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阳春砂的 ITS序列分析
周　联 ,王培训 ,黄　丰 ,曹柳英 ,梁瑞燕
(广州中医药大学临床药理研究所 ,广东 广州　 510405)
摘　要: 　目的　用 ITS全序列鉴别各地产阳春砂及常见伪品。 方法　从各地产阳春砂及常见伪品绿壳砂和海南
砂中提取总 DN A,以核基因组通用引物 ITS为引物进行扩增 ,扩增产物经纯化后 ,用 PCR产物直接法进行测序。
结果　各样品的 ITS序列总长度均为 626 bp,其中 ITS-1序列长度为 248 bp, 5. 8 S序列长度为 155 bp, ITS-2序
列长度为 223 bp; 6个阳春砂和绿壳砂的 ITS-2序列完全一致 ,各样品的 5. 8 S序列完全一致 ,在 ITS-1中各样品
却有不同的碱基位点。结论　 ITS-1序列可对阳春砂的道地性作出鉴别 ,明显区分其伪品。
关键词: ITS序列 ;测序 ;阳春砂 ;中药鉴别
中图分类号: R282. 710. 3　　　文献标识码: B　　　文章编号: 0253 2670( 2002) 01 0072 04
ITS sequence analys is of Amomum villosum
ZHOU Lian, W ANG Pei-xun, HU ANG Feng , CAO Liu-ying , LIAN G Rui-yan
　　 ( Institute of Clinical Pharmaco log y, Guang zhou Univ ersity o f TCM , Guang zhou Gaungdong　 510405, China)
Abstract: Object　 To identi ty Amomum v illosum Lour. f rom dif ferent producing area by IT S se-
quence analy sis.Methods　 Firstly, to tal DN A of A. vil losum f rom di fferent producing area w as ex tracted
and i t s succedaneum or fake w as ex tracted. Secondly, the IT S sequence w as ampli fied by PCR with uni-
versal primer o f IT S and sequencing ITS on PCR product w as directly sequenced af ter purification. Results
　 The to tal length of I TS sequence is 626 bp in the dif ferent samples. The ITS sequence can be divided in-
to th ree f ragments: the leng th o f I TS-1 is 248 bp, 5. 8 S is 155 bp and ITS-2 is 223 bp respectiv ely. In all
the samples, 5. 8 S has the same sequence. Six A. villosum from dif ferent producing area and Luqiao amo-
mum have the same ITS-2 sequence. But ITS-1 fragment has big ger div ersi ty in ba se sequence among the
va rious specimens. Conclusion　 ITS-1 sequence can be used to confi rm producing a rea o f A. vil losum , a nd
find out i ts fake.
Key words: ITS sequence; analy sis o f ITS sequence; Amomum vi llosum Lour. ; Chinese materia medi-
ca identification
　　 PCR直接测序法是 90年代迅速发展起来的测
序技术 ,具有快速、灵敏、准确率高等特点。 近几年 ,
该技术在中药材的鉴别中得到一定的应用 ,由于目
前绝大多数中药材的基因序列尚不知晓 ,所以现阶
段的中药材测序主要是采用通用引物 ,对样品进行
PCR扩增 ,然后进行小片段的测序。常见的引物有
rbcL (叶绿体基因组 )、 IT S等 (植物类核基因组 )、
cty-b (动物类线粒体基因组 )等。其中 , ITS-1序列
变异较快 ,可用于解决属下不同种的系统发育和分
类问题 [1 ]。
阳春砂为四大南药之一 ,是常见的芳香化湿中
药 ,具有化湿行气 ,温脾止泻、安胎等功效。我们曾用
RAPD (随机扩增多态性 DNA)技术对不同产地的
阳春砂与姜科多种常见伪品进行了鉴别分析 ,结果
·72· 中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　 2002年第 33卷第 1期
收稿日期: 2001-03-14基金项目:国家中医药管理局科研基金 ( 950379) ;广东省自然科学基金 ( 950615)作者简介:周联 ,男 ,广东人 ,硕士 ,广州中医药大学临床药理研究所副研究员 ,长期从事中西医结合基础研究工作 ,分子生物学技术在中药鉴别中的应用是主要研究方向之一 ,主讲《医学分子生物学课程》 ,曾主持或参加国家、部、省级研究项目 15项 ,发表论文
20余篇 ,是国家级继续教育项目教材《分子生物学技术在中药鉴别中的应用》的主编 ,《中药免疫学》的主要编写人员 ,现正在参与主编《中药的分子生物学鉴别》一书。 E-mail: zl@ gzh tcm. edu. cn
发现在 RAPD指纹图中 ,各地产阳春砂基本一致 ,
仅有个别在极少数引物的扩增下 ,呈现了少量的多
态性。 另外 ,阳春砂与绿壳砂及海南砂所产生的
RAPD多态性指纹差异也较少 ,不易鉴别 [2 ] ,因此本
实验旨在通过对各地产阳春砂及其伪品的 ITS测
序分析 ,为中药材的道地性分子鉴别打下基础。
1　材料和方法
1. 1　材料: (见表 1,表中 1～ 3号为阳春砂的道地产
区 )本校中药资源教研室徐鸿华教授提供并鉴定。
1. 2　试剂: T ris ( B. M. ) , SDS ( Serva ) , Taq酶、
琼脂糖 ( Promega) , PCR产物纯化试剂盒 (宝灵
曼 ) ; Ma rker加拿大 MBI。
1. 3　主要仪器: 低温高速离心机 ( Beckman GS-
15R) ;紫外 /可见分光光度计 ( Pharmacia 4000) ;
凝胶成像仪 ( UV P GDS7600G) ;低温恒温式电泳
仪 ( LKB) ; PCR仪 ( PE 2400) 。
1. 4　 DNA提取:称取 0. 3 g各中药材样品 ,用高
盐、低 pH法 [ 3 ]获得总 DNA。
表 1　各样品基原、收集时间及样品纯度
序号　　　样品 收集年月 比值
( A260 / A280)
1阳春砂 (广东春湾 )
Amomum vil losum Lour.
1998-03
　 1. 13
2阳春砂 (广东潘龙 ) 1997-11 1. 95
3阳春砂 (广东广宁 ) 1992-09 1. 11
4阳春砂 (广东佛冈 ) 1998-05 1. 04
5阳春砂 (广西防城 ) 1996-09 1. 12
6阳春砂 (云南文山 ) 1998-08 1. 22
7绿壳砂 (广东广宁 ) A . vi llo
sum va r. A . xanthioides ( W-
all. ex Bak ) D. T. Wu et
Senjen
1998-09
　
　
　
1. 39
8海南砂仁 (海南海口 )
A. lon gil igula re T. L. Wu.
1998-08
　 1. 29
1. 5　 DNA扩增: 50μL 反应体积含各 5μL ( 2
μmo l /L)的引物 a和 b, 0. 2μLTaq酶 ( 5 U /μL) , 5
μL 10× buf fer, 5μL MgCl2 ( 25 mmol /L) , 5μL的
dN TP ( 25 mmol /L)及 25 ng模板 ,加水至 50μL。
扩增条件为 94℃ 预变性 3 min, 50℃ 1 min, 72
℃ 1 min, 循环 30次 ,最后 72℃ 3 min, 扩增所得
PCR产物用宝灵曼的 PCR产物纯化试剂盒纯化
(步骤参照说明书 )。
1. 6　 IT S测序 (见图 1): 采用 ITS序列测定的通
用引物测序 ,上游引物为 a: 5’ -GGA AGT AAA
AGT CGT AAC AAG G-3’ ,下游引物为 d: 5’ -
TCC TCC GCT TAT TGA TA T GC-3’ (引物由大
连华运公司合成 ) [4, 5 ]; PCR产物经纯化后 ,交由上
海基康生物技术有限公司进行测序。 为了保证序列
测定的精度 ,除了用 a和 d以外 ,尚用 b和 c分别
进行逆向测序 ( b的序列为 5’ -GCT ACG TTC
T TC ATC GA T GC-3’ ; c的序列为 5’ -GCA TCG
ATG AAG AAC GT A GC-3’ ) [6、 4 ]。
1. 7　序列分析:用 OM IGA 2. 0进行排序分析。
图 1　 ITS基因结构图
2　结果
结果见图 2, 3。
　　 ( 1) 8个样品的 IT S总长度均为 626 bp,其中
ITS-1序列长度为 248 bp (图 2) , 5. 8 S序列长度为
155 bp, I TS-2序列长度为 223 bp (图 3)。 ( 2) 6个
阳春砂的 ITS-2序列完全一致 ( 404～ 626) , 8个样
品的 5. 8S ( 249～ 403)完全一致 ,在 IT S-1中各样
品有不同的碱基位点 ; ( 3) 阳春砂原产区的 1号
(广东春湾 )、 2号 (广东潘龙 )、 3号 (广东广宁 ) 序
列完全一致 ; ( 4) 4号样品 (广东佛冈 )有 5个碱基
与 1～ 3号不同 ,分别为 9, 34, 61, 108, 190号 ; ( 5)
5号样品 (广西防城 )有 4个碱基与 1～ 3号不同 ,
分别为 47, 132, 158, 198; ( 6) 6号样品 (云南文山 )
有 5个碱基与 1～ 3号不同 ,分别为 27, 78, 111,
136, 213号 ; ( 7) 7号样品 (绿壳砂 )有 8个碱基与
1～ 3号不同 ,分别为 30, 38, 54, 112, 151, 194, 203
( ITS-1) , 417 ( ITS-2) ; ( 8) 8号样品 (海南壳砂 )
有 15个碱基与 1～ 3号不同 ,分别为 31, 33, 45, 51,
104, 142, 153, 171, 188, 213, 226, 230 ( ITS-1) ,
413, 437, 475。 ( 9) 上述样品均用 2个以上个体并
从 ITS两端测序 ,未检测到个体差异。
从测序结果可知: 各样品的 I TS-1序列差异
大 ,而 ITS-2差异小。阳春砂 ( 1～ 3号 )与海南壳砂
的 ITS序列相差最大 ,达 15个 ( 2. 4% ) ,与绿壳砂
的相差也较大 ,为 8个 ( 1. 28% ) ;不同产地的阳春
砂在 ITS-2之间没有差异 ,在 ITS-1序列碱基相差
最大 5个 (广东佛冈、云南文山 ) ,最小为 0( 1～ 3
号 )。
3　讨论
以往的中药材测序研究报道 ,大多是种上之间
的测序 ,所以序列相差较大 ,而本实验的样品主要为
同种不同产地 (各地产阳春砂 )及亲缘关系较近的
·73·中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　 2002年第 33卷第 1期
1-阳春砂 (广东阳春湾 ) ; 2-阳春砂 (广东潘龙 ) ; 3-阳春砂 (广东广宁 ) ; 4-阳春砂 (广东佛冈 ) ;
5-阳春砂 (广西防城 ) ; 6-阳春砂 (云南文山 ) ; 7-绿壳砂 (广东广宁 ) ; 8-海南壳砂仁 (海南海口 )
图 2　 8个样品 ITS-1序列 ( 1～ 248)
1-阳春砂 (广东阳春湾 ) ; 2-阳春砂 (广东潘龙 ) ; 3-阳春砂 (广东广宁 ) ; 4-阳春砂 (广东佛冈 ) ;
5-阳春砂 (广西防城 ) ; 6-阳春砂 (云南文山 ) ; 7-绿壳砂 (广东广宁 ) ; 8-海南壳砂仁 (海南海口 )
图 3　 8个样品的 5. 8 S ( 209～ 403)和 ITS-2序列 ( 404～ 626)
物种 (绿壳砂 ) ,从这个角度来讲 ,序列变异还是相
当丰富的 ,虽然这些基因差异不能将各地产阳春砂全
部区分开 ,但也能部分进行不同产地的鉴别 ,而且与
RAPD相比 ,在鉴别阳春砂与绿壳砂及海南砂的差
别时 ,较为灵敏。
测序鉴别的成功与否与引物的选择密切相关 ,一
方面所选用的引物必须灵敏 ,才能检测出亲缘关系较
近的物种。另一方面 ,所选的序列须缺乏个体差异。从
·74· 中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　 2002年第 33卷第 1期
测序结果看: ( 1) I TS序列能在各地产阳春砂中测出
最多达 5个的变异位点 ,而在真伪品中则有分别有 8
个 (绿壳砂 )和 15个位点 (海南砂 ) ,说明变异位点
丰富 ; ( 2) ITS-1的长度在不同的物种中有一定的差
异 ,如在被子植物中 I TS-1的长度为 187～ 298
bp
[ 7] ,实验结果显示 8个样品的长度均为 248 bp,没
有长度变化 ,同时也未发现个体差异 ,说明 I TS-1在
砂仁类的物种进化中又相对保守 ,实验结果表明我们
所选择的引物是合适的。
从报道和实验来看 , ITS-1较为适用于亲缘关系
较近的中药材鉴别。
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三七 GAP栽培的环境质量评价
崔秀明 ,王朝梁 ,陈中坚 ,王　勇
(云南省文山州三七研究所 ,云南 文山　 663000)
摘　要: 目的　对 三七 GAP种植基地的环境质量进行评价 ,为制定三七 SO P和建立 三七 GAP种植基地建设提
供科学依据。方法　采用文献方法对三七 GAP种植基地规划区进行水资源、土壤环境和大气环境进行分析评价。
结果　三七 GAP种植基地规划区大气环境质量达 GB3095-82 (大气环境质量标准 )一级标准 ,水资源达 GB5084-
85 (农田灌溉水质标准 ) 的一类标准 ,土壤环境达 GB15618-1995 (土壤环境质量标准 ) 二级标准。 结论　三七
GAP种植区环境质量良好 ,符合绿色药材栽培的环境质量要求。
关键词: 三七 ;土壤环境 ;大气环境 ;水资源 ;评价 ; GAP
中图分类号: R282. 21　　　文献标识码: B　　　文章编号: 0253 2670( 2002) 01 0075 03
Estimate of environmental condition on GAP culture of
Panax notoginseng
CUI Xiu-ming, WANG Chao-liang , CHEN Zhong-jian, W ANG Yong
( Wenshan Prefecture Institute of Sanqi, Wenshan, Yunnan, 663000, China)
Key words: Panax notoginseng ( Burkill ) F. H. Chen; soi l envi ronmenta l condi tion; atmospheric con-
di tion; aqueous condi tion; estimate; GAP
　　按照 GAP标准 ,建立优质中药材药源基地 ,是
我国中药现代化的重要内容。中药材生产的环境质
量评价是建立 GAP生产基地必须开展的重要内
容。三七 Panax notoginseng ( Burki ll) F. H. Chen
是我国人工栽培较早的名贵中药材 ,已有 400余年
的栽培历史。从 1997年开始 ,有关企业积极开展了
优质三七基地建设。现已在文山州建立了 60公顷
优质三七基地。 《 200公顷优质无公害三七基地建
设》项目已经列入云南中药现代化产业基地建设项
目。为保证三七 GAP基地生产的产品质量 ,我们对
·75·中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　 2002年第 33卷第 1期
收稿日期: 2001-05-15基金项目:云南省应用基础研究重点基金资助项目 ( 1999C0009Z)作者简介:崔秀明 ,男 ,云南文山人 ,高级农艺师 , 1985年毕业于云南农业大学农学系 ,主要从事三七 GAP及新药开发方面的研究工作 ,承担国家中药现代化项目 1项 ,省中药现代化项目及基金项目多项 ,发表论文 30余篇。
Tel: 0876-2141062 E-mai l: snaqi30@ Hotmail. com.