全 文 ：·综述·
中草药植物细胞工程研究进展
刘　岭

(第二军医大学附属长海医院 中医科 ,上海　 200433)
摘　要: 简要介绍了植物细胞工程各主要分支学科在中草药研究中的应用及其进展情况。包括原生质体培养、单倍
体育种、植物体细胞的种质保存、中草植物细胞培养生产次生产物、植物快速繁殖技术、体细胞胚胎发生和人工种
子等。
关键词: 细胞工程 ;中草药 ;组织培养
中图分类号: R282. 13　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2002) 12 1132 03
Advances in studies on plant cell engineering applied to Chinese herbal medicine
L IU Ling
( Depa rtment o f TCM , Changhai Hospital, Second M ilitary Medical Univ er sity , Shanghai 200433, China )
Key words: cell eng ineering; Chinese herbal medicine; ti ssue cul ture
　　细胞工程是应用细胞生物学的方法 ,按照人们的预想方
案 ,有计划地保存、改变和创造遗传物质的技术 ,亦即在细胞
水平上对生物体进行创造设计。药用植物是我国传统中药的
主要组成部分 ,近年来细胞工程技术在药用植物的研究中得
以广泛的应用 ,并取得了一些进展。
1　原生质体培养
　　植物原生质体即除去细胞壁的裸露植物细胞。 1960年 ,
Cocking采用酶法游离原生质体获得成功 ,至 20世纪 80年
代 ,原生质体培养已成为一个研究热点 ,其中药用植物的原
生质体培养引人注目。 目前 ,药用植物原生质体培养已扩展
到包括夹竹桃科 ( Apocynaceae)、五加科 ( Araliaceae )、紫草
科 ( Bo raginaceae)等以及单子叶植物的天南星科 ( A raceae)
和百合科 ( Liliaceae)的数十种植物 ,我国学者在该领域也进
行了较为深入的研究。盛世红等 [1]在培养防风悬浮细胞的原
生质体过程中 ,发现培养物的继代时间对原生质体产量和活
力有很大影响 ;培养过程中 ,添加不含葡萄糖和任何生长调
节剂的原生质体新鲜培养基能明显促进细胞分裂和细胞团
体积增大 ;通过考察不同的酶组合对防风原生质体游离的影
响 ,认为蜗牛酶能显著促进原生质体游离。 同样是对于伞形
科植物 ,王济玫等 [2]报道了蜗牛酶的参与对前胡原生质体的
游离有着显著的促进作用 ,由于蜗牛酶一般作用于 β -1, 3糖
苷键 ,在伞形科其他植物原生质体游离时 ,蜗牛酶的作用相
似 ,故该实验结果暗示了伞形科植物的细胞壁可能普遍存在
β -1, 3糖苷键的化合物。 周延清等 [3]用决明子叶和下胚轴为
材料 ,游离和培养原生质体 ,培养 4 d后 ,原生质体开始分
裂 , 15 d后其植板率约为 19. 2% , 30 d形成了细胞团或小愈
伤组织。增殖愈伤组织在分化培养基上培养 ,可分化出芽。芽
在生根培养基上培养 14 d生根 ,从而再生决明小植株。研究
还表明: Pectolya ses Y-23是分离原生质体所必需的 ;用含
2, 4-D 0. 4 mg / L (以下单位同 ) , N AA 1. 0与 KT 0. 1的
KM 8P漂浮培养利于原生质体的分裂。李继胜等 [4]从党参下
胚轴愈伤组织中分离原生质体进行液体浅层培养 ,在合适的
条件下 ,原生质体于 6个月后形成小愈伤组织 ,小愈伤组织
通过体细胞胚胎发生途径 ,再生了完整植株。
2　单倍体育种
　　单倍体植物的主要特点是其孢子体细胞的染色体数目
和配子体细胞的染色体数目一致 ,因此可以从其“表型”观察
“基因型”。单倍体植物本身一般并没有实际上的直接应用价
值 ,但单倍体植株仅含一组染色体 ,易于选择 ,因而在育种实
践上有其独特的优势 ,并且常常与其他育种技术相结合。
1964年 , Guha和 Mah eshw ari培养毛叶曼陀罗花药获得了
第一棵单倍体植株。 目前 ,花药培养仍是单倍体育种的重要
技术 ,由此获得的单倍体植株与其二倍体相比 ,生长发育较
弱 ,体形较细小。曹有龙等 [5]采用枸杞花药进行离体培养 ,建
立细胞系 ,诱导植株再生 ,所得到的再生植株矮小 ,生长慢 ,
多白化苗 ,经细胞学鉴定 n= 12,为单倍体植株。花药培养并
非仅能获得单倍体 ,也会出现一定频率的非整倍体、混倍体、
多倍体。沈光华 [6]利用离体培养得到石刁柏 5个品种的花药
植株并对该植株群体进行了倍性鉴定 ,统计结果表明花药培
养植株群体倍性间的变异极为显著: 单倍体仅占 2. 1% ,二
倍体占 67. 0% ,多倍体占 23. 9% ,非整倍体占 6. 4%。杜令阁
等 [7 ]用 M S, B5 , N6 , Miller改良怀特、尼许等 6种基本培养
基 ,加入不同种类和浓度的附加物质培养人参花药 ,连续 4
年得到了花粉植株 ,并建立了体细胞无性系 ,研究认为蔗糖
·1132· 中草药　 Chinese Traditiona l and He rbal Drug s　 2002年第 33卷第 12期
收稿日期: 2002-01-08作者简介:刘　岭 ( 1973-) ,男 ,硕士 ,医师 ,第二军医大学附属长海医院医学硕士毕业 ,主要研究方向为抗肿瘤中药新药研究。
Tel: 021-25070720　　 E-mai l: pt911322@ guomai. sh. cn
是人参花药培养的必需成分 ,低温预处理能明显提高愈伤组
织的诱导效果 ,通过染色体检查 ,观察到愈伤组织和根尖细
胞中单倍体细胞 ( 2n= 24)分别占 53%和 48. 6% ,二倍体、非
整倍体和混倍体占有相当比例。 另外 ,邵启金等 [8]对人参花
药植株再生及无性系建立亦进行了类似研究 ,认为 N6 ,
Heller培养基诱导效果较好 , GA和 LH有利于人参花药愈
伤组织的分化。
3　植物体细胞的种质保存
　　植物体细胞全能性的发现和证实 ,不仅为植物组织细胞
的培养工作、细胞工程和基因工程开辟了广阔前景 ,也为植
物的种质保存开辟了新的途径。许多植物的组织培养物在液
氮中超低温保存以后 ,仍能保持相当高的存活率 ,并且能再
生出新植株和保持原来的遗传特性。陈士云等 [9]对新疆紫草
的愈伤组织进行超低温保存研究 ,发现经超低温处理后的愈
伤组织生长虽然受到一定程度的抑制 ,但能够恢复正常生
长。 其酯酶与过氧化物同工酶酶谱未见显著变化。 张治国
等 [10]将铁皮石斛种子经不同时间脱水处理后投入液氮中保
存 ,通过再培养试验考察影响超低温保存的一些主要因素 ,
种子含水量降到 8% ～ 18% ,直接投入液氮中 ,经保存后 , 40
℃水浴上快速解冻 ,种子萌发率为 92% ～ 95% ,与未经冷冻
的种子的萌发率一致 ,并生长成正常植株。苏新等 [11]研究浙
贝母愈伤组织的超低温保存方法 ,认为较好的冷冻保护剂是
10%甲基亚矾+ 5%甘油 ,以 1℃～ 5℃ /min的速度降温 ,从
0℃降至- 18℃ ,保留 1 h,再降到- 40℃ ,停留 2 h,投入液
氮中贮存 ,解冻时以 40℃水浴迅速化冻效果较好 ,能成功地
得到增殖及再生植株。
4　中药植物细胞培养生产次生产物
　　自 Bonner报道了银胶菊植物组织培养物能产生橡胶以
来 ,以组织培养技术生产植物次生产物方面已获得了很大成
就。 迄今为止 ,已经研究过的 400多种植物的细胞培养可以
产生超过 600种的成分 ,其中 ,具有药用价值的成分占了相
当比例 ,许多重要的药用植物如紫草、人参、黄连、毛地黄、长
春花、西洋参等细胞培养都十分成功 ,有些已实现工业化生
产。 在我国 ,对于人参中人参皂苷的生物合成方面的研究较
为深入。 刘长军等 [12]利用不同的真菌诱导子处理悬浮培养
的人参细胞 ,发现尖孢镰刀菌培养液、黑曲霉、剌盘孢菌菌丝
体壁表现出较高的诱导活性 ,均使人参细胞皂苷含量比对照
提高了 30%以上。另外 ,诱导子处理改变了人参皂苷的积累
时程 ,使人参细胞皂苷积累高峰的出现提前 ,并促进细胞培
养物中次生产物的外泌 ,同时增强细胞对蔗糖的摄取 ,吸收。
随着外源基因转化技术的成熟 ,利用根癌农杆菌和发根
农杆菌的 Ti-质粒和 Ri-质粒转化后的冠瘿组织和毛状根作
为培养系统来生产有用的植物活性成分是当今植物生物技
术研究的热点之一。 张荫麟等 [13 ]用发根农杆菌 15834,
LBA9402株和根癌农杆菌 C58株感染丹参无菌苗 ,诱导出毛
状根和冠瘿瘤 ,使其在无激素培养基及光照条件下分化出丹
参再生植株 ,以发根农杆菌转化的再生植株具典型毛状再生
植物的特征 ,根癌农杆菌转化的再生植株株形高大 ,根系发
达 ,丹参酮含量高于原植物。 发根农杆菌的 Ri-质粒中 T-
DNA转化并整合到植物细胞核基因组中而诱导产生的发根
具有激素自主型生长特点 ,并保持原植物次生代谢物合成能
力 ,常用于生产中药植物有效成分的研究。常振战等 [14]以发
根农杆菌 9402菌株转化天山大黄 ,建立了发根离体培养系 ,
以 HPLC法测定天山大黄发根中多种蒽醌类成分 ,其中大
黄酸、芦荟大黄素、大黄素、大黄酚-8-甲醚的含量均高于对
照生药。 蔡国琴等 [15]用发根农杆菌转化青蒿并建立了青蒿
发根体外培养系统 ,通过检测不同理化因子对发根生长及青
蒿素含量的影响 ,结果发现: 光照有利于次生产物青蒿素的
积累 ;当蔗糖浓度为 3% 、培养基 p H值偏酸性时 ,不仅促进
发根生长 ,而且促进青蒿素的合成 ;低浓度 NAA对发根生
长具促进作用 ,但抑制青蒿素的合成 ;赤霉素 GA3对发根生
长及青蒿素的合成都有促进作用。此外 ,黄炼栋等 [16]还研究
了不同发根农杆菌菌株对小蔓长春花、穿心莲、刺果甘草等
6种药用植物发状根形成的作用。
近年来 ,有关培养基 p H值变化对培养细胞次生产物的
产出影响方面的研究也较广泛。 常振战等 [17 ]用生物反应器
培养决明发根 ,并通过连续观察培养基 p H值变化和连续测
量培养基中游离蒽醌的含量 ,认为培养基 p H值变化在一定
程度上反映了反应器中游离蒽醌的合成情况。 许建峰等 [18]
报道了在高山红景天细胞悬浮培养过程中 ,降低培养基 pH
值能有效地诱导培养细胞中红景天苷的胞外释放 ,通过对红
景天苷释放机制的探讨 ,认为红景天苷的跨膜运输是一个与
H+ 对运的动态过程 ,因而培养基 pH值决定了红景天苷在
胞内外含量的分布。
5　植物快速繁殖技术
　　在植物生物技术领域里 ,植物快速繁殖技术在生产上具
有极大的应用潜力。欧美国家试管苗的年产量均在数千万株
以上 ,且以每年 7% ～ 8%的速度增加。 近年来 ,在我国关于
药用植物的快速繁殖技术应用的报道越来越多。 周延清 [19]
研究了不同激素组合对芫荽腋芽再生植株与快速繁殖的影
响 ,结果表明合适配比的激素组合对愈伤组织诱导芽的分化
和快速繁殖均有增效作用。 高山林等 [20]对徐长卿组织培养
快速繁殖的试验表明 , N AA诱导愈伤组织的效果优于 IAA,
而 IAA较适于诱导丛生芽 , BA浓度有较明显的协同作用。
中等浓度的激素和中等浓度的生长素配合较适于诱导植物
细胞脱分化产生大量愈伤组织 ,而较高浓度的激素和较低浓
度的生长素配组较适于诱导植物分化产生丛生芽和小苗 ,生
根则只需单一添加中等以下浓度的生长素即可取得较佳的
效果。 杨联河等 [21]采用曲茎石斛的种子苗与茎段外植体苗
不同培养基的双向培养 ,并对二者生长特点进行比较 ,发现
外植体苗繁殖快 ,粗壮 ,但需植株量大 ,种子苗生长周期长 ,
细弱 ,但培养基数高 ,认为二者结合培养对快速繁殖 ,提高成
活率有利。曾宋君等 [22]还对铁皮石斛、美花石斛、无距石斛、
广东石斛的种胚和茎尖进行离体培养和快速繁殖 ,此外 ,佟
宏霞等 [23 ]建立了由栝楼腋芽→丛生芽→无根试管苗→再生
根→再生完整植物→试管苗移栽成活的一套栝楼试管苗快
·1133·中草药　 Chinese Traditiona l and He rbal Drug s　 2002年第 33卷第 12期
速繁殖体系。刘玉红等 [24 ]报道了太白贝母的快速繁殖技术 ,
经测定 ,其愈伤组织与再生鳞茎中大多数人体所需常量和微
量元素的含量超过了栽培鳞茎。
6　体细胞胚胎发生和人工种子
　　体细胞胚胎发生是植物组织培养中形态建成的重要途
径之一。 通过体细胞胚胎发生途径形成再生植株的过程 ,不
仅能充分说明植物细胞的“全能性” ,而且还由于其具有繁殖
速度快 ,繁殖系数高 ,染色体稳定以及单细胞起源等特点而
受到普遍关注。 尹东等 [25 ]以虎眼万年青子鳞茎的鳞叶为外
植体 ,不经过愈伤组织阶段 ,直接诱导体细胞胚发生并再生
植株。其体细胞胚形态学发育过程与合子胚相似。实验还观
察到直接体细胞胚只产生与鳞叶的近轴面 ,而远轴面无体细
胞胚产生。 Asaka等 [26 ]将经过适当高温处理过的人参胚性
组织培养在高糖浓度 ( 100 g /L)的培养基 ( M S)上 ,产生了大
量的人参胚状体 ,其数量是常规蔗糖浓度 ( 30 g /L )所产生的
10倍左右 ,葡萄糖与蔗糖具有相似的效应而甘露糖则无 ,将
高糖浓度培养基上产生的人参胚状体培养在常规蔗糖浓度
的培养基上可再分化成正常的小植株。 郝建平等 [27]对茴香
胚状体发生的过程和组织细胞学特点进行了观察与描述 ,发
现茴香胚状体的发育过程与合子胚基本相同 ,即由原胚形成
的球形胚经过心形胚和鱼雷胚期最终发育成为子叶胚 ,研究
还发现 ,细胞内淀粉粒的消长动态反映了胚状体发育阶段的
转折和变化。
随着越来越多的植物被发现能够诱导产生大量胚状体 ,
1978年 , Murashig e首次提出“人工种子”的概念。所谓“人工
种子”就是由体细胞胚 (胚状体 )加上保护性外壳 (人工种皮 )
及提供发育的营养 (人工胚乳 )组成的代替天然种子传播的
一种结构。“人工种子”为包括药用植物在内的许多经济作物
的育种和良种快速繁殖开辟了广阔的应用前景 ,但目前的研
究还以实验室阶段为主。郭顺星等 [28]以原球茎为材料 ,建立
了铁皮石斛人工种子的初步制作流程 ,通过比较 ,认为以改
良 1 /2 M S培养基附加蔗糖组成的人工胚乳可使人工种子
的存活率、发芽率达到最佳水平 ,而且成苗整齐。 而桂进
等 [29]在诱导三七体细胞胚发生的实验中发现以 IAA、 N AA
代替 2, 4-D对三七体细胞胚的诱导和分化有更好的效果 ,将
该体细胞胚用 4%海藻酸钠和 2%氯化钙进行人工种皮包埋
后 ,在无菌条件下 ,人工种子可转化成苗 ,转化率达 89. 7%。
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