用[ 2]。一系
列对重大疾病有疗效的丹参新药的研制开发,致使
丹参用量不断增加,种植面积不断扩大,已成为国际
市场重要的药材之一。前期研究发现大田种植丹参,
普遍感染黄瓜花叶病毒[ 3] , 该病田间发病率高, 有些
田块高达 60%以上,引起植株退化, 表现为卷叶、皱
缩、黄化、脉间失绿、矮化等典型症状,感病植株根系
变小,严重影响了丹参的产量和品质,为此开展了丹
参脱病毒技术研究。
1　材料
YS—13000 超净工作台(上海苏净集团安泰空
气技术有限公司) , HWY200恒温摇床(上海智诚分
析仪器公司) , ZRX—258D光照培养箱(杭州钱江仪
器设备有限公司) , LDZX—40BI 自动消毒锅(上海
申安医疗器械厂) , 3KW18 高速冷冻离心机(德国
Sigma 公司) , XT B—1体视显微镜和 MB-Ⅲ酶联免
疫仪为北京新技术所产品。
　　MS基本培养基中化学试剂和植物激素 6-BA、
IBA、IA A、NAA 以及琼脂、蔗糖等购自华美生物工
程有限公司, 均为分析纯。
　　丹参外植体采集于河北省农业科学院药用植物
研究中心种质资源圃。狭叶丹参、大叶丹参、皱叶丹
参、圆叶丹参为本中心进行丹参资源收集、评价研究
中筛选出的性状相对稳定的栽培类型。这些类型主
要是根据叶片形态初步划分确定的。
2　方法
2. 1　接种诱导芽体再生:用常规的方法接种丹参根
段于不定芽诱导培养基上, 诱导不定芽产生,获得不
同种质类型的丹参组培无性系。
2. 2　热处理、切取茎尖:将丹参试管瓶苗放置于光
照培养箱中,在温度为 37～38 ℃、湿度 80%、光强
3 000～4 000 lx ,光照时间 12 h/ d 的条件下, 恒温
培养 38 d, 然后取出瓶苗用双目体视显微镜在无菌
条件下切取 0. 2～0. 4 mm 茎尖, 接种于不定芽培养
基 1/ 3 MS+ BA 1. 0 mg / L+ IBA 0. 02 mg / L ,培养
温度( 25±1) ℃,光强2 000～3 000 lx ,光照时间 12
h/ d,得到待检测的丹参小植株。
2. 3　病毒检测: 采用双抗夹心-酶链免疫吸附测定
法( DAS-ELISA ) ,利用 CMV 抗血清对脱毒处理的
待检小植株进行检测,检测结果在酶链免疫仪上读
数确定。
2. 4　培养条件: 以 MS 为培养基, 附加不同浓度的
生长素和细胞分裂素,琼脂0. 7%, pH5. 8,其中分化
培养基(表 1)含 3%蔗糖, 生根培养基(表 2)含 2%
的蔗糖。培养基分装后在121℃下灭菌 15 m in。培
养温度( 25±1) ℃,光强 2 000～3 000 lx ,光照时间
12 h/ d。
表 1　分化培养基
Table 1　Culture media for diff erentiation
培养基号 基本培养基 6-BA/ ( mg·L - 1) IBA/ ( mg·L- 1)
(1) MS 　0 0. 2
(2) MS 0. 5 0. 2
(3) MS 1. 0 0. 2
(4) MS 1. 5 0. 2
(5) MS 2. 0 0. 2
(6) MS 2. 5 0. 2
表 2　生根培养基
Table 2　Culture media for root-f orming
培养基
编号
基本
培养基
IBA
/ ( mg·L- 1)
IAA
/ ( mg·L- 1)
NAA
/ ( mg·L- 1)
( 7) 1/ 2 MS 0　
( 8) 1/ 2 MS 0. 2
( 9) 1/ 2 MS 0. 5
( 10) 1/ 2 MS 1. 0
( 11) 1/ 2 MS 0. 2
( 12) 1/ 2 MS 0. 5
( 13) 1/ 2 MS 1. 0
( 14) 1/ 2 MS 0. 2
( 15) 1/ 2 MS 0. 5
( 16) 1/ 2 MS 1. 0
·1057·中草药　Chinese T raditional and Herbal D rug s　第 35 卷第 9 期 2004年 9月

收稿日期: 2003-12-19基金项目:河北省科技攻关项目( 03220111)作者简介:温春秀( 1965—) ,女,河北藁城人,副研究员,主要从事药用植物生物技术及栽培、育种研究。T el : ( 0311) 7652129
3　结果与分析
3. 1　热处理与茎尖培养脱病毒
3. 1. 1　热处理:不同丹参种质类型对热处理温度的
反应有较大差别, 处理的 4个丹参类型中, 狭叶丹参
耐热性最强, 大叶丹参较强, 皱叶丹参耐热性一般,
圆叶丹参最差(表 3)。
表 3　热处理对不同丹参品系的影响
Table 3　Ef fect of high temperature treatment
on diff erent Danshen varieties
丹参品系 处理一周后 处理两周后 处理 30 d后
狭叶丹参 生长正常 叶缘干枯,生长正常 少数顶尖死亡
大叶丹参 生长正常 基部叶片部分干枯,生长正常 1/ 3 顶尖死亡
皱叶丹参 生长正常 基部叶缘干枯,生长基本正常 2/ 3 部分顶尖死亡
圆叶丹参
　
基部叶片死亡,
　顶尖叶开始干枯
茎叶全部干枯
　
20 d后死亡
　
3. 1. 2　茎尖培养: 在超净工作台上,通过双目实体
显微镜对热处理后丹参切取 0. 2～0. 4 mm 茎尖,置
于不定芽诱导培养基上培养 1 个月,然后检查成活
率(表 4)。本试验通过茎尖培养获得了 3种丹参待
检株系 114个。
表 4　切取 0. 2～0. 4 mm的茎尖培养成活率
Table 4　Living stem-tip ratio in 0. 2—0. 4 mm meristem
丹参
品系
热处理
株数 存活数
/株
存活率
/ %
切取茎尖
成活数
/株
成活率
/ %
狭叶丹参 110 72 65. 5 60 83. 3
大叶丹参 110 55 50. 0 34 61. 8
皱叶丹参 100 43 43. 0 20 46. 5
3. 1. 3　CMV 病毒检测:利用 CMV 抗血清,对待检
脱毒处理植株进行了 DAS-ELISA 检测(表 5)。可
见,采用茎尖培养与热处理相结合的方法, 3个不同
丹参类型均检测出了脱除 CMV 病毒的株系。但不
同类型的丹参,病毒脱除率有较大差异(表 6) , 其中
皱叶丹参脱毒率高达 80%, 大叶丹参脱毒率次之,
为 40%,狭叶丹参最低, 为 20%。
3. 2　丹参脱病毒苗组培快繁技术体系建立
3. 2. 1　最佳分化培养基筛选:在( 1)号培养基上丹
参苗增殖系数为 0;随着 BA 浓度的增大,芽增殖系
数也增高,在( 4)号培养基上芽的增殖效果最好,芽
增殖系数为 8. 8;随着 BA 浓度的再增大, 增殖率反
而降低,而且叶片增厚,试管苗玻璃化严重。本试验
筛选出丹参最适宜的增殖培养基为( 4)号培养基。结
果见表 7。
3. 2. 2　丹参生根培养基配方筛选结果:丹参瓶苗在
不同生根培养基上接种一周后开始有根产生, 2周
后部分根长达1cm以上, ( 10)、( 11)号培养基上的
表 5　脱病毒丹参样品检测结果
Table 5　Detection of CMV from virus-free Danshen
狭叶丹参 检测结果 大叶丹参 检测结果 皱叶丹参 检验结果
XY02 + + DY01 - ZY101 + +
XY03 - DY11 - ZY103 -
XY06 + - DY16 + ZY108 -
XY09 + + DY27 + ZY111 -
XY12 + DY35 + ZY117 -
　　XY 代表狭叶品种, DY 代表大叶丹参, ZY 代表皱叶丹参, + +
表示阳性,有 CM V 病毒; + 表示弱阳性, CMV 不能明确判定; - 表
示阴性,无 CM V 病毒。以上为国家质检总局抗血清检测结果
　　 XY are sl im-leaf speies , DY ar e big-leaf species, ZY are
w rin kle-leaf species; + + indicates s amp les w hich have CMV; +
in dicates samples wh ich have CMV or not and cannot def ined; -
in dicates samples w hich h ave no CMV . Resul ts of CMV detect ion
w ere obtain ed by In st itute of Animal and Plant Quarant ine
表 6　不同丹参品系病毒脱除率
Table 6　Virus-f ree ratio of diff erent Danshen varieties
丹参品系 检测株数/个 无病毒数/个 脱除病毒率/ %
皱叶丹参 20 16 80
大叶丹参 20 8 40
狭叶丹参 20 4 20
表 7　不同培养基上丛生芽诱导能力比较
Table 7　Comparison of inducing ability of cluster
seedling on dif f erent culture media
培养基 接种数/个 增殖芽数/个 芽增殖系数
( 1) 30 　0 　0
( 2) 30 138 4. 6
( 3) 30 189 6. 3
( 4) 30 264 8. 8
( 5) 30 195 6. 5
( 6) 30 192 6. 4
根粗壮,根数多, 有毛根, 根系生长最好; ( 8)、( 9)号
培养基上二级根少, 根细弱, ( 12)号培养基上的根粗
壮,但根数少。( 13)号培养基上的二级根少; ( 14)号
培养基上的根数少, 毛根较多, ( 15)号培养基上的根
粗短,根少, ( 16)号培养基上的产生大量愈伤组织,
根粗短; ( 7)号对照上根特细弱,移栽不容易成活。25
d 后生根情况统计见表 8。可以看出生根培养基上生
根率都达到了 95%以上, 只有 ( 16) 号培养基为
90% ,说明丹参组培苗生根较容易。综合平均根数和
平均根长两项指标,丹参生根培养基( 11)号培养基
最为适宜。
3. 2. 3　炼苗移栽: 当试管苗在生根培养基上生长
20 d, 苗高达 3 cm 有 3条以上明显粗壮根时, 将试
管苗在强光下闭瓶口练苗 5～6 d, 再洗净根部培养
基,栽植于 0. 1%高锰酸钾消过毒的蛭石中,浇足水
扣上小拱棚地膜保温、保湿,温度保持在 20～30℃,
湿度保持在95%以上。5d后揭去地膜, 每3～5d喷
·1058· 中草药　Chinese T raditional and Herbal D rug s　第 35 卷第 9 期 2004年 9月
表 8　不同培养基激素浓度对根形成的影响
Table 8　Ef fect of culture media in diff erent hormone
concentration on root forming
培养基 接种数
/株 生根数/株
株平均根
数/条
生根率
/ %
平均根长
/ cm
( 7) 30 30 3. 17 98 3. 88
( 8) 30 30 2. 94 100 4. 86
( 9) 30 30 3. 68 100 3. 28
( 10) 30 30 3. 49 100 3. 86
( 11) 30 30 3. 43 100 4. 09
( 12) 30 30 2. 88 100 5. 06
( 13) 30 29 2. 23 97 4. 18
( 14) 30 30 2. 30 100 5. 25
( 15) 30 30 3. 55 100 2. 85
( 16) 30 26 2. 17 90 3. 06
一次杀菌剂和营养液, 一个月后小苗则长出白色新
根,然后控制水分,每 10～15天左右喷水一次, 增加
晒光时间, 20～30 d 后可直接大田定植, 成活率基
本能达到 85%。
3. 2. 4　脱毒苗快繁技术体系:在温度 25～28℃,光
照 2 000～3 000 lx 培养条件下,丹参根段或茎尖诱
导不定芽培最佳培养基为 1/ 3 M S + BA 1. 0
mg / L+ IBA 0. 02 mg / L+ 蔗糖 30 g / L , pH 5. 8;丛
生芽分化最适宜培养基为 MS+ BA 1. 5 mg/ L +
IBA 0. 2 mg / L+ 蔗糖 30 g / L , pH 5. 8;生根最适宜
培养基为 1/ 2 M S+ IAA 1. 0 mg / L+ 蔗糖 20 g / L
pH 5. 8。
　　芽体在分化培养基上 25～30 d继代一次, 芽增
殖系数基本保持在 8. 0以上, 瓶苗接种到生根培养
基上一般 20 d 即可全部生根, 30 d开始练苗。练苗
温度 20～30 ℃,湿度 90%以上,蛭石基质炼苗 30 d
左右,控制水分,使根老化。炼苗期间真菌感染, 是造
成组培苗大量死亡的重要原因, 必须做到基质经
0. 1%高锰酸钾彻底消毒,洗净苗根部的培养基, 每
3～5天喷施多菌灵、甲基托布津等杀菌剂一次。按
上述优化的分化、生根培养基配方和培养条件,可进
行丹参无毒苗工厂化规模繁育。
4　讨论
4. 1　丹参不同种质类型在耐热性方面有较大差异,
狭叶丹参> 大叶丹参> 皱叶丹参> 圆叶丹参, 脱病
毒率与耐热性成反比,圆叶丹参在热处理后两周植
株基本死亡,未获得脱病毒植株,需进行变温或其他
方法脱除病毒研究。
4. 2　丹参不定芽诱导同时,对丹参根茎进行了愈伤
诱导, 获得了大量愈伤组织, 经愈伤调控和多次继
代,获得了泥状、颗粒状、菜花状、棕红色等多种不同
状态类型的丹参愈伤组织, 部分类型愈伤容易再生
出小植株, 这一特性有利于愈伤法脱病毒或培育新
品系等研究。
4. 3　脱毒丹参苗大田栽植后,前期生长缓慢, 栽植
半年后观察,与根茎栽植苗比较脱毒苗根系均匀、分
枝增多、商品根多,需进一步研究其生长势、产量、药
用成分含量等。
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HPLC法测定山 中球松素的含量
潘永峰1 ,卢玉斌2 ,张继敏2,肖万宏2,邬芙蓉2

( 1. 河南省信阳市药品检验所, 河南 信阳　464000; 2. 河南羚锐制药股份有限公司, 河南 新县　465550)
　　樟科( Lauraceae)山胡椒属( L indera Thunb. )
植物山 L . r ef l exa Hemsl. 为灌木或小乔木, 已收
载于《河南省中药材标准》( 1993年版第 2册)。性
温,行气止痛,止血消肿,主要用于胃疼。主要含黄酮
类化合物和生物碱等, 其中含量较高的是二氢黄酮
类化合物球松素 ( pinostr obin)。因此本实验采用
HPLC法测定了其中球松素的含量。
1　仪器、试剂与药品
日本岛津 LC—10A 高效液相色谱仪, KA—
500 型医用超声清洗器(昆山仪器有限公司) , 甲醇
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收稿日期: 2003-12-02作者简介:潘永峰,男,河南省信阳市人,副主任中药师,主要从事药品检验工作。Tel: ( 0376) 6562739