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收稿日期: 2011-11-16
基金项目: 安徽省自然科学研究项目（2006 KJ 207B）资助。
作者简介: 唐燕平，女，高级实验师。E-mail：typoyy@ahau.edu.cn
安徽农业大学学报, 2012, 39(5): 807-811
Journal of Anhui Agricultural University
网络出版时间：2012-8-27 12:02:11
[URL] http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1162.S.20120827.1202.022.html
不同枫树叶片中酚酸类物质高效毛细管电泳检测方法的研究
唐燕平 1，刘桂华 1，沈虎琴 2，田春秋 2
(1. 安徽农业大学林学与园林学院，合肥 230036；2. 安徽农业大学茶与食品科技学院，合肥 230036)
摘 要：采用正交试验的方法，研究了缓冲液 pH、分离电压、运行温度等电泳参数对枫树叶片中酚酸类物质
提取检测的影响，建立了 4 种槭树科枫叶中绿原酸、原儿茶酸、没食子酸和咖啡酸 4 种酚酸类化合物检测分离的高
效毛细管电泳（HPCE）方法。得出了最佳分离条件为：紫外检测波长 214 nm，缓冲液为 20 mmol·L-1的磷酸-硼砂，
pH 8.0，电压为 22 kV，温度 25℃。在此条件下，4 种酚酸类化合物在 9 min 内完全分离，且各组分浓度与峰面积
呈良好的线性关系，r2 为 0.974 8～0.996 5。迁移时间的 RSD≤0.84%，峰面积的 RSD≤5.29%，加标回收率为
80.38%～96.88%。4 种枫树叶片中均含有绿原酸，其中蚜虫宿主三角枫中绿原酸含量最低。
关键词：HPCE；同时分离；酚酸类；枫叶
中图分类号：Q946.8 文献标识码：A 文章编号：1672352X (2012)05080705
Determination of phenolic acids in different maple leaves
by high-performance capillary electrophoresis
TANG Yan-ping1, LIU Gui-hua1, SHEN Hu-qin2, TIAN Chun-qiu2
(1. School of Forestry and Landscape Architecture, Auhui Agricultural University, Hefei 230036;
2. School of Tea & Food Science and Technology, Anhui Agricultural University, Hefei 230036)
Abstract: In this paper, the effects of main parameters such as running buffer pH value, running voltage and
column temperature on the extraction and detection of phenolic compounds from aceraceae leaves were investi-
gated by orthogonal tests. A method was developed for the simultaneous determination of phenolic compounds in
aceraceae maple leaves, including chlorogenic acid, protocatechuic acid, gallic acid, caffeic acid by high per-
formance capillary electrophoresis (HPCE). At the condition of 20 mmol·L-1 potassium dihydrogen phos-
phate-borax buffer solution (pH 8.0), separation voltage of 22 kV, temperature of 25°C, UV detection wavelength
of 214 nm, the four phenolic acid compounds were rapidly separated in 9 min. The calibration curves showed
good linearity and the correlation coefficients were 0.974 8~0.996 5. Migration time,RSD ≤ 0.84%, and peak area
RSD ≤ 5.29%. The average recoveries were from 80.38% to 96.88%. Chlorogenic acid could be detected in the
four kinds of maple leaves, and the content in buerger maple which is the host of aphid was the least.
Key words: high performance capillary electrophoresis; simultaneous separation; phenolic acids
酚酸类化合物属于植物次生代谢产物，在植物
中广泛分布，主要协助植物防御病原等有害生物的
侵害。主要有绿原酸(chlorogenic acid)、原儿茶酸
(protocatechuic acid)、没食子酸(gallic acid)和咖啡酸
(caffeic acid)等。
目前，在酚酸类物质的分离测定方面，国内外
主要有高效液相色谱（HPLC） [1-3]，液质联用
（LC-MS） [4-5]等方法，但 HPLC、LC-MS 需要较
多的流动相，分析时间长，成本高。高效毛细管电
泳技术（HPCE）是近几年来发展迅速的一项分析
技术，具有高灵敏度、高分辨率、分析时间快、自
动化程度高等优点[6-7]，可以满足许多复杂成分的分
析要求[8]，已成为 20 世纪 90 年代以来发展最快的
分析方法之一[9-10]。本研究采用高效毛细管电泳法
同时对绿原酸、咖啡酸、没食子酸和原儿茶酸 4 种
酚酸类物质进行分离，研究了电压、pH 值、温度等
DOI:10.13610/j.cnki.1672-352x.2012.05.031
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电泳参数对分离的影响，并分析了 4 种枫叶（红枫、
三角枫、元宝枫和鸡爪槭）中 4 种酚酸类化合物的
含量，得到较为满意的分离、检测结果。
1 材料与方法
1.1 标样与试剂
标准品：绿原酸、原儿茶酸、没食子酸和咖啡
酸均购于中国药品生物制品检定所（纯度〉99%）。
试剂：超纯水；甲醇(色谱纯)；四硼酸钠（分
析纯）；磷酸二氢钾(分析纯)。
1.2 仪器
MDQ 型高效毛细管电泳仪（美国 BeckMan
Coulter）；毛细管：内径为 50 μm、长度 50 cm、有
效长度 48 cm（河北永年仪器厂）；SB25-12D 超声
波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；
ANKE TGL-16C 台式离心机（上海安亭科学仪器
厂）；PHS-3C 精密 PH 计（上海雷磁）；ALC-110.4
电子分析天平(ACCVLAB)。
1.3 标准样品的配制
1.3.1 标准储备液的配制 准确称取绿原酸、没食
子酸、咖啡酸、原儿茶酸各 5.00 mg，分别用 80%
甲醇溶解定容至 5 mL，配制成 1.0 mg·mL-1 绿原酸、
没食子酸、咖啡酸、原儿茶酸标准储备液，备用。
1.3.2 混合标准工作液的配制 准确量取绿原酸、
没食子酸、咖啡酸及原儿茶酸储备液 1 mL，混合配
置成混合母液 200 μg·mL-1，再将混合母液用 80%甲
醇稀释得到 6 个浓度梯，100、75、50、25、12.5
和 6.25 μg·mL-1，置于冰箱中备用。
1.4 样品制备
红枫、三角枫、元宝枫和鸡爪槭叶片均采自安
徽农业大学校内，采后的样品擦洗干净后置入保鲜
袋中，于冰箱冷藏室保存备用。
准确称取红枫、三角枫、鸡爪槭和元宝枫叶片
各 1.00 g，剪碎后放于研钵中，加入 8 mL 80%的甲
醇混合研磨，并将研磨碎的样品转移至离心管中，
超声提取 20 min，离心 10 min (10 000 r·min-1)，取
上清液用 0.22 μm 的微孔滤膜过滤，放入冰箱备用。
1.5 电泳方法
电泳缓冲液为 20 mmol·L-1 的磷酸-硼砂缓冲溶
液（pH 8.0）、温度 25℃、电压为 22 kV。2 次进样
之间依次用 0.1 mol·L-1 氢氧化钠溶液、水、缓冲液
洗洗 3 min。毛细管在每次使用之前先用 0.1 mol·L-1
氢氧化钠溶液、水、缓冲液各清洗 10 min。
2 结果与分析
2.1 检测波长的确定
图 1 为 4 种酚酸类物质在 190～300 nm 紫外扫
描图。结果表明，绿原酸的最大吸收波长为 200~214
nm；没食子酸的最大吸收波长为 200~220 nm；原
儿茶酸与咖啡酸在 200~220 nm 均有较大吸收。综
合考虑各因素，选择用 214 nm 作为最佳检测波长。
1.咖啡酸；2.原儿茶酸；3.没食子酸；4.绿原酸。下同
1. Caffeic acid; 2. Protocatechuic acid; 3. Gallic acid; 4.
Chlorogenic acid. The same below
图 1 4 种酚酸类物质的紫外光谱图
Figure 1 Ultraviolet spectrogram of 4 phenolic compounds
图 2 缓冲液的 pH 值对 4 种酚酸类物质分离度的影响
Figure 2 Effects of pH value on resolution of 4 phenolic
compounds
2.2 电泳分离条件的优化
2.2.1 电泳缓冲液类型的选择 在相同的离子浓度
条件下，比较了磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、磷
酸-硼砂缓冲体系。分析结果表明，磷酸盐缓冲液和
硼酸盐缓冲液分离效果较差，迁移时间较长, 峰拖
尾明显，4 组分不能完全分离，而磷酸-硼砂盐缓冲
液体系分离效果较好。实验选择磷酸-硼砂盐缓冲液
作为分离缓冲液。
2.2.2 电泳缓冲液离子浓度的选择 试验选择了
10、20、30、40 mmol·L-1 4 个离子浓度的磷酸-硼砂
缓冲体系。结果表明，缓冲液离子浓度对峰形和迁
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移时间有一定的影响，但影响不明显，故选定 20
mmol·L-1 的磷酸-硼砂缓冲溶液为分析条件。
图 3 分离电压对 4 种酚酸类物质分离度的影响
Figure 3 Effects of separation voltage on resolution of 4
phenolic compounds
2.2.3 缓冲液 pH 对分离的影响 pH 是影响分离的
因素之一。在离子浓度为 20 mmol·L-1 的磷酸-硼砂
缓冲溶液条件下，考察了 pH 为 7.4 、7.6、7.8、8.0、
8.2、8.4 对 4 组分分离度的影响，结果见图 2。当
pH 为 7.8、8.0 和 8.2 时，相邻两物质之间的分离度
均达到 1.2 以上。因此选择 pH 作为正交试验因子。
2.2.4 电压对分离的影响 本试验考察了分离电压
在 18~24 kV 围内对 4 种物质分离度的影响，结果见
图 5。当分离电压为 22 kV 时，相邻两物质之间的
分离度均达到 1.5 以上。所以试验选择分离电压, 20
kV 、22 kV 和 24 kV 为正交试验因子。
2.2.5 分离温度的选择 温度变化不仅影响分离的
重现性，而且影响分离的效率。综合考虑各方面的
因素，选择 20℃、22℃、25℃作为正交试验因子。
2.3 正交试验
为了进一步优化最佳分离分析条件，将缓冲液
pH (7.8、8.0、8.2)、电压（20 kV、22 kV、24 kV）
和温度（20℃、22℃、25℃），为 3 个因素，每个因
素选取 3 个水平，即 3 因素 3 平正交试验确立最佳
的毛细管电泳分离条件（见表 1）。
表 1 正交试验 L9（33）
Table 1 The list of L9（33）orthogonal experiment
编号
No. pH
电压
Voltage
温度
Temperature
绿原酸-原儿
茶酸分离度
Resolution of
chlorogenic acid
and protocatechuic acid
原儿茶酸-没食
子酸分离度
Resolution of
protocatechuic
acid and gallic acid
没食子酸-咖啡
酸分离度
Resolution of
gallic acid and
caffeic acid
迁移时间/min
Migration time
1 7.8 20 20 4.17 1.39 1.49 11.21
2 7.8 22 22 4.31 1.34 1.33 10.37
3 7.8 24 25 4.56 1.38 1.17 8.44
4 8.0 20 22 6.08 1.28 2.01 10.80
5 8.0 22 25 5.49 1.89 2.13 8.60
6 8.0 24 20 5.44 1.52 2.09 9.54
7 8.2 20 25 7.06 2.27 1.88 10.34
8 8.2 22 20 5.56 1.41 1.75 9.97
9 8.2 24 22 5.12 1.08 1.10 8.01
图 4 最佳优化条件电泳
Figure 4 Optimum condition for gel electrophoresis
由表 1 可得出试验 5 为最佳电泳分离条件：20
mmol·L-1 的磷酸-硼砂缓冲溶液 pH 8.0、分离电压为
22 kV、分离温度 25℃，结果见图 4。
2.4 研究方法的评估
2.4.1 精密度 在最优电泳条件下，将 80 μg·mL-1
的混合标准溶液重复进样 5 次，考察各组分的校正
峰面积和迁移时间的重复性(见表 2)。结果表明，4
种酚酸的峰面积 RSD≤5.29%，迁移时间的 RSD≤
0.84%。
2.4.2 准确度 准确度实验采用添加回收率法进行
试验。分别称取 2 份平行样品，于其中 1 份加入标
准品，按本法对这 2 份样品同时进行测定，实测添
加量与标准添加量之比为回收率。通过实验，测得
回收率在 80.38%～96.88%之间（见表 3）。
2.4.3 线性关系 如表 4 所示，在选定的条件下，
810 安 徽 农 业 大 学 学 报 2012 年
将混合标准样品稀释为 6 个浓度梯度，在最佳的电
泳条件下进行 HPCE 测定，以浓度为横坐标，峰面
积为纵坐标来进行回归处理。结果表明，4 种酚酸
的相关系数均 0.974 8～0.996 5。
表 2 精密度试验
Table 2 Analsis of accuracy
组分 Element 峰面积 RSD/% Peak area 迁移时间 RSD/% Migration time
绿原酸 Chlorogenic acid 5.29 0.07
原儿茶酸 Protocatechuic acid 2.50 0.59
没食子酸 Gallic acid 2.76 0.84
咖啡酸 Caffeic acid 4.16 0.58
表 3 方法的回收率
Table 3 Recovery of method for determination of HPCE
组分
Element
添加量/μg
Additive amount
实测添加量/μg
Determined amount
回收率/%
Recovery
绿原酸 Chlorogenic acid 25 20.525 3 82.10
原儿茶酸 Protocatechuic acid 25 24.217 9 96.87
没食子酸 Gallic acid 25 20.095 0 80.38
咖啡酸 Caffeic acid 25 24.220 7 96.88
表 4 线性范围和回归方程
Table 4 Regression equation and linear range
组分
Element
线性范围/μg·mL-1
Linear range
线性方程
Regression equation
相关系数
R2
绿原酸 Chlorogenic acid 6.25～100 y=533.05 x + 3 468.9 0.981 5
原儿茶酸 Protocatechuic acid 6.25～100 y=2701.8 x + 13 709 0.996 5
没食子酸 Gallic acid 6.25～100 y=3604 x + 30 104 0.976 9
咖啡酸 Caffeic acid 6.25～100 y=3751.5 x + 30 608 0.974 8
图 5 样品分离色谱图
Figure 5 Separation of the sample chromatogram
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表 5 各样品中 4 种酚酸类化合物含量
Table 5 Contents of four phenolic compounds in samples μg·g-1
树种
Trees
绿原酸
Chlorogenic acid
原儿茶酸
Protocatechuic acid
没食子酸
Gallic acid
咖啡酸
Caffeic acid
红枫 Red maple 4 084.84
三角枫 Trident maple 1 303.62 39.94
元宝枫 Purpleblow maple 2 837.66 3 242.88 577.85
鸡爪槭 Japanese maple 4 911.53 43.32 34.66
2.5 样品的测定
在最佳分离条件下，将按 1.5 处理好的样品经
高效毛细管电泳分离并测定其含量，测定结果如图
5 及表 5。结果表明，4 种枫叶中均含有绿原酸，其
中红枫和鸡爪槭中绿原酸含量大于 4 000 μg·g-1，蚜
虫宿主三角枫中绿原酸含量最低为 1 303.62 μg·g-1；
原儿茶酸可在元宝枫枫叶中检出，含量大于 3 000
μg·g-1；没食子酸可在元宝枫和鸡爪槭中检出，含量
较少；咖啡酸可在三角枫和鸡爪槭中检出，但含量
较低。
3 结论
采用正交试验的方法，研究了缓冲液 pH、分离
电压、运行温度等电泳参数对叶片中酚酸类物质提
取检测的影响，建立了高效毛细管电泳分离测定枫
叶中绿原酸、原儿茶酸、没食子酸、咖啡酸 4 种酚
酸类物质的方法，并检测了它们在红枫、三角枫、
元宝枫和鸡爪槭 4 种枫叶叶片中的含量，检测了 4
种酚酸在蚜虫的寄生宿主三角枫、元宝枫与非宿主
红枫、鸡爪槭中的分布。该方法为同时分离检测枫
叶中多种酚酸类物质提供了一个简便、准确、快速
的检测方法。
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