全 文 ：·药材·
RAPD法鉴定射干类中药
黄　芸1, 秦民坚1* ,杨　光2,徐珞珊1,周开亚2

( 1. 中国药科大学中药学院,江苏 南京　210038;　2. 南京师范大学 江苏省资源生物技术重点实验室,江苏 南京　210097)
摘　要: 目的　用 RAPD 技术对射干类药材射干 Belamcanda chinensis及混淆品鸢尾属鸢尾 I r is tectorum 、野鸢尾
I . dichotoma、蝴蝶花 I . j ap onica 、德国鸢尾 I . germanica 等 5种药用植物进行分子水平的鉴定。方法　CTAB 法
和 DNeasy TM P lant M ini Kit法提取射干类药材 5种原植物总 DNA, 以随机引物进行随机扩增。结果　用OPD-08
( 5’-g tgt gcccca-3)等作随机扩增引物进行随机扩增时, 可得到识别这些物种基因组 DNA 的多态片段。结论　
RAPD 法能有效的鉴别射干类药材, 把射干和鸢尾、野鸢尾、蝴蝶花、德国鸢尾等药用植物区分开。
关键词: 射干;鸢尾属; RAPD; DNA 指纹图谱
中图分类号: R282. 710. 3　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2002) 10 0935 03
Identification of Belamcanda chinensis and related Chinese
materia medica of Iris L. by RAPD analysis
HUANG Yun
1
, QIN M in-jian
1
, YANG Guang
2
, XU Luo-shan
1
, ZHOU Kai-ya
2
( 1. Co lleg e of TCM , China Pharmaceut ical U niver sity , Nanjing 210038, China; 2. Key Labor ato ry of Resources
Bio techno lo gy of Jiang su P rovince, Nanjing Normal Univ ersity , Nanjing 210097, China)
Abstract: Object　T o indent ify the crude drugs o f “Shegan”[ Belamcanda chinensis ( L . ) , DC. ] and
related Chinese materia medica of I ris L. , including I ris t ectorum Max im. , I . dichotoma Pall . , I . german-
ica L. and I . j ap onica T hunb. by RAPD technique. Methods　General DNA was iso lated f rom fresh
leaves o f B. chinensis and five plants o f I ris L. by CTA B and DNeasy
TM
Plant M ini Kit . T he random am-
plif ied polymorphic DNA ( RAPD) w as used to ident ify them . Results　The po lymo rphic feather o f DNA
fingerprints o f different species w ere compar ed by primer OPD-08. T he studies show ed that they have dif-
ferent relat ionships in heredity and the method of RAPD can be used to ident ify them easily . Conclusion 　
Chinese mater ia medica of I ris L. can be idenlif ied by RAPD, and B . chinensis could be different iated from
I . tectorum, I . dichotoma, I . j ap onica, I . germanica.
Key words : Belamcada chinensis ( L . ) DC. ; Ir is L. ; RAPD; DNA fingerpr ints
　　射干为常用中药,来源于鸢尾科植物射干 Be-
lamcanda chinensis ( L . ) DC. 的干燥根茎,具有清
热解毒、利咽消痰的功能, 主要用于咽喉肿痛、痰咳
气喘等症[ 1]。由于鸢尾属的植物鸢尾 Ir is tectorum
Max im. 、野鸢尾 I . dichotoma Pall. 、蝴蝶花 I .
j ap onica T hunb.、德国鸢尾 I . germanica L. 等与
射干在原植物形态上比较相似, 极易混淆和误用,影
响射干药材的质量和疗效。有文献记载鸢尾有小毒,
因此更应注意其与射干的区别, 以保证射干用药的
安全性。对射干类药材的鉴别在原植物的形态学、解
剖学、细胞学、化学分析等方面已有很多报道 [ 2～4]。
现采用 RAPD技术,从分子水平对射干类药材及混
淆品共 5种原植物进行鉴定。
1　材料
样品来源:见表 1,野外采样用根茎在南京中国
药科大学植物园栽培后取叶供实验。样品经作者鉴
定无误。凭证标本存中国药科大学标本馆。
2　仪器与试剂
2. 1　仪器: PCR热循环扩增仪( PE2400)、凝胶成像
自动分析仪( U VP GDS 7600G)、稳压稳流电泳仪。
2. 2　试剂: 液氮(南京大学制冷设备厂)、CTAB(上
海Sangon 公司)、Tris (南京格瑞生物技术有限公
·935·中草药　Chinese T raditiona l and Herbal D rugs　2002 年第 33 卷第 10期

收稿日期: 2002-02-18基金项目:国家自然科学基金( 30170103) ;江苏省资源生物技术重点实验室、江苏省自然科学基金资助项目( BK97085)作者简介:黄　芸( 1974-) ,女,江西上饶人,硕士, 1993年 9月～1997年 6月就读于中国药科大学,获理学学士学位。1997年 8月～1999年 7月在江西国药有限责任公司质量监督处任助理工程师, 1999年 9月～2002年 6月就读于中国药科大学, 主要研究方向为药用植物种质资源及其质量评价,获硕士学位,现为中国药科大学博士研究生。E-mail: h y9317536@ hotm ail . com
Tel: 025-5322741
* 联系人　Tel: ( 025) 5391290　　Fax: ( 025) 5301528　　E-mail: minjianqin@ s ina. com
司 )、T aqDN A 聚合酶(上海 Sangon公司)、随机扩
增引物(由上海 Sangon 公司合成, 见表 2)、Marker
(上海 Sangon 公司 100 bp DNA Ladder Plus)、琼
脂糖(上海 Sangon公司)、溴乙锭( EB)。
表 1　样品基源
编号 样品 代号 学　　　　名 产地
1 射干　　 sh g1 B elamcanda chinensis (L . ) DC. 河南卢氏
2 射干　　 sh g2 B . chinensis ( L. ) DC. 江苏江浦
3 射干　　 sh g3 B . chinensis ( L. ) DC . 江苏南京
4 鸢尾　　 yw 1 I ris tectorum Maxim . 四川峨嵋
5 鸢尾　　 yw 2 I . t ectorum Maxim. 江苏句容
6 鸢尾　　 yw 3 I . t ectorum Maxim. 江苏南京
7 野鸢尾　 yyw I . d ichotoma pall . 江苏南京
8 德国鸢尾 dg I . g ermanica L . 江苏南京
9 蝴蝶花　 hd I . j ap onica T hunb. 江苏南京
表 2　随机扩增引物
引　　物 序　　　列
OPD-08 GT GT GCCCCA
OPD-11 AGCGCCATT G
OPD-12 CACCGTAT CC
OPD-13 GGGGT GACGA
OPA-1 CAGGCCCTT C
OPA-14 T CTGT GCTGG
OPA-15 T T CCGAACCC
3　方法
3. 1　选材: 为了探讨种内个体差异对 RAPD实验
结果是否有影响,在做 RAPD时 5种植物中每个种
植物都选用随机个体的新鲜叶。
3. 2　总 DNA 提取: DNeasyTM Plant M ini kit ( GE-
RMANGENQUIT ) (图 1) ; CT AB 法提取植物总
DNA
[ 5 ]。
a-yw 1; b-dg1; c-hd1;
d-shg1; e-yyw 1
图 1　总 DNA 电泳图 (用
DNeasyTM Plant Mi-
ni kit提取)
3. 3　随机引物:根据 Shi-
m izu 等[ 6] , Zhurav lev 等[ 7]
所筛选出的能用于日本及
欧洲产鸢尾属植物随机扩
增的引物 (表 2) , 再通过
合适的 RAPD 反应条件
从中选择能有效区分射干
类中药及其混淆品的随机
引物。
3. 4　RAPD扩增条件:扩
增反应体系为 20
L, 10×buf fer 缓冲液(无 Mg 2+ )
2
L、dNTP( 2. 5
mol/ L ) 2
L、MgCl2 ( 33. 33 mol/
L ) 2. 5
L、扩增引物( 4
mol/ L ) 1
L、模板 10～
100 ng、T aq 酶 0. 2
L、加重蒸水补充 20
L。在
2400 PCR热循环仪上,经 95℃预变性 5 min, 然后
95 ℃变性 40 s, 31 ℃复性 40 s, 72 ℃延伸 1 m in,
完成 35个循环后, 72 ℃ 7 min 补齐。扩增产物 20

L 加适量载样缓冲液,经 2%琼脂糖凝胶电泳, EB
( 0. 5
g/ mL)染色检查。
3. 5　数据分析:电泳图谱中每一条带代表 1个引物
结合位点,有带计为 1, 无带计为 0。任意两个样本
间的遗传差异用遗传距离指数 D 衡量。F= 2N xy /
( N X+ N Y )、D = 1-F ( F 为共享度, N X、N Y 分别为第
X 和第 Y 个体拥有的 RAPD表记数, N XY为 X 与 Y
个体共享的RAPD 标记数。)
4　结果与讨论
4. 1　结果: 实验结果表明用 OPA-1、OPA-14、
OPA-15、OPD-11、OPD-12、OPD-13 作随机扩增引
物对这 5种植物均有多态性扩增,但不能将它们完
全区分;用 OPD-08作随机扩增引物, 可以将射干鸢
尾、野鸢尾、德国鸢尾、蝴蝶花等 4种鸢尾属植物完
全区分开(图 2)。任意两个样本间的遗传距离指数
见表 3,遗传距离指数柱形图见图 3。同时,证明种内
个体以OPD-08作随机扩增结果基本无差异。
1, 2, 3 分别为 yw 1, yw 2, yw 3; , 4, 5, 6 分别为
shg 1, sh g2, sh g3; 7, 8, 9 均为 hd; 10, 11, 12均为
dg; 13, 14, 15均为 yyw
图 2　4 种鸢尾属植物 RAPD指纹图
1为 yw 与 sh g 间的比较; 2为 yw 与 hd间的比较; 3为 yw 与 dg
间的比较; 4为 yw 与 yyw 间的比较; 5为 shg 与 hd间的比较; 6
为 shg 与 dg 间的比较; 7为 shg 与 yyw 间的比较; 8为 hd与 dg
间的比较; 9为 hd 与 yyw 间的比较; 10为 dg 与 yyw 间的比较;
( x 轴为 1～10; y 轴为遗传距离指数)
图 3　任意两个样本间的遗传距离指数柱形
表 3　任意两个样本间的遗传距离指数 D
1( yw) 2( shg) 3( hd) 4( dg) 5( yyw )
1( yw) 0. 0000
2( shg) 0. 6000 0. 0000
3( hd) 0. 4118 0. 4444 0. 0000
4( dg) 0. 5300 0. 5293 0. 4737 0. 0000
5( yyw) 0. 7143 0. 2000 0. 2941 0. 6250 0. 0000
　　任意两个样本间的遗传距离指数 D 用柱形图
来表示, 可见 7( shg 与 yyw 间的遗传距离)的柱高
·936· 中草药　Chinese T raditiona l and Herbal D rugs　2002 年第 33 卷第 10期
最小,表明射干与野鸢尾间的亲源关系较近; 4和 10
( yw 与 yyw 间遗传距离)的柱高最大, 野鸢尾与鸢
尾的亲源关系较远。
4. 2　 讨 论: 在 中 药 材的 RAPD 研 究 中, 用
HDeasy
TM
Plant M ini kit提取DNA 的纯度高, 降解
少,成本高,而 CT AB法提 DNA 纯度较低及有部分
降解,成本较低。本研究发现即使模板中含有一定量
杂质和部分将降解时, 在筛选了合适的引物后, 控制
合适的模板浓度、Mg2+ 的浓度、退火温度及反应的
循环数同样能达到有效扩增。两种方法提取的DNA
扩增结果一致,并且重复性较好。因此用 CT AB法
提取的总 DNA 模板能满足 RAPD法对模板的要
求。在传统的形态分类学中, 野鸢尾被划分为鸢尾
属,而射干被划分为射干属。小分子化学成分的研究
及细胞遗传学实验都证明有着密切的亲源关
系[ 2, 8, 9]。本实验通过总 DNA 核酸大分子随机扩增,
结果表明射干与野鸢尾有较近的亲源关系, 支持小
分子化学研究的结果, 有待于进一步的研究。
参考文献:
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im plicat ions of the leaf anatomy of rh izomatou s iris species
[ J ] . Bot J Lin n S oc, 1985, 90: 253-303.
金线莲 RNA提取方法的改进
唐明娟,郭顺星

(中国医学科学院 中国协和医科大学药用植物研究所, 北京　100094)
摘　要: 目的　有效提取金线莲 RNA,为研究内生真菌促进其生长机制奠定基础。方法　CTAB 法制备 RNA, 1%
琼脂糖凝胶电泳 ,凝胶成像仪照相。结果　提取的 RNAA 260 / A 230为 2. 054, A 260 / A 280为 1. 818, 产量达 154. 35
g / g。
电泳条带清晰, RNA 完整性好。结论　用该方法能高质高量地制备富含多糖和酚类化合物的药用植物 RNA。
关键词: 金线莲;酚类化合物; 多糖; RNA
中图分类号: R282. 2　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2002) 10 0937 03
Improved method of extracting RNA from Anoectochilus roxburghii
TANG Ming-juan, GUO Shun-x ing
*
( Institute o f Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Science
and Peking Union Medical Co lleg e, Beijing 100094, China)
Abstract: Object　Effect ively ext racting RNA from A noectochilus rox burghi i ( Wall. ) Ldl . lay s a
foundat ion to r esearch the mechanism of endomycor rhiza promot ing its grow th. Methods　 RNA was pre-
pared by CT AB, elect ropho resis on 1% agro ses gel and photo are taken w ith Mut iImage
TM
Light Cabinet .
Results　 T he r at ios of RNA A 260/ A 230 and A 260/ A 280 were 2. 054 and 1. 818, respect ively. And the yield
w as 154. 35
g/ g f resh. T he bands w ere clear on agrose gel and integrity of RN A was good. Conclusion 　
RNA w ith high quality and high quant ity is iso lated by the method of CT AB for medicinal plants w ith high
·937·中草药　Chinese T raditiona l and Herbal D rugs　2002 年第 33 卷第 10期

收稿日期: 2002-04-05基金项目:国家自然科学基金资助项目( No 39970018) ;高等学校全国优秀博士学位论文作者专项资金资助项目( 199950)作者简介:唐明娟( 1972-) ,女,四川达县人,博士学位, 1998年考入中国医学科学研究院药用植物研究所硕士, 2000年转为同专业博士,研究方向为药用植物分子技术。T el : 010-62889921　　E-mail : mingjt@ soh u. com; mingjt1153@ s ina. com
* 联系人: Tel: ( 010) 62899729