全 文 ：正品和伪品大黄的 RAPD指纹图谱鉴定研究
杨美华 1, 2 ,张大明 1 ,刘健全 3 ,郑俊华 2 ,范国强 4
( 1. 中国科学院植物研究所 系统与进化植物学开放实验室 ,北京　 100093; 2. 北京大学药学院 ,北京　 100083;　 3. 中国科
学院西北高原生物研究所 ,青海 西宁　 810001; 4. 北京市中药科学研究所 ,北京　 100011)
摘　要: 目的　用 RAPD方法对正品和伪品大黄进行指纹图谱的研究 ,为正品和伪品大黄的基原鉴定提供分子依
据。 方法　对 RAPD反应的实验体系进行了优化 ,并采用个体筛选的方法筛选 121个引物 ,采用 BSA的方法筛选
了 64个引物。结果　分别得到了 2个具有正品大黄的特征性条带的引物。结论　该方法可靠、准确、快速、重现性
好 ,达到了在分子水平上鉴定正品和伪品大黄基原的目的。 此外 ,该实验亦表明 BSA的方法筛选种的特征性条带
的引物的效率比个体筛选引物的效率高。
关键词: 正品大黄 ; RAPD;指纹图谱
中图分类号: R282. 710. 3　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2003) 06 0557 04
Fingerprint research on authentication of official and unofficial plants
of Rheum L. by RAPD
YANG Mei-hua
1, 2 , ZHANG Da-ming
1 , LIU Jian-quan
3 , ZHENG Jun-hua
2 , FAN Guo-qiang
4
( 1. Labo rato ry of Sy stematic& Evolutiona ry Bo tany, Institute o f Bo tany, CAS, Beijing 100093, China; 2. Sch oo l
of Pha rmaceutical Sciences, Beijing Unive rsity , Beijing 100083, China; 3. No r th west Pla teau Institute of Bio lo gy ,
CAS, Xining 810001, China; 4. Beijing Institute of Chinese Materia M edica, Beijing 100011, China )
Abstract: Object　 In o rder to identi fy the resources o f official and unof ficial plants in Rheum L. at
molecular lev el, a random ampli fied po lymo rphic DN A ( RAPD) analysis w as perfo rmed. Methods　 The
amplification pro gram o f polymerase chain reaction ( PCR) w as optimized. Arbi trary decamer primers of
121 based on the indiv idual selecting method, and 64 based on the BSA method w ere screened. Results　
Four primers among all screened primers w ere found to be useful to amplify specific st rips to the of ficial
plants o f Rheum L. Conclusion　 This method is reliable, accurate, quick and reproducible fo r authenticat-
ing the o fficial and unof ficial plants of Rheum L. at mo lecular lev el. Mo reover, the experiment results in-
dicate tha t i t i s mo re effectiv e to screen the primers using BSA method than using individual selecting
method.
Key words: o fficial plants o f Rheum L. ; RAPD; fingerprint
　　 RAPD是用任意序列的 10碱基寡核苷酸片段
作为单引物在全基因组上扫描 ,因此 ,不需要预先知
道基因组的序列信息 ,且在理论上可提供的信息量是
无限的 ,并具有快速、高效等特点 ,目前广泛应用于生
药鉴定 [1, 2 ] ,动、植物遗传育种 ,基因诊断 ,居群遗传
学 ,生物系统学与进化研究 [3 ]。但有关大黄的 RAPD
分子标记的报道仅见于刘叔倩等 [4, 5 ]对 5种大黄的初
步研究。正品与伪品大黄的生药鉴定主要依赖于传统
的性状、显微、化学和理化鉴定。 然而 ,这些手段对于
正品与伪品大黄的种的准确鉴定仍显不足。如鉴定正
品大黄的唯一特征“星点” [6 ]在伪品中也存在 [7 ] ;伪品
中的独有的化学成分土大黄苷 [ 8]在正品中亦以较低
的浓度存在 [9, 10 ]。能否找到一种更为快速、准确、可靠
的正品与伪品大黄的种的鉴定方法? 本实验采用
RAPD分子标记技术对此进行了研究。
1　材料和方法
·557·中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　第 34卷第 6期 2003年 6月
收稿日期: 2002-12-09基金项目:国家重点基础研究发展计划项目 ( G2000046804)作者简介:杨美华 ( 1964- ) ,女 ,江西省南昌市人 , 1985年 7月毕业于江西中医学院药学系中药专业 ,获学士学位 , 1985年 8月至 1998年 8月在江西省药品检验所从事药品检验工作 ,并于 1998年 7月评为副主任药师 , 2001年 7月毕业于北京大学药学院 ,获博士学位 ,研究方向为生药分子鉴定 ,生药分析以及新药研究开发 ,曾主持或参与中国药典、部颁标准 ,省级标准和新药研究开发项目 12项 ,在国内外发表论文近 20篇。
Tel: ( 010) 66932284 ( O)　 ( 010) 88271323 ( H)　 Fax: ( 010) 68158311　 E-mail: yang meih ua15@ ho tmail. com
1. 1　仪器与试剂: Rapidcycler 1818型毛细管气浴
式 PCR仪 (美国 Idaho Tech. 公司 ) ; Sigma 2K 15
离心机 ; Sigma 1-13离心机 ; DYY-Ⅲ 2型稳流稳压
电泳仪 (北京六一仪器厂 ) ;理光相机。
Taq DN A聚合酶 (中国农业大学 ) ; dN TPs
( Promega 公司 ) ;引物 ( Operon Technologies公
司 ) ; 1 mo l /L MgCl2 ( Sigma 公司 ) ; Ficoll-400
( Pharmacia公司 ) ; BSA ( Sigma公司 ) ; Tart razine
( Sigma公司 ) ; Aga ro se ( Promega公司 ) ; EB (瑞
士 Fluka Chemika公司 )。
1. 2　材料: 除药用大黄 Rheum of f icinale Bai ll. 为
中国医学科学院药用植物研究所马小军博士采集
外 ,大部分材料为作者在野外采集的硅胶干燥的叶
片 (表 1) ,并由中国科学院植物研究所李安仁研究
员、北京大学陈虎彪教授鉴定。凭证标本存放于北京
大学药学院生物技术研究室。
表 1　实验材料的来源及采集地
Table 1　 Source and locality of experimental materials of Rheum L.
来源 采集地 样品个体数 采集时间 标本凭证号
唐古特大黄 Rheum tangu ticum 青海玛沁 5 1999-09-02 Q99155
掌叶大黄 R. palma tum 青海互助 5 1999-08-11 Q99134
药用大黄 R .of f icinale 重庆南川 2 1999-10-13 M991013
小大黄 R. pumilum 青海玉树 4 1999-08-28 Q99145
歧穗大黄 R. p rzewalskii 青海互助 4 1999-08-12 Q99136
河套大黄 R. hotaoense 青海乐都 4 1999-08-08 Q99130
网脉大黄 R . reticulatum 青海称多 4 1999-08-25 Q99141
窄叶大黄 R . sublanceolatum 青海称多 4 1999-08-26 Q99142
丽江大黄 R. li kiangense 青海玉树 4 1999-08-29 Q99147
天山大黄 R . witt rockii 新疆伊宁 2 1999-07-06 Y99101
矮大黄 R. nanum 新疆巴里坤 4 1999-07-28 Y99120
密序大黄 R. compactum 新疆巴里坤 4 1999-08-01 X99006
波叶大黄 R .undula tum 药植所药园 1 1999-06-15 Y990615
北京大学药园 1 1999-09-22 Y990922
1. 3　方法
1. 3. 1　 DNA模板的提取和浓度的测定: 称取约
0. 05 g的硅胶干燥的大黄叶片 ,参考文献 [11 ]并经适
当修改提得 DNA。取 3μL DNA样品和 2μL点样缓
冲液 ( 0. 25%溴酚蓝 , 40%蔗糖 )混匀 ,在 0. 8%琼脂
糖凝胶上进行电泳。以λDNA作对照 , 70 V电压下电
泳 1 h,检测 DNA片段的长度并估测 DNA的浓度。
1. 3. 2　 PCR反应:参照文献 [ 12～ 14]确定了 PCR的反
应体系和反应程序。为避免污染造成的误差 ,每个引
物均设阴性对照 ,即以灭菌双蒸水代替模板 ,其他条
件均同有模板的 PCR。 反应结束后 , PCR产物在 4
℃条件下保存至电泳。
1. 3. 3　 PCR扩增产物的检测:反应结束后 ,截去毛
细管两端的封头 ,直接在含有 0. 5μg /mL EB的
1. 5% Aga ro se胶上点样 ,用 100 bp DN A Ladder
作相对分子质量标准 , 1× TBE为电泳缓冲液 , 80 V
恒压电泳 4～ 5 h。电泳结果在透射式紫外灯上观察
并用 FOTODYN E型紫外自动成像仪照相。
1. 4　实验体系的优化: RAPD引物是 10个碱基或
更短的寡核苷酸片段 ,在退火温度下引物与模板的
互补结合不很稳定 ,这种随机扩增容易受到诸多因
素的影响:模板浓度与纯度、缓冲系统的种类与 pH、
聚合酶的种类与用量、扩增程序与循环周期等都会
影响扩增式样 ,其中尤为重要的是所用 PCR的型
号 [3 ]。因此 ,研究工作参考本实验室的 RAPD流程
(反应程序与反应成分 ) [12～ 14 ] ,均在同一型号的 PCR
仪上进行 ,采用同一批的药品 ,固定缓冲系统的种类
与 pH值、聚合酶的种类与用量 ,仅从模板的纯度和
浓度、退火温度等方面对大黄毛细管 PCR进行了优
化 ,最后将各种优化后的条件固定下来 ,结果得到了
很好的重复。
1. 4. 1　模板的纯度和浓度: 大黄中含有较多的次生
代谢产物 ,在 DNA的提取过程中应尽可能除去。 本
实验参考谢中稳 [11 ]的 CT AB法 ,并经修改后 ,可有效
地从大黄中提取 DNA。经电泳检测 ,所提 DNA的片
段大小约为 50 kb,确保了 RAPD的可靠性扩增。
一般认为在每个 PCR反应中 , 5～ 500 ng ( 100
倍 )的 DNA能提供好的结果 ,推荐 DNA模板浓度
为 5～ 50 ng /50μL为最佳 [3 ]。本实验比较了 4个浓
度梯度的 DNA模板对扩增的影响。结果表明 ,反应
·558· 中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　第 34卷第 6期 2003年 6月
体系中模板的量在 6. 6～ 50 ng,扩增的主要谱带基
本一致 ,随着模板浓度的升高 ,扩增的主要谱带基本
一致 ,而一些较弱的谱带则更弱或消失。为了降低抑
制 Tag DN A聚合酶活性的因子的影响 ,每个反应
体系中 ,模板的量调整在 10 ng左右。
1. 4. 2　退火温度的选择:变性温度和延伸温度一般
分别为 94℃和 72℃ ,而退火温度一般都在 40℃以
下 , 35℃～ 37℃合适 [3 ]。本实验采用了实验方法中
所述的 PCR扩增程序 ,仅改变退火温度 ,比较了 35
℃、 36℃、 37℃、 39℃退火温度的扩增产物。从实验
结果可知 ,较低的退火温度 ( 35℃ )导致 PCR产物
的弥散 ,降低了扩增产物的专一性 ;较高的退火温度
( 39℃ )虽然增强了扩增产物的专一性 ,降低了背景
的弥散 ,但引物的主要谱带强度减弱 ,甚至有的谱带
消失。 故采用 37℃为反应程序的退火温度。
1. 4. 3　引物的选择:针对本项研究目的 ,选择不仅能
扩增出清晰的、重复性好的条带 ,且能扩增出正品大
黄的种的特征性条带的引物。 为此 ,采用个体筛选的
方法筛选了 121个引物 ,采用 BSA的方法 [15 ] (即:分
别等量吸取正品大黄的 3个种的 DNA混合均匀作
为一个模板 ,伪品大黄每 3～ 4个种分别等量吸取
DNA混合均匀作为模板 )筛选了 64个引物 ,分别得
到了 2个具有正品大黄的特征性条带的引物 A8 ,
A10 , AG12 , Z11 (图 1,采用 BSA的方法筛选引物的
RAPD实验结果 )。此实验说明 BSA的方法筛选种的
特征性条带的引物的效率比个体筛选引物的效率高。
模板: 1, 4, 7, 10, 13, 16, 19, 22为正品大黄的混合模板 ,其余均
为伪品大黄的混合模板。
引物: 1～ 3, A8; 4～ 6, A10; 7～ 9, F7; 10～ 12, H7; 13～ 15, I5; 16～
18, Q5; 19～ 21, Q10; 22～ 24, R7
Templates: 1, 4, 7, 10, 13, 16, 19 and 22 are mixed
templates of of f icial plants of Rheum L.
Primers: 1- 3, A8; 4- 6, A10; 7— 9, F7; 10- 12, H7; 13-
15, I5; 16- 18, Q5; 19- 21, Q10; 22- 24, R7
图 1　用 BSA的方法筛选不同引物的 RAPD产物 (箭头
表示引物 A8扩增的正品大黄的特征性条带 )
Fig. 1　RAPD products of diff erent primers screened by
BSA (Arrow indicat ing specif ic band of of f icial
plants of Rheum L. amplif ied by primer A8 )
2　结果和讨论
为了证实所筛选的 4个引物 ( A8、 A10、 AG12、
Z11 )扩增的特征性是否为正品大黄所专有 ,将这些
引物分别应用于正品与伪品大黄的各个种及其个体
间的扩增 ,结果证实了上述的扩增结果。此外 ,几乎
每个种都有其特有的 DNA指纹图谱 ,扩增片段通
常在 0. 3～ 2. 0 kb,不仅能区别正品和伪品大黄 ,而
且能相互区别正品大黄的 3个种 ,从而在分子水平
上达到了鉴定正品与非正品大黄的目的 (图 2～ 5)。
1-唐古特大黄　 2-掌叶大黄　 3-药用大黄　 4-小大黄　 5-歧穗
大黄　 6-河套大黄　 7-网脉大黄　 8-窄叶大黄　 9-丽江大黄　
10-天山大黄　 11-矮大黄　 12-密序大黄　 13-波叶大黄　 M -
DN A梯度相对分子质量标准
1-R . tang uticum　 2-R. palmatum　 3-R. of f icinale　 4-R.
pum ilum　 5-R . przewalski i　 6-R. hotaoense　 7-R . ret icula tum
8-R . sublan ceolatum　 9-R . l ikiangence　 10-R. wit trockii　 11-
R . nanum　 12-R . compactum　 13-R . undulatum　M -DN A
Ladder ( Dingg uo Inc. China)
图 2　引物 A8 ( 5’ GTGACGTAGG3’ )在正品与伪品各个
种间的扩增结果 (箭头表示正品大黄所特有的条带 )
Fig. 2　 RAPD f ingerprints of of f icial and unof ficial pl-
ants of Rheum L. generated with primer A8
( Arrow indicating specif ic band of off ic ial
plants of R. tanguticum amplif ied by primer A8 )
1～ 13、 M同图 2注
Notes 1— 13 and M are seen in Fig. 2
图 3　引物 A10 ( 5’ GTGATCGCAG3’ )在正品与伪品各个
种间的扩增结果 (箭头表示正品大黄所特有的条带 )
Fig. 3　 RAPD f ingerprint s of off icial and unoff ic ial
plants of Rheum L. ( Arrow indicating specif ic
bands of of f icial plants of R. tangut icum ,
R . palmatum and R. of f icinale amplif ied
by primer A10 )
　　从上述实验结果可看出 ,在图 2中约 650 bp为
唐古特大黄的特有条带 ;在图 3中约 750 bp为唐古
特大黄、掌叶大黄、药用大黄的共有条带 ,在图 4中
约 350 bp为药用大黄的特有条带 ,在图 5中约 800
bp、 670 bp为唐古特大黄、掌叶大黄的共有条带。
对上述正品大黄的特征性条带 ,可考虑进一步将
·559·中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　第 34卷第 6期 2003年 6月
1～ 5-唐古特大黄　 6～ 10-掌叶大黄　 11～ 12-药用大黄　 13～
16-小大黄　 17～ 20-歧穗大黄　 21～ 24-河套大黄　 M-DN A梯
度相对分子质量标准
1- 5-R. tan guticum　 6- 10-R . palma tum　 11- 12-R. of f ici-
nale　 13- 16-R . pumi lum　 17- 20-R. przewalski i　 21- 24-
R. hotaoense　 M-DN A Ladd er ( Dingg uo Inc. China)
图 4　引物 AG12 ( 5’ CTCCCAGGGT3’ )在正品与伪品各
个体间的扩增结果 (部分显示 ) (箭头表示正品大
黄所特有的条带 )
Fig. 4　 RAPD fingerprints of of ficial and unof f icial
plants of Rheum L. generated with primer AG12
( partly shown ) (Arrow indicat ing specific band
of off ic ial plant of R . of f icinale amplif ied by
primer AG12 )
1～ 13、 M同图 2注
Notes 1— 13 and M are s een in Fig. 2
图 5　引物 Z11 ( 5’ CTCAGTCGCA3’ )在正品与伪品各个
体间的扩增结果 (箭头表示正品大黄所特有的条带 )
Fig. 5　 RAPD fingerprints of of ficial and unof f icial
plants of Rheum L. (Arrow indicat ing specif ic
band of of f icial plants of R. tanguticum andR .
palmatum amplif ied by primer Z11 )
其克隆 ,并进行测序分析。 通过序列分析设计出一对
互补到原来 RAPD片段两端的长引物 ,用这对引物
与原来的模板 DNA进行 PCR扩增 ,这些特征序列
扩增区域 ( SCARs) [16 ]可作为正品大黄种的特征性鉴
定条带。 由于 SCAR标记用了一对互补到专一基因
组位点上的长引物和严格的 PCR条件 ,排除了引物
结合位点之间的竞争 ,因而将得到可靠的重复性好的
条带 ,他们对反应条件不敏感 ,相信这一技术在生药
的快速而准确的鉴定上具有广泛的应用前景。
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