全 文 ：Sm ad7 表达, 阻止 T GF2Β1刺激所致的肝星状细胞
(H SC) 活化及胶原形成。
T GF2Β1是组织修复和肝纤维化的重要细胞因
子, 调控 H SC 的活化、增殖[3 ]。T GF2Β1表达增加, 介
导 H SC 产生细胞外基质 ( ECM ) , 抑制肝细胞
DNA 合成, 导致肝纤维化的产生。抑制型 Sm ad6,
Sm ad7 是细胞中 T ΒR I 型受体丝氨酸ö苏氨酸激酶
的拮抗蛋白, 可阻止 Sm ad2, Sm ad3 磷酸化, 从而阻
断 T GF2Β1的信号转导过程, 在 T GF2Β1信号转导中
构成负反馈调节环路[4 ]。在肝纤维化模型组大鼠肝
内抑制性 Sm ad7 明显减少, 同时具有促纤维化作用
的 Sm ad3 表达增加, 其增加与减少程度与肝内纤维
化多少呈正相关。正常情况下, T GF2Β1可快速诱导
Sm ad7 的表达[5 ] , 但在肝纤维化大鼠中, 由 H SC 转
化的成纤维细胞失去 T GF2Β1诱导下的 Sm ad7 表达
上调敏感性, 而 Sm ad2, Sm ad3 表达增加, 促使肝纤
维化进程。金三莪治疗后的肝纤维化大鼠 T GF2Β1在
肝内表达明显降低, 表达量接近正常组, 显示该药抗
肝纤维化作用与抑制 T GF2Β1过度表达及抑制 H SC
活化有关; 治疗后的大鼠肝内 Sm ad7 表达增加并接
近正常组, 而 Sm ad3 表达减少, 进一步说明该方剂
能抑制 Sm ad3 而明显促进 Sm ad7 的表达, 后者负
反馈调节 T GF2Β1的胞内信号传递, 阻止 H SC 的活
化及信号放大, 发挥抗肝纤维化作用。C 组A öG 比
值升高并与A 组比较差异无显著性, 证明该方剂具
有促进白蛋白合成, 改善肝脏生理功能的作用。HA
由间质细胞合成, 绝大多数存在于组织间隙或结缔
组织中, 与肝纤维化程度符合率最高[6 ]。血中 HA 被
肝窦内皮细胞 (SEC s) 摄取[7 ] , 活化的 SEC s 能分
泌 HA 的受体 CD 44, 通过受体循环通路, 在溶酶体
内降解成乙酸和乳酸。低水平的 CD 44 mRNA 表达
水平与血清持续性高水平的 HA 密切相关, 可提示
SEC s 功能不足。HA 有协同胶原聚合、沉积, 激活
H SC 与肝细胞的作用。本实验中模型组大鼠血清
HA 增高, 而金三莪治疗后大鼠血清 HA 水平降低,
是否与该方剂促进 SEC s 分泌 CD 44, 增强对 HA
结合转化有关, 尚待进一步研究证实。
References:
[ 1 ]　W ang Y Q , Ikeda K, Ikebe T , et a l. Inh ib it ion of hepatic
stellate cell p ro liferation and activation by the sem isyn thetic
analogue of fum agillin TN P2470 in rats [J ]1 H ep a tology ,
2000, 32 (5) : 98029891
[ 2 ]　H epatic F ib ro sis Study Group of Ch inese L iver D iseases A s2
sociation. Consensus on evaluation of the diagno sis and effi2
cacy of hepatic fib ro sis [J ]1 Ch in J H ep a tology (中华肝脏病
杂志) , 2002, 10 (5) : 32723281
[ 3 ]　N ieto N , F riedm an S L , Cederbaum A I1 Stim ulation and
p ro liferation of p rim ary rat hepatic stellate cells by cy2
toch rom e P450 2E12derived reactive oxygen species [J ]1
H ep a tology , 2002, 35 (1) : 622731
[ 4 ]　T ahash i Y, M atsuzak i K, D ateM , et a l. D ifferen tial regu la2
t ion of T GF2beta signal in hepatic stellate cells betw een acu te
and ch ron ic rat liver in ju ry [J ]1 H ep a tology , 2002, 35 (1) :
492611
[ 5 ]　Doo ley S, D elvoux B, Streckert M , et a l. T ransfo rm ing
grow th facto r beta signal transduction in hepatic stellate cells
via Sm ad2ö3 pho spho rylation, a pathw ay that is ab rogated
during in v itro p rogression to m yofib rob lasts. T GF beta sig2
nal transduction during transdifferen tiation of hepatic stellate
cells [J ]1 F EB S L ett, 2001, 502 (122) : 42101
[ 6 ]　Patel K, L ajo ie A , H eaton S, et a l. C lin ical use of hyalu ron2
ic acid as a p redicto r of fib ro sis change in hepatit is C [J ]1 J
Gastroen terol H ep a tol, 2003, 18 (3) : 25322571
[ 7 ]　Saegusa S, Isaji S, Kaw arada Y1 Changes in serum
hyalu ron ic acid levels and exp ression of CD 44 and CD 44 mR2
NA in hepatic sinuso idal endo thelial cells after m ajo r hepatec2
tom y in cirrho tic rats [J ]1W orld J S u rg , 2002, 26 (6) : 6942
6991
川芎嗪和丹参对小鼠L ewis 肺癌生长的抑制作用与抑制血管生成的关系
陈　刚1, 徐晓玉1, 严鹏科2, 廖端芳2Ξ
(11 重庆医科大学中医药学院, 重庆　400050; 21 南华大学 药理教研室, 湖南 衡阳　410016)
摘　要: 目的　观察川芎嗪注射液 (TM P)、丹参注射液对小鼠 L ew is 肺癌生长和转移及肿瘤血管生成的影响。方
法　用 C57BL 小鼠 L ew is 肺癌模型, 分别 ip TM P 50, 100, 200 m gö(kg·d) , 丹参注射液 5, 10, 20 gö(kg·d) , 共
21 d, 检测小鼠L ew is 肺癌移植瘤体积、质量、肺转移灶数、肿瘤微血管密度 (M VD ) 和血管内皮生长因子 (V EGF)
的表达。结果　与模型组相比, TM P 组小鼠L ew is 肺癌移植瘤的体积、质量、肺转移灶数、肿瘤M VD 和V EGF 的
表达均显著降低; 丹参组与模型组比较差异无显著性。结论　TM P 可抑制小鼠 L ew is 肺癌移植瘤的生长和转移,
其作用机制与抑制 V EGF 的表达、抑制血管生成有关。丹参对小鼠 L ew is 肺癌移植瘤的生长和转移无明显影响。
·692· 中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 35 卷第 3 期 2004 年 3 月
Ξ 收稿日期: 2003207215
基金项目: 国家自然科学基金资助项目 (300070915)
作者简介: 陈　刚 (1974—) , 男, 湖南省长沙市人, 重庆医科大学在读博士, 主要从事中药药理研究。T el: (023) 68733591
关键词: 川芎嗪; 丹参; L ew is 肺癌; 微血管密度; 血管内皮生长因子
中图分类号: R 286191　　　文献标识码: A 　　　文章编号: 0253 2670 (2004) 03 0296 04
Rela tion sh ip between effect of tetram ethylpyraz ine and Dan shen on inh ib it ing
L ew is lung carc inoma growth and tum or ang iogenesis
CH EN Gang1, XU X iao2yu1, YAN Peng2ke2, L IAO D uan2fang2
(11Schoo l of Ch inese T radit ionalM edicine, Chongqing U niversity of M edical Sciences, Chongqing 400050,
Ch ina; 2. D epartm ent of Pharm aco logy, N anhua U niversity, H engyang 410016, Ch ina)
Abstract: Object　To invest iga te the effects of tet ram ethylpyrazine (TM P) and D an shen (D S) on the
grow th and m etastasis of L ew is lung carcinom a and tumo r angiogenesis. M ethods　C 57BL m ice w ith L ew is
lung carcinom a w ere u sed in th is study, w h ich w ere in jected respect ively w ith TM P in ject ion 50, 100, and
200 m gö(kg·d) and D S in ject ion 5, 10, and 20 gö(kg·d) , ip , fo r 21 days. T hen the vo lum e, w eigh t,
and num bers of the m etasta t ic foci on lungs, tumo r m icrovessel den sity (M VD ) w ere determ ined, the ex2
p ression of vascu lar endo thelia l grow th facto r (V EGF) of L ew is lung carcinom a w as ob served. Results　
TM P cou ld rem arkab ly reduce the vo lum e, w eigh t, and num bers of the m etasta t ic foci, M VD , and the ex2
p ression of V EGF of L ew is lung carcinom a. Bu t D S did no t show rem arkab ly effect on L ew is lung carcino-
m a. Conclusion 　TM P can rem arkab ly inh ib it the grow th and m etastasis of L ew is lung carcinom a on
m ice, and its m echan ism m igh t be rela t ive to inh ib it ing the exp ression of V EGF and angiogenesis. D S in2
ject ion has no rem arkab ly effect on L ew is lung carcinom a.
Key words: tet ram ethylpyrazine (TM P) ; D an shen (D S) ; L ew is lung carcinom a; m icrovessel den sity
(M VD ); vascu lar endo thelia l grow th facto r (V EGF)
　　研究表明, 恶性肿瘤的无限制侵袭性生长及其
转移均依赖于血管生成, 抑制血管生成能够显著抑
制肿瘤的生长和转移[1 ]。血管内皮生长因子 (vascu2
la r endo thelia l grow th facto r, V EGF ) 是一种高
效、特异地作用于血管内皮细胞的促血管生长因子,
V EGF 与肿瘤的生长和转移密切相关[2 ]。既往研究
表明, 川芎嗪可以抑制肿瘤的生长, 其机制与川芎嗪
提高免疫功能密切相关[3 ]。丹参素在无血清培养液
中能明显抑制胃腺癌细胞的生长并在实验范围内有
较好的剂量依赖关系[4 ]。本实验探讨了川芎嗪注射
液和丹参注射液对小鼠 L ew is 肺癌生长和转移的
影响及其与肿瘤血管生成和V EGF 表达的关系。
1　材料与方法
111　药品与主要试剂: 盐酸川芎嗪注射液 (TM P,
无锡市第七制药厂, 40 m gö2 mL , 批号 9803161) ;
丹参注射液 (D S, 正大青春宝药业有限公司, 每支
10 mL , 相当于原生药 15 g, 批号 0101156) ; 硫酸鱼
精蛋白注射液 (上海生物化学制药厂, 50 m gö5
mL , 批号 000609) ; Ð 因子、V EGF 抗体 (San ta
C ruze 公司) ; SABC 免疫组化试剂盒 (武汉博士德
生物工程有限公司)。其余试剂均为市售分析纯。
112　模型制备[5 ]与分组给药: 取接种 L ew is 肺癌
10～ 14 d 的 C 57BL 荷瘤小鼠 (购自中国科学院上海
药物研究所) , 脱颈椎处死, 无菌条件下取瘤组织, 按
肿瘤质量 (g) 与生理盐水 (mL ) 1∶3 制备匀浆液
备用。另取 C 57BL 小鼠 (18～ 20 g, 购自中国医学科
学院动物繁殖所) 80 只, 雌雄各半, 随机分为 8 组:
TM P 50, 100, 200 m gö(kg·d) 3 个剂量组; 丹参注
射液 5, 10, 20 gö(kg·d) 3 个剂量组; 鱼精蛋白 60
m gö(kg·d) 组; 生理盐水组。各组小鼠于右腋皮下
接种匀浆液, 每只 012 mL。各组接种后第 2 天开始
给药, TM P 及丹参各剂量组分别 ip 相应药物, 生理
盐水组 ip 生理盐水, 每只 012 mL , 每日 1 次, 连续
21 d; 鱼精蛋白组于接种后第 2 天按 60 m gökg sc 1
次, 第 3 天起每 12 h sc 1 次, 连续 20 d。第 22 天脱
颈椎处死各组小鼠进行指标检测。
113　一般检测: 接种前和接种后每 3 d 称 1 次体
重, 按体重变化调整给药。接种后每 3 d 测量 1 次荷
瘤小鼠肿瘤最长径 (a) 和最短径 (b) , 计算肿瘤体
积 (V = 0. 5 ab2) , 绘制肿瘤生长曲线。第 22 天脱颈
椎处死小鼠, 取皮下肿块称质量, 计算肿瘤抑制率。
取双侧肺称质量, 并计数各肺叶表面的癌转移灶数。
　　肿瘤生长抑制率= (生理盐水组平均瘤质量- 治疗组
平均瘤质量) ö生理盐水组平均瘤质量×100%
114　免疫组织化学染色: 取肿瘤组织, 10% 中性甲
醛固定, 常规脱水包埋, 4 Λm 连续切片, 抗Ð 因子抗
体或抗V EGF 抗体为É 抗, 阴性对照用磷酸盐缓冲
液 (PBS) 代替É 抗, 按照试剂盒说明书进行 SABC
·792·中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 35 卷第 3 期 2004 年 3 月
法免疫组化染色。
115　M VD 和 V EGF 表达的检测: 对É 抗为抗Ð
因子抗体的切片依据W eidner [6 ]标准对着染的血管
进行密度分级。先在低倍镜 (×40) 下全面观察切
片, 在肿瘤浸润区域选取血管内皮细胞染色清晰、背
景对比良好、微血管数量最密集的视野, 在高倍镜
(×200) 下记录 6 个视野内的微血管数, 取其平均
值作为M VD 值。对É 抗为抗V EGF 抗体的切片选
取阳性细胞密集区域, 在高倍显微镜 (×400) 下选
取 20 个阳性细胞, 应用图像分析系统, 测定平均吸
光度 (A ) 值, 以此代表阳性细胞胞质单位面积内
V EGF 相对含量。
116　结果统计: 计量资料结果以 x ±s 表示, 进行单
因素方差分析, 组间均值两两比较用 SH K 法, 均由
统计软件包 (SPSS10. 0) 完成。
2　结果
211　TM P、丹参对肿瘤生长的影响: 各组小鼠移植
瘤生长曲线见图 1。用药 21 d 后, TM P 各剂量组、
鱼精蛋白组肿瘤体积均显著小于生理盐水组 (P <
0105) ; 丹参各剂量组肿瘤体积与生理盐水组相比,
差异无显著性意义 (P > 0105)。此结果表明: TM P
对 L ew is 肺癌小鼠移植瘤生长有明显抑制作用, 而
丹参没有抑制作用。
图 1　TM P (A) 和丹参 (B) 对小鼠L ewis 肺癌生长的影响
F ig. 1　Effect of TM P (A) and D S (B) on growth
of L ewis lung carc inoma
212　TM P、丹参对肿瘤质量的影响: 见表 1。用药
21 d 后, TM P 各剂量组、鱼精蛋白组的肿瘤质量均
显著低于生理盐水组 (P < 0105)。丹参各剂量组的
肿瘤质量与生理盐水组相比虽有减轻, 但差异不显
著。结果表明: TM P 对L ew is 肺癌小鼠移植瘤生长
有明显抑制作用, 而丹参对此无明显作用。
213　TM P、丹参对肿瘤肺转移的影响: L ew is 肺癌
肺转移灶一般呈圆形小突起如疱状, 直径多数在
014～ 0. 8 cm , 部分转移灶可融合在一起。用药 21 d
后, TM P 各剂量组和鱼精蛋白组的肺质量、肺转移
灶数均显著低于生理盐水组 (P < 0105) , 见表 1。肺
转移灶主要为单个分散于肺叶表面, 较少见到融合
的转移灶。丹参各剂量组的肺质量和肺转移灶数均
低于生理盐水组, 但差异无显著性意义 (P > 0105)。
此结果表明: TM P 对 L ew is 肺癌小鼠移植瘤肺转
移有明显的抑制作用, 而丹参有抗L ew is 肺癌小鼠
移植瘤肺转移的倾向。
表 1　TM P 和丹参对 L ewis 肺癌小鼠移植瘤质量、
肺质量和肺转移灶数的影响 (x±s, n= 10)
Table 1　Effect of TM P and D S on we ight of tumor and
lung tissue, numbers of metasta tic foc i in m ice
with L ewis lung carc inoma (x±s, n= 10)
组　别
剂量ö(g·kg- 1) 肿瘤质量ög 抑制率ö% 肺质量ög 转移灶数ö个
生理盐水　 - 1190±0116 - 0123±0110 14160±6186
TM P 　01050 1103±01193 4518 0117±01023 7111±11303
01100 1108±01153 4312 0116±01023 7133±11633
01200 1108±01193 4312 0118±01053 9170±31323
丹参 5 1173±0140 819 0121±0102 13152±2165
10 1173±0164 817 0120±0103 13167±4115
20 1180±0163 419 0122±0112 13150±3125
鱼精蛋白 01060 0180±01213 3 5719 0116±01033 3 6180±21163 3
　　与生理盐水组比较: 3 P < 0105　3 3 P < 0101
　　3 P < 0105　3 3 P < 0101 vs N S group
214　TM P、丹参对M VD 和 V EGF 表达的影响:
显微图像分析表明肿瘤微血管内皮细胞被染成棕黄
色, 微血管密集区多位于肿瘤细胞浸润的前缘部位,
肿瘤内部微血管密集区少于浸润的前缘部位。TM P
各剂量组、鱼精蛋白组M VD 与生理盐水组比较显
著降低 (P < 0105) , 丹参各组M VD 与生理盐水组
比较差异无显著性 (P > 0105) , 见表 2。V EGF 主要
表达于肿瘤细胞内, 肿瘤细胞膜亦有少量阳性染色,
阳性染色的肿瘤细胞多位于浸润边缘, 某些血管内
皮细胞呈弱阳性染色。结果表明: TM P 对L ew is 肺
癌移植瘤M VD 和 V EGF 的表达均有显著抑制作
用, 丹参无明显作用。
3　讨论
　　V EGF 是一种特异的血管内皮细胞刺激因子,
可与血管内皮细胞相应受体结合, 刺激血管内皮细
胞增殖, 促进血管生成; 同时还可增强血管通透性,
为血管内皮细胞迁移及肿瘤细胞转移提供基础。研
究表明, 多数肿瘤细胞都表达高水平的 V EGF, 抑
制V EGF 可有效抑制肿瘤的生长及转移[2 ]。本实验
结果显示, L ew is肺癌在生长过程中高表达V EGF ,
·892· 中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 35 卷第 3 期 2004 年 3 月
表 2　TM P 和丹参对 L ewis 肺癌小鼠移植瘤组织
M VD 及 VEGF 表达的影响 (x±s, n= 10)
Table 2　Effect of TM P and D S on M VD and expression
of VEGF of tumor tissue in m ice with L ewis
lung carc inoma (x±s, n= 10)
组　别 剂量ö(g·kg- 1) M VD ö(个·视野- 1) V EGF (A 值)
生理盐水 　　 - 27117± 7197 0163±0108
TM P 　　01050 14132± 91113 0145±01073
01100 12127±111193 0144±01063
01200 13101± 81343 0151±01083
丹参 5 25144±11123 0163±0105
10 24197± 8185 0161±0106
20 26199±13101 0162±0105
鱼精蛋白 01060 11131±121243 3 0159±0106
　　与生理盐水组比较: 3 P < 0105　3 3 P < 0101
　　3 P < 0105　3 3 P < 0101 vs N S group
并形成了丰富的新生血管, 从而促进了肿瘤的生长
和肺转移。
肿瘤属于中医“ 瘕”范畴, 运用活血化瘀法及
其方药治疗肿瘤已被公认。但有关中药抗肿瘤机制
中, 抗血管生成的研究报道不多。本实验显示, 在给
予 TM P 治疗后,L ew is 肺癌的体积、质量、M VD 和
肺转移灶数均显著降低, 证明 TM P 有抗肿瘤生长
和转移的作用。同时本研究首次表明, TM P 可抑制
肿瘤血管生成, 降低M VD , 抑制 V EGF 的表达, 说
明 TM P 抗肿瘤生长和转移的作用与其抑制肿瘤血
管生成, 降低肿瘤M VD 密切相关, 其确切机制很可
能是通过抑制V EGF 的表达来实现的。
实验结果还表明, 给予鱼精蛋白后, 虽然肿瘤的
生长和转移均受到了显著抑制, 但是肿瘤细胞分泌
的V EGF 与模型组相比并没有显著差异, 这与既往
的研究是一致的。鱼精蛋白作为一种抗血管生成剂,
其机制并非是抑制V EGF 的产生, 而是阻碍V EGF
与其受体结合而抑制V EGF 的生物功能的实现[7 ]。
眭建[4 ]、张培彤[8 ]等通过体外细胞实验证实, 丹
参素和丹参酮Ê A 均有一定的抗肿瘤活性。本实验
所用的丹参注射液是以丹参素为主的水溶性成分,
结果显示其对 L ew is 肺癌小鼠移植瘤生长和肺转
移无明显抑制作用, 对肿瘤M VD 和 V EGF 的分泌
亦无明显影响。这一现象再次表明, 体外细胞实验与
体内实体瘤模型实验存在着较大的区别。其原因可
能是, 体外实验的药物浓度通常较高, 体内很难达到
如此高浓度; 体外实验影响因素单一, 而体内用药干
预因素较多等。动物实体瘤模型实验更接近于人体
的实际情况, 或许更有参考价值。
References:
[ 1 ]　Fo lkm an J1 A ngiogenesis in cancer vascu lar rheum ato id and
o ther disease [J ]1 N at M ed , 1995, 1: 272311
[ 2 ]　Ferrara N. Ro le of vascu lar endo thelial grow th facto r in the
regu lation of angiogenesis [J ]1 K id ney In ter, 1999, 56: 7942
8141
[ 3 ]　L iu J R , Ye S B. A ntim etastasis effect of tetram ethylpyra2
zine to tumo r and its m echan ism [J ]1 Ch in J P harm acol
T ox icol (中国药理学与毒理学杂志) , 1993, 7 (2) : 14921521
[ 4 ]　Sui J , L in F1 Effect of D anshensu to adenocarcinom a N GCC
cell [J ]1 J Z henj iang M ed Coll (镇江医学院学报) , 1997, 7
(4) : 38423871
[ 5 ]　O’Reilly M S, Ho lm gren L , Sh ing Y, et a l. A ngio station: a
novel angiogenesis inh ib ito r that m ediates the supp ression of
m etastases by a L ew is lung carcinom a [J ]1 Cell, 1994, 79:
31523211
[ 6 ]　W eidner N , Semp le J P, W elch W R , et a l. T umo r angio2
genesis and m etastasis2co rrelation in invasive breast carcino2
m a [J ]1 N ew E ng l J M ed , 1991, 324: 1281
[ 7 ]　V aism an N , Go spodarow iz D , N eufeld G1 Characterization
of the recep to rs fo r vascu lar endo thelial grow th facto r [J ]1 J
B iol Chem , 1990, 32: 194612194661
[ 8 ]　Zhang P T , Pei Y X, Q i X, et a l. Effects of certain drugs on
the exp ression of an tigens on hum an pu lmonary gian t cell car2
cinom a [J ]1 Ch in T rad it H erb D rug s (中草药) , 1999, 30
(5) : 35223551
益气平悬饮对艾氏腹水癌小鼠肿瘤浸润淋巴细胞杀伤活性的影响
黄立中, 伍参荣, 肖　雅, 何　欣, 唐小梅, 王大安Ξ
(湖南中医学院, 湖南 长沙　410007)
摘　要: 目的　探讨益气平悬饮对肿瘤浸润淋巴细胞 ( tumo r2infilt ra t ing lymphocytes, T IL ) 杀伤自体肿瘤细胞
(an to2tumo r cells, A TC) 活性的影响。方法　取昆明种小鼠 40 只, 腹腔接种艾氏腹水癌瘤株 (EA C) 瘤液建立移
植瘤模型, 接种次日随机分为 4 组: 益气平悬饮大、小剂量 (3710, 1815 gökg) 组、环磷酰胺对照组、模型对照组。益
气平悬饮大、小剂量组当日 ig 给药, 共给药 9 d, 环磷酰胺组 ip 环磷酰胺 75 m gökg, 自接种第 3 日起, 隔日给药, 共
·992·中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 35 卷第 3 期 2004 年 3 月
Ξ 收稿日期: 2003207217
基金项目: 国家中医药管理局基金资助 (02203JP30) ; 湖南省自然科学基金资助 (01JJ2037)
作者简介: 黄立中 (1956—) , 男, 河北抚宁人, 医学博士, 副教授, 副主任医师, 硕士研究生导师, 主要从事肿瘤的中医药防治研究。
E2m ail: HL Z992002@ 163. com