全 文 ：中草药C h i ne e s Tr a di tio n al an dHe r baD l r ug s 20 0 0年第 1 3卷第 1 2期 5 1 9
只àOJ 0 11,口几a日任ǐ乃ēb厅才父ùQónù1,JA急币h16乃é01八乙
,上11儿.通10心夕一ù9曰八乙n`O2甘,d。J
3 药理学与临床研究
近期对香茶菜属中二菇类和黄酮类化合物有许
多药理研究报道 , 而以前者为多 ,如抗菌 、 抗炎 、 抗病
毒作用 巨, ` , 2 2」、 抗 肿瘤 作用 〔, 3〕 、 护肝作 用巨2` 〕 、 对平 滑
肌比 , 2司和心血管z7[ 」作用等 。 尤其值得一提的是卢长
安等吻〕作 了山地香茶菜提 取物对艾滋病病毒 1 型
( H I V
一
l) 的实验研究 ,表 明它对 H IV 一 1 有一定的抑
制作用 。 对于溪黄草能否按照此思路进一步做一些
药理研究 , 至今见诸报道 的很少 。 廖雪芬等 〕 〕用线
纹香茶菜 、 狭基线纹香茶菜 、 溪黄草 的水提取物作 了
一些药理实验 , 结果表明三者均能抑制二 甲苯致小
鼠耳部炎症反应 ,降低 C CI 、引起小 鼠肝损伤后血清
谷丙转 氨酶 ( S G P T )升高 的作用 , 而狭基线纹香茶
菜和溪黄草的提取物能对抗醋酸所致小鼠腹腔毛细
管通透性作用 ,说明三者都具有消炎利肝的作用 。 临
床上 , 线纹香茶菜因清热利湿褪黄等功效 ,故广泛作
为消炎利胆片 、 复方胆通片等中成药的主要原料 。 近
期有报道用溪黄草治疗急性黄疽型肝炎 3 0 例 30[ 〕 ,
用溪黄草与白花蛇舌草 、 虎杖 、 丹参等制成制剂治疗
乙肝 68 例 (有效率 84 % )[ 川 ,用溪黄草与其他药制
成 “ 炎瘤宁栓剂 , 等 ) 〕 。
4 小结
综上所述 ,溪黄草来源为香茶菜属植物线纹香
茶菜 ,今后应在分清与其他 同属植物区别的基础上 ,
结合现代分析技术 ,加强对其化学成分的研究 , 重点
是二枯类和黄酮类 。 而药理学方面应参考 同属其他
品种的研究 , 着重在消炎 、 护肝及抗肿瘤方面 , 以其
开发出更确切有效的医药产品 。
参 考 文 献
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( 2 0 0 0
一
0 4
一
0 7 收稿 )
中药材 D N A 分子标记研究的技术问题
1
. 植物药基因组 D N A 的提取
北京中医药大学 ( 1 0 0 0 2 9) 郭宝林 ` 李家实 阎玉凝
摘 要 随着 D N A 分子标记技术在中药中的广泛应用 , 快速有效地将材料中的 D N A 提取出来成为研究 的关键
步骤 。 综述了 90 年代以来文献报道的针对提取过程中出现的各种 问题所采取的相应措施 , 主要涉及如何去除提取
材料中的酚类和多糖类杂质 。
关键 词 D N A 分子标记 基因组 D N A 提取 多糖 酚类
D N A 分子标记应用于中药资源 、 鉴定 、 栽培等 方面有着很好 的发展前景 , 目前研究报道正 日益增
公
A d d r e s s
:
G u o aB
o li n B e i zi n g U n i v e r s i t y o f T C M
,
B e i si n g
郭宝林 医学博士 , 副研究员 , 现为北京中医药大学博士后 。 研究方向为药用植物 (中药 )的分类 、 资源和质量评价 ;分子生物学在中药中的应用是 目前的主要研究内容 。 研究对象曾涉及淫羊蕾 、 珍珠菜 、 牡丹 、 芍药 、 厚朴及金丝桃等 ,发表论文近 40 篇 , 现承担 多项 国家级和部级研究课题 。
一
9 5 2
-中草药 hCin e es Tr ad i ti on al an d Hr e b al Dr ug s 20 0 0年第 3 1卷第 2 2期
多 。一般来说 ,该技术涉及 的分子生物学原理 比较简
单 , 实验方法也不复杂 ,但熟练掌握 ,灵活运用 ,并有
效地解决实验中出现的各种情况 ,仍有许多 问题值
得重视 ,作者曾就该研究 的策略性问题作过论述川 ,
现则着重介绍技术方面的一些关键问题 。
l 材料的预处理
1
.
1 洁净 : 目的是去 除任何可 能的外源 D N A 污
染 ,如细菌 、 真菌等 。 根 、 茎 、 果类材料要用刀认真刮
取干净部分 。 花 、 叶 、 种子或小饮片等材料则在尽可
能切去菌斑 、 菌块之后 , 用次氯酸 、 乙醇浸洗 ,或用紫
外灯照射 , 有些植物有与细菌或真菌共生现象 , 菌丝
深人到组织 内部 ,则外来 D N A 不可能去除干净 。 而
有些材料 , 如冬虫夏草 ,本 身就 为多种 生物 的复合
体 ,研究时应予以 注意 。
1
.
2 粉碎 : 材料经液氮速冻后粉碎是通用方法 。 对
于新鲜材料 , 液 氮处 理可抑制 D N a s e ( D N A 酶 ) 的
活性 , 防止 D N A 的降解 ,但对 干材料 , 液氮 速冻 只
使材料变脆易磨 , 因而加玻璃砂或砂子共研则更经
济 ,效 果也很好 〔“一 4」 , 而且 如果没有液氮 , 对 于新鲜
材料也可用砂子共研 ,只要同时加人提取缓冲液 (可
抑制 D N a s e 的活性 )即可 〔5 ] 。
基因组 D N A 的有效提取是进行任何 D N A 下
游工作的前提 和基础 ,有效提取指 的是得到的基因
组 D N A (或称 总 D N A ) 有足够的量 , 尽可少 的降
解和不含有影 响下一步酶反应 的杂质 , 植物药 中的
小分子次生产物如菇类 、 黄酮 、 香豆素 、 有机酸 、 靴质
等含有酚经基 的化合物 , 氧化后易与 D N A 结合 , 引
起 D N A 降解或抑制酶的活性 , 而植 物中存在的多
糖类 由于与 D N A 同属大分子化合物 , 一般 提取过
程很难去除干净 , 也可能影 响 D N A 的进一步酶处
理或 P C R (聚合酶链式反应 ) 扩增 。
2 一般提取方法
2
.
1 c T A B 法 仁6 〕 : C T A B ( C e t y l t r i e t h y l a m m o n i u m
b or m id
e )是一种去污剂 , 它可与核酸形成复合物 , 这
些复合物在高盐溶液 ( > 0 . 7 m ol / L N a CI ) 中可溶并
且 稳定 存在 , 但 如果 降低 盐 的浓 度 ( < 0 . 5 m ol / L
N a C I )
,
C T A B 与核酸 的复合物就会 因溶解度 降低
而沉淀出来 ,大部分的蛋 白及多糖仍溶于溶液 中 。
该方法是植物 D N A 提取的经典 方法 〔 7一 “ 〕 , 抽
提缓冲液加人一定量的 件琉基 乙醇 , 可起到 防止酚
类氧化的作用 , 如果材料 中酚类成分较多 ,可将其含
量提高至 6% 山〕。 技术关键是提取过程加人 10 %
C T A B 提取液和 1 % C T A B 沉 淀缓 冲液的量一定
要准确 , 否则 C T A B 一 D N A 复合物沉淀不易产生或
得到的 D N A 会有部分降解川 · “ 〕。
当材料中多糖少时 , 可不用 1% C T A B 沉淀缓
冲液来沉淀 D N A , 在经氯仿 一异戊醇 ( 24 : 1) 抽提之
后 , 用 异 丙 醇 或 乙 醇 沉 淀 D N A , 使 提 取 过 程 简
化 巨` “ , ` 6〕 。
2
.
2 S D S 法 〔7」: S D S ( S o d i u m d o d e e y l S u l f a t e ) 是阳
离子去污剂 。 用含有高浓度 S D S 的抽提缓 冲液在
5 5 ℃ 对植物细胞进行裂解后 ,用提高盐浓度 ( K A 。
或 N H 4 A c )和降低温度 (冰上保温 ) 的办法沉淀除去
蛋白和多糖 , 剩下的 D N A 再进一步纯化 , 该法提取
出的 D N A 常含有较多的多糖 , 但如果材料本身多
糖含量不高或其含量未超过一定限度而对进一步研
究无影响时仍可使用 。 已有较多使用 S D S 法提取
D N A 成功的报道 v1[ 一 ’ “ 〕 。
3 D N A 提取过程中杂质的去除
对于幼嫩的材料 (鲜品或硅胶快速干燥 品 ) ,一
般方法都可得到很好 的 D N A ,但对于 中药 , 研究材
料常常无法选择 。 各种各样的来源 、 药用部位 、 采收
季节 、 加工方法及贮藏条件都将会碰到 , 虽然中药的
D N A 提取方法 已有一些报 道 ls[ , ` ’ 〕 , 但 目前 尚没有
通用的方法 。针对某一具体材料 ,常规的方法可能都
不奏效 ,如何去除上述的两类 主要杂质 ,下列处理办
法可供参考 。
3
.
1 去除多糖 : 如果材料 中含有较多多糖 , 一般提
取方法将很难去除 。 多糖常与 D N A 共沉淀而使沉
淀物呈胶冻状 。 少量的多糖一般不影响 D N A 的限
制性酶解或扩增 ,但当下一步研究无法进行时 ,则要
考虑在提取 D N A 过程中去 除多糖 。
3
.
1
.
1 在 D N A 未溶出之前 ,先用一些缓冲液洗去
多糖 。 如可用缓冲液 : 1 0 0 m m o l / L T r i s 一 H C I ( p H -
8
.
0 )
、
5 m m o l / I
J
E D T A 和 0 . 3 5 m o l / L S o r b i t o l 洗
fL 次 [3 , 2。 〕。
3
.
1
.
2 使 D N A 提取液 中的多糖先沉淀 。 在提取液
中加人 0 . 35 倍体积的无水 乙醇 ,迅速混匀 , 多糖会
先沉淀〔2 2〕 。
3
.
1
.
3 沉淀 D N A 时 ,使多糖保留在溶液中 。
l) 高盐法 :如用 乙醇沉淀时 ,在待沉淀溶液中加
人 1 / 2 体积的 5 m o l / I J N a C I〔2 3 ) ,或加 N H 4A 。 使终
浓度为 1 0 m m o l / L [2 ` 〕 。
2 ) P E G (聚 乙 二醇 , W T 8 0 0 0) 代 替乙 醇沉淀
D N A
: 如 在 5 0 0 拜 I J D N A 液 中加 入 2 0 0 拼L 2 0%
P E G 8 0 0 0 (含 1 . 2 m o l / L N a C I ,冰浴 2 0 m i n ) 〔 , 8域
0
.
5 m L D N A 液中加 0 . 1 2 5 m L 4 m o l / L N a C I 和
o
·
6 2 5 m I
J
1 3% P E G 8 0 0 0 (冰浴 l h )仁2` ] 。
中草药 C h i ne s e Tra d it io na la nd He rb a lD r u g s2 0 0 0 年第 1 3卷第2 1期. 59 3·
3
.
1
.
4 多糖和 D N A 的共沉淀物进行再分离 。 如用
TE( D N A 溶解缓冲液) 反复清洗共沉淀物 , 将清洗
液合并再用醇沉淀 D N A哪几或将沉淀物溶解后 , 经
琼脂糖电泳 ,切下 D N A 部分再将胶 回收 巨` 2〕 ,或者用
多糖水解酶将多糖降解 l2[ , 3 `〕 。 还有在提取缓冲液 中
加一定量 的氯苯 ( 1 / 2 体积 ) ,氯苯可以 与多糖的轻
基作用而去除多糖卿〕 。
上述方法还可组合使用 , 以达到最佳效果 3[, 2吕〕 。
然而这些方法均会在一定程度上减低 D N A 的提取
量 ;如果材料较少或要求较高 ,则可考虑用柱层析方
法 , 使 用对 D N A 具 有特异性 吸附 的树脂来 纯 化
D N A
, 可选用 W iz a r d P u r i f i e a t i o n K i t (作者经验 ) ,
p R C
一
5 柱 [` 9〕 , S e p h a e r y l S 一 1 0 0 0 或 S 一 5 0 0仁` 8 ] , Q ia g e n
G e n o m i。 t i p 5 0 0 / G [2 6〕 , 或 者 e s C I 梯 度 离 心 纯 化
D N A
。
3
.
2 去除酚类 :含有酚类杂质的 D N A 其沉淀物多
呈黄色至褐色 ,难以溶解或溶液色深 。 由于酚类化合
物在植物材料中存在十分普遍 , 因而抽提缓冲液中
要 加人一定 量的 冬琉基 乙醇 (防止 酚氧化 ) , P V P
(聚乙烯毗咯烷酮 , 可与酚类结合 )也十分常用 , 但有
时仍无法全部去除 。 可以考虑下述方法 。
3
.
2
.
1 对酚类的预提取 (清洗 ) : 对未粉碎的干材料
可水浸过夜 , 主要去除水溶性揉质等 〔` 8 〕 , 对粉碎后
的材料用丙酮浸提 , 去除脂溶性酚类化合物 (作者经
验 ) , 或用 可去 除酚类 的缓冲液 清洗 ( 0 . 25 m ol / L
N a C I
,
0
.
2 m o l / L T r is
一
H C I
, 5 0 m m o l / L E D T A
,
2%
一 4 % P V P ) (作者经验 ) 。
3
.
2
.
2 抽提液中再加一些防止酚类氧化的试剂 : 多
是 一些抗氧化剂 ,如抗坏血酸 (参考终浓度 30 ~ 60
m m o l / L ) [
, ’〕 、 半胧氨酸 ( 1 0 ~ 6 0 m m o l / L ) [ , 9 〕、 亚硫
酸钠 ( 1 0 m m o l / L ) [2 ,」、 二硫 苏糖醇 ( 0 . 1% )〔 2 ` 〕及二
乙基二硫氨基甲酸 ( 4 m m o l / L 或 0 . 5% )巨3 0」。
3
.
2
.
3 抽提液中再加人易与酚类结合的试剂 : 这类
试剂与酚类有较强的亲和力 , 可 防止 酚类与 D N A
的结合 , P V P 属 于这一类 , 还有 P E G ( 聚 乙二 醇 )
(参考终浓度 10 % ) [ 5〕。
在 S D S 法 中调整抽 提 液 为低 p H 值 ( p H -
5
·
5 )
,使酚类呈未解离状态 ,也可防止其氧化田 , ` ”〕。
酚类杂质也可用上述提到的柱层析纯化 , 对于
既含多糖又有多量酚类的材料 , 去除两类杂质的方
法常组合使用 。
4 花 (抱 ) 粉 、 种子或浸制标本的 D N A 提取
4
.
1 花 (抱 ) 粉 : 有效破 除花 (抱 ) 粉壁是花 (抱 ) 粉
D N A 提取 的关键 , iS m e l 比较 了前人报道的多种方
法 , 如 M M N O ( 4一 m e t h y lm o r p h o l i n 一N 一 o x i d e )处理 ,
渗透破裂 ,快速冷冻 ,微波降解 , 酸碱处理并加纤维
素 、 半纤维素酶消化 , 以及微珠机械粉碎等方法 , 试
验了 8 种裸 子植物和被子植物花粉 , 以用最后一种
方法最好 ,提取介质为十二烷基磺酸铿 il( ht iu m d o -
d e e y l s u l f a t e )优于 S D S 和 C T A B 巨川 。
4
.
2 种子 : 种子中常贮藏较多的蛋 白和淀粉 , 一般
不影 响 D N A 的有效 提取 , C T A B 法 和 SD S 法 均
可 , 得到的 D N A 一般有些降解 , 与种子的贮存时间
呈正相关 ,但情况好于腊叶标本材料 〔’ ` , 3 2 〕。
4
.
3 浸 制 标 本 : 有 时 会 需 要 从 浸 制 标 本 中提
取 D N A 。不论浸液是 卡诺 固定 液 、 F A A 或不 同浓
度的 醇均 对材 料 中的蛋 白起作 用 , 使得染 色体 中
与 D N A 结合的蛋 白质不易解离 , 提取介质中一定
要 加 人 蛋 白酶 , P r o t e i n a s e E 或 P r o t e i n a s e K 均
可 [3 3〕。
5 D N A 质 t 的检测
提取得到 D N A 要进行数量和质量 的检测 。
5
.
1 外观 : 好的 D N A 沉淀为白色 ,干后透明 。 如果
干后仍呈 白色 , 常因蛋 白较多 ; 若呈黄 至棕色 , 则是
有多酚类杂质 ;呈胶冻状则含有多糖 。
5
·
2 紫外分光光度法山〕
1 )测量 2 60 n m 处 的紫外吸收值 ,用于定量 ,每
个 O D 值相当于 D N A 浓度为 50 # g /m I J 。
2 ) A
2 6。
/ A
28 。比值若为 1 . 8 0 左右 , 则 D N A 比较
干净 : > 1 . 80 , 则 含有 R N A ; < 1 . 80 , 则 含有 蛋 白
质 ,需要去除 。 前者用 R N a s e 将 R N A 降解 ,后者可
用酚 /氯仿再抽提 。
如果含有其它小分子杂质 (药材 中常有 ) ,它们
在相应波长可能有吸收 , 则单从 O D 值 的变化情况
无法很好地判断 D N A 的纯度 。
5
.
3 琼脂糖凝胶法
1) 琼脂糖 电泳 后胶孔 处有 E B (澳化 乙 锭 ) 吸
收 , 表明有多糖 。
2 ) 未降解 的 D N A , 电泳时用标 准量 的 入D N A
进行定量 。
3 )干药材的 D N A 大多降解 , 电泳呈弥散状 (不
同的材料降解 的程度不同 ) ,可点于凝胶上 ,与标 准
量的 D N A (分子量较小 )通过紫外投射大致定量 。
5
.
4 D N A 中是否有影响 P C R 或酶切 的杂质 ,则
要根据实验的需要进行相应反应的试验才可确定 。
总之 , 植物药 D N A 的提取对于具体的材料还
是一个需要不断摸索 的过程 , 今后的研究 中将会积
累更多的经验 。
·
5 9 4
· 中草药 C h ines e T a rd i ti o na la n d He rba lD r ugs 2 0 0 0年第 1 3卷第 1 2 期
;:
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C
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12 8
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19 卢圣栋 主编 . 现代分子生物学实验技术 . 北京 : 高等教育 出版
药用卷柏的研究概况
北京市中医研究所 (l 。 0 0 10 ) 何 薇 ` 曾祖平 王 永红
摘 要 综述了药用卷柏在化学成分 、药理作用方面的研究概况 ,提示丰富的卷柏资源有进行深入研究的意义 。
关键词 药用 卷柏 化学成分 药理作用
卷柏为旅 类植物 门卷柏科 卷柏 属植物 , 约有
70 0 种 , 广泛分布于全世界 。 我 国约有 50 种 ,产于全
国各地 lj[ 。 常作为药用的有 6 种 , 被《中华人 民共和
国药典 》一九九五年版中收载的两种为卷柏科植物
卷柏 S e z a g i n e zz a t a m a r i s c i n a ( B e a u v . ) S p r i n g ; 垫状
卷柏 5 . P u l v i n a t a ( H o o k . e t G r e v . )M a x im . ,具有活
血通经之功效 ,用于经闭痛经 ,症痕痞块 ,跌扑损伤 ;
炒炭后可化癖止血 ,用 于吐血 、 崩漏 、 便血 、 脱肛 。 我
国南方部分地 区广泛使用 的石上柏 , 《广西中药材标
准 》中收载石上 柏 的来 源为 卷柏 科植物深绿卷 柏
5
.
d
o e d e lr e i n i i H i e r o n
.
(别 名 : 大 叶菜 ) ; 江南 卷 柏
5
.
m o e z ze n d o示 1 H i e r o n . (别 名 : 地柏枝 ) , 具有清热
解毒 、 抗癌 、 止血之功效 ,用 于癌症 、 肺炎 、 急性扁桃
体炎 、 眼结膜炎和乳腺炎 。 《贵州民间药物 》中将深绿
卷柏称为多德卷柏 5 . d oe d e lr ie in i H i e or n . , 具有祛
风 、 散寒 、 消肿 、 止咳之功效 ,用于风湿病 , 风寒咳嗽 。
山东省有些地 区使用 中华卷柏 5 . : i en sn is ( D es v . )
S rP in g
,用于治疗慢性气管炎 。 福建等地使用的为衰
,
A d d r e s s
:
H e W e i
,
B e i ji n g In s t i t u t e o f T C M
,
Be ij i
n g
州卷柏 5 . i n v o l v e n : ( S w ) S p r i n g 。
为进一步深人研究卷柏的药用价值 , 现将对卷
柏 的化学成分 、 药理作用的研究情况做简要综述 。
1 化学成分
1
.
1 黄酮类 : 现 已发 现卷 柏 中含有 芹菜素 ( a p i-
g e n i n )
、 穗花杉双黄酮 ( a m e n t o f l a v o n e ) 、 扁柏双黄酮
( h i n o k i f l a v o n e ) 和异柳杉素 ( i s o e r y p t o m e r i n )〔2〕及阿
曼托黄素 ( a m e n t o f l a v o n e ) [3 〕。 林瑞超 [` 1等从深绿卷
柏 中分 离得 到阿曼托黄素 、 7 , 7即一二一O 一 甲基阿曼托
黄素 、 7 , 4’ , 7 ” , 4 1 一四一 O 一甲基阿曼托黄素和三叶胶树
黄酮 。 陈平 sj[ 等从深绿卷柏 中分离出芹菜素 。
1
.
2 生物碱类 : 林瑞超困等从深绿卷柏 中分离得到
3 种新 的生物碱昔 ( a l k a l o i d g l y e o s id e ) : h o r d e n i n e -
O
一 a 一 1
一 r h a m n o p y r a n o s id e
, n 一m e t h y l t y r a m i n e
一
O
一 a 一 1
-
r h a m n o p y r a n o s id e
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“ 一
O
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t r a n s
一 e i n
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4 ,
一
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一日一 d 一 g l u e o P y r a 一 n o s y l一 a 一 l 一 r h a m n o p y -
r a n o s id e
。
1
.
3 酚类 :林瑞超川等从深绿卷柏 中分离得到 5 种