全 文 ：·综述·
高效毛细管电泳指纹图谱鉴别天然药物研究进展
叶能胜, 谷学新
(首都师范大学 化学系, 北京 100037)
摘 要 : 简介高效毛细管电泳( HPCE)技术的基本原理, 综述了 HPCE 近年来在天然药物指纹鉴别中的应用,并
讨论该技术在天然药物指纹图谱鉴别的应用前景。
关键词: HPCE ;天然药物; 指纹图谱;指纹鉴别
中图分类号: R282. 5 文献标识码: A 文章编号: 0253 2670( 2002) 03 0274 02
Progress in studies on fingerprint of nature medicine by HPCE
YE Neng-sheng, GU Xue-x in
( Depar tment o f Chemistry , Capital Normal Univer sity , Beijing 100037, China)
Key words : high performance capillary electr ophoresis ( HPCE) ; nature medicine; f ing er print ; ident i-
ficat ion by fingerprint
随着现代自然科学技术的发展, 许多新学科理论和实
验技术不断渗透到中药鉴别领域, 极大地推动了中药鉴别的
发展[ 1] ,其中高效毛细管电泳( HPCE)是近十几年迅速发展
起来的一种新型分离分析技术,具有分离效率高、分析速度
快、分离模式多、所需样品少、应用范围广、自动化程度高的
特点, 在生命科学、生物技术、医学药物和环境科学等领域显
示了极其重要的应用前景, 目前正广泛应用于天然药物研究
之中。本文结合国内文献综述近年来 HPCE 技术在中药指
纹鉴别中的应用进展。
1 基本原理和分析特点
HPCE 是以高压电场为驱动力 ,以毛细管为分离通道,
依据样品中各组分之间的淌度和分配行为的差异而实现分
离的一类液相分离技术。仪器装置通常包括高压电源、进样
系统、毛细管柱、检测器和记录系统 5部分, 其中毛细管柱是
分离的核心部分。
研究与实践表明, HPCE 与 HPLC 相比具有以下特点:
( 1)分离效率高, 理论塔板数高达 106～107/ m ; ( 2)分析速度
快, 一般在 20～30 m in 内可完成一次电泳操作; ( 3)应用模
式多样,已经发展了毛细管区带电泳( CZE)、胶束电动毛细
管色谱( M ECC)等分离模式,扩大了 HPCE 的应用范围 ; ( 4)
样品用量少, 仅为纳升级; ( 5)灵敏度高, 用激光诱导荧光检
测器可达 10-24的超低检出限。
2 天然药材 HPCE指纹鉴别
2. 1 蛋白多肽:天然药材细胞中普遍存在多肽和蛋白质类
物质, 这些物质受遗传基因控制, 其 HPCE 图谱具有特征
性, 可以作为指纹图谱鉴别天然药材。有关蛋白质多肽
HPCE 方法用于指纹鉴别中药药材的相关报道见表 1。
为了得到满意的指纹图谱,必须对蛋白质多肽的提取方
法和有关实验参数进行优化。由于天然药物含有多种蛋白质
多肽, 不同蛋白的等电点不同 ,单一提取液很难将所有蛋白
质一次完全提取出来。为了更全面反映其特征图谱, 在提取
蛋白时,可以分别用酸性抽提液、碱性抽提液及 T ris-甘氨酸
蛋白抽提液来提取蛋白,它们的组成分别是: 碱性提取液为
0. 1 mol/ L T r is-HCl、0. 5 mo l/ L 蔗糖、0. 1%抗坏血酸、10
mmol/ L 巯基乙醇, pH 8. 0; 酸性提取液为 80 mmol/ L 柠檬
酸、32 mmol/ L Na 2HPO4、5 mmo l/ L 抗坏血酸、10 mmol/ L
巯基乙醇, pH 2. 8; T r is-甘氨酸蛋白抽提液为 0. 6 g T ris、
2. 88 g 甘氨酸加水溶解至 1 000 mL , pH 8. 5。在酸性、碱性
提取液中常常加入抗氧化性的巯基乙醇和抗坏血酸, 目的在
于防止蛋白质的活性基团受到破坏。一般情况下采用 3 种蛋
白质抽提液提取天然药物中蛋白质和多肽, 结合 3 种不同提
取液的 HPCE 指纹图谱, 基本上就可以实现对药材的指纹
鉴别。邢旺兴[6]认为分别提取方法繁琐,同时抽提液中高强
度的离子容易导致焦耳热的生成, 于是尝试用水作为抽提
液,结果表明水提取液能够客观反映水溶性蛋白的情况。还
有采用大孔树脂法[5]进行粗分后直接进行 HPCE 分析,也可
达到满意的分离效果。
2. 2 其他成分: 王寅[ 2]等对不同居群大青叶药材的理化特
征差异进行研究,结果表明异地栽培的不同居群大青叶药材
的酸性提取部位的化学成分及含量有显著差异, 依据电泳图
特征峰的迁移时间和峰面积,能有效地鉴别不同居群大青叶
药材。马晓强[3]等对萱草、黄花菜、红花、番红花等 4 种药材
·274· 中草药 Chinese T raditional and Herbal Drug s 2002 年第 33卷第 3期
收稿日期: 2001-08-13基金项目:北京市自然科学基金项目( 2972003)作者简介:叶能胜( 1975-) ,男,湖北蕲春人,在读硕士研究生,主要从事天然药物中有效成分的高效毛细管电泳分析研究。
Tel: ( 010) 68902854
中的水溶性成分进行定性分析, 结果显示种间有明显的差
别, 认为方法速度快, 灵敏度高,重现性好, 可作为“红花”类
药材的定性鉴别方法。纪秀红[ 18]等发现枸骨叶与十大功劳
叶的紫外-可见光谱有明显区别,可用此方法鉴别枸骨叶与
十大功劳叶 ,通过 HPCE 法证实两者间紫外-可见光谱的差
异是由于化学成分的含量及其比例不同所致。王德先[ 19]等
对中药天麻及其 4 种常见伪品商陆、黄精、天花粉和十九股
牛进行了鉴别,发现伪品均不存在天麻素, 方法简便可行。
表 1 蛋白多肽 HPCE 指纹鉴别天然药材的条件和方法
药 材 检测成分 运行缓冲液
( mmol / L)
毛细管柱
( cm×m)
电 压
( kV)
检测方式
( nm)
文 献
同属不同种菟丝子 酸溶蛋白、碱溶蛋白、
T ris-甘氨酸提取蛋白
pH 8. 5硼酸盐 300 57×75 30 200 4
12种海马、海龙类药材 大孔树脂提取蛋白质 pH 3. 5磷酸盐 50 20×20 11 200 5
红曲 水溶性蛋白 pH 9. 11硼酸盐 20 57×75 20 214 6
蝎毒 水溶性蛋白质 pH 6. 0磷酸盐 25 — 20 DAD * 检测 7
云芝糖肽 水溶性提取物 pH 9. 3硼酸盐 20或
pH 2. 5磷酸盐 50
50×75 30 DAD检测
全波长扫描
8
生药狗脊、药材狗脊、黑狗
脊和龙眼肉及其混淆品
酸溶蛋白、碱溶蛋白、
T ris-甘氨酸提取蛋白
pH 8. 5硼酸盐 300 60×75 20 200 9, 11
榧子,三七及其混淆品菊叶
三七, 宁夏枸杞子与枸杞
子
酸溶蛋白、碱溶蛋白、
T ris-甘氨酸提取蛋白
pH 8. 5硼酸盐 150 60×75 20 200 10, 13,
14, 16
乌梅与混淆品李子和紫苏
子及其混淆品
酸溶蛋白、碱溶蛋白、
T ris-甘氨酸提取蛋白
pH 8. 5硼酸盐 30 60×75 20 200 12, 17
娑罗子 酸溶蛋白 pH 8. 5硼酸盐 20 49×50 30 200 15
* DAD:二极管阵列检测器
值得注意的是,天然药物中成分复杂多样化, 小到阴阳
离子,大到多糖、蛋白质, 应用 HPCE 技术可以对其中已知
成分同时进行分析[ 20] , 但是如果样品处理过程中可能将多
数未知成分除去, 图谱中所含峰数较少,缺乏特征性,就不能
作为其指纹图谱鉴别天然药物。
3 存在的问题和应用前景
HPCE 指纹图谱分析中存在的不足之处主要是重现性
差,降低了 HPCE 在药物指纹鉴别的可靠性。因此在指纹鉴
别过程中, 必须提供标准样品才能对待检样品进行指纹鉴
别,在某种程度上限制了 HPCE 指纹鉴别的广泛应用。王天
松[ 21]提出在开发检测指纹图谱时, 最好同时试验 HPCE 和
HPLC,择其优者。针对重现性差的问题, 谢莹[22]等提出采用
淌度比法、对照品校正法、保留指数法等 3 种方法来提高
HPCE 的重现性。
真正实现对天然药物的快速指纹鉴别,必须建立不同品
种药材的标准指纹图谱库和数据库。标准指纹图谱库的建立
需要结合不同的分析手段, 包括相关生物技术和化学计量学
中的人工神经网络技术等。标准指纹图谱库和数据库的建立
在天然药物的指纹鉴别和中药制剂的质量控制中将会发挥
十分重要的作用。
参考文献:
[ 1] 汪仁望,吕 扬 . 现代中药鉴定方法研究进展[ J] . 中国中药
杂志, 1998, 23( 12) : 757-759.
[ 2] 王 寅,乔传卓,尹 茶 . 高效毛细管电泳法用于不同居群大
青叶药材的鉴别[ J ] . 中草药, 2000, 31( 7) : 547-549.
[ 3] 马晓强,董婷霞,詹华强 .“红花”类药材的高效毛血管电泳法
鉴别[ J] . 药学实践杂志, 2000, 18( 5) : 310-311.
[ 4] 胡 平,罗国安, 王如羁,等 . 中药菟丝子的高效毛细管电泳
法鉴别[ J] . 药学学报, 1997, 32( 7) : 549-552.
[ 5] 张朝辉,范国荣,徐国钧,等 . 12种海马、海龙类药材高效毛细
管电泳法鉴别[ J ] . 中国中药杂志, 1998, 23( 5) : 259-260.
[ 6] 邢旺兴,尹 茶,宓鹤鸣,等 . 中药红曲基原真菌的高效毛细管
电泳色谱法鉴别[ J] . 第二军医大学学报, 2000, 21( 1) : 59-61.
[ 7] 孙保国,张宗显,赵 辉, 等 . 一种新的鉴别蝎毒的方法[ J ] .
食品理化检验, 1999, ( 1) : 11-14.
[ 8] 朱丽玢, 洪筱坤 . 云芝糖肽高效毛细管电泳分析[ J ] . 中药
材, 2000, 23( 4) : 227-229.
[ 9] 许重远,陈振德,刘建武,等 . 狗脊及其混淆品蛋白多肽高效
毛细管电泳法鉴别[ J ] . 中药材, 1999, 22( 7) : 337-338.
[ 10] 陈振德,陈志良,侯连兵,等 . 榧子蛋白高效毛细管电泳法鉴
别[ J] .中草药, 2000, 31( 5) : 377-379.
[ 11] 谢 立,陈振德,陈志良,等 . 龙眼肉及其混淆蛋白多肽高效
毛细管电泳法鉴别[ J ] . 中成药, 2000, 22( 6) : 436-437.
[ 12] 贾江滨,陈振德,侯连兵,等 . 乌梅及其混淆品李子的蛋白多
肽高效毛细管电泳法鉴别[ J] . 第一军医大学学报, 2000, 20
( 4) : S24-S25.
[ 13] 侯连兵,陈振德,陈志良,等 . 三七及其混淆品蛋白多肽高效
毛细管电泳法鉴别[ J ] . 中草药, 2000, 31( 11) : 859-860.
[14] 侯连兵,陈振德,单友亮,等 . 三七及其混淆品菊叶三七的蛋白
多肽高效毛细管电泳鉴别[ J] . 中药材, 2000, 23( 2) : 76-77.
[15] 张 新,王志伟,王 珍, 等 . 高效毛细管电泳-聚类分析法鉴
别娑罗子品种[ J] . 天然产物研究与开发, 2000, 12( 5) : 31-33.
[ 16] 陈志良,陈振德,侯连兵,等 . 枸杞子蛋白多肽的高效毛细管
电泳法鉴别[ J ] . 中国药学杂志, 2001, 36( 3) : 192-194.
[ 17] 杨西晓,陈振德,许重远,等 . 蛋白多肽高效毛细管电泳法鉴
别紫苏子及其混淆品[ J ] . 中药材, 2000, 23( 10) : 605-607.
[ 18] 纪秀红,阎玉凝,李 奕,等 . 枸骨叶与十大功劳叶紫外光谱
鉴别[ J] . 中药材, 2000, 23( 3) : 137-139.
[ 19] 王德先,杨更亮,刘海光,等 . 天麻及其伪品的毛细管电泳鉴
别及天麻素的测定[ J ] . 中草药, 2001, 32( 4) : 351-352.
[ 20] 叶能胜,王英锋,邹 洪,等 . 毛细管电泳技术及其在天然药
物分析中的应用进展 [ J] . 中国中药杂志, 2000, 25(增刊) :
53-57.
[ 21] 王天松 . 毛细管电泳与中草药指纹图谱[ J ] . 中成药, 2000,
22( 6) : 397-399.
[ 22] 谢 莹,林 梅,张正行,等 . 提高毛细管电泳重现性的几种
方法[ J] . 药学进展, 1999, 23(5) : 261-264.
·275·中草药 Chinese T raditional and Herbal Drug s 2002 年第 33卷第 3期