全 文 ：· 药理实验与临床观察 ·
马蔺子甲素和乙素的生物分析方法研究
国家医药管理局天津药物研究院 ( 3 0 0 1 9 3) 刘昌孝 ` 李全胜 高连用
摘 要 建立了用 H P L C法测定生物样品中马蔺子 甲素和 乙素的方法 。 以反相 1C 8柱 , 乙睛一水 ( 97
:
3) 为流动相 ,紫外 27 0 n m 检测 ,内标物为盐酸氟桂嗦 。 检测灵敏度为 5 n g / m L , 回收率达 75 % 以
上 ,在 10 n g / m L ~ 1 0 0 n g /m L 浓度范围内具有良好的线性关系和重现性 。 体外和体内试验证明
该测定方法能满足生物样品测定的要求 。
关镇词 马蔺子 马蔺子甲素 马蔺子乙素 生物分析 H P L C
中药马蔺子为莺尾科植物马蔺 rI i: P a l -
l a s i i v a r
·
c h i n e n s i s ( F i s e h ) K o id z 的成熟种
子 。 《神农本草经 》记载为药性甘平无毒的中
药 。 马蔺子中含有的马蔺子甲素 i( ir sq itr n o en
A )和马蔺子乙素 ( i r i s q u i n o n e B )是其重要植
物化学成分 , 由于两者含量的差异 ,主要为马
蔺子甲素 。它们为新型醒类结构的化合物 。经
系统药理研究 , 证明马蔺子素具有显著的放
射增敏作用和抗癌作用 , 又无骨髓抑制的副
作用 〔`一 “ 〕 。 由于为新型结构的化合物 ,其动物
和 人体的药物动力学研究至今均未见报道 ,
为研究其药物动力学 ,观察药物在体内变化 ,
我们进行了体内药物浓度测定方法研究 ,对
马蔺子甲素和乙素生物分析方法进行了实验
研究 。
1 材料和仪器
工. 1 试验药物 : 马蔺子甲素和马蔺子乙素对
照品由山东新华制药股份有限公司提供 , 含
量 95 % 。 内标物为盐酸氟桂嗦 , 含量 9 % 。
1
.
2 试剂 : 乙睛 ,色谱纯 ; 甲醇 ,优级纯 ;其余
试剂均为分析纯 。 超纯水 ,本研究室 自制 。
1
.
3 仪器 : 高效液相色谱仪 , 日本岛津 L C -
6 A 高效液相色谱仪 ,包括紫外检测器 、柱温
控制器 、 自动进样器 、 色谱数据处理器和中央
控制单元 。 纯水器 , M il 一 Q I 型纯水器 , 日本
M i l lp o r e 公司产 品 。 医用 离心 机 , L D S一 ZA
型 。 混合器 , K H 一 8 51 型 , 高速组织匀浆器 ,
X H F
一
1 型 。
L 4 动物 : W is t ar 大 鼠 , 雌雄 兼用 , 体 重
1 50 9左右 ,天津药物研究院动物室提供 。
2 方法和结果
2
.
1 生物分析方法的建立和确证
2
.
1
.
1 H P L C 条件 : 色谱柱 C 18 , 2 5 0 m m 又
.4 6 m m
,
1 0 拼m , 柱温 38 C ; 流动相 为乙 睛 -
水 ( 9 7 : 3 ) ;流速 0 . 7 m I J /m i n ;检测波长 2 7 0
n m ; 内标物为 50 拜g /m L 盐酸氟桂嚓甲醇溶
液 。 在此条件下 , 马蔺子甲素 、 马蔺子 乙素和
内标物的保留时间分别为 14 . 3 、 15 . 2 和 7 . 9
m in ;色谱图见图 1 。 血清中内源性物质不影
响它们的分离 。
2
.
1
.
2 标准曲线的制备 : 称取一定量的马蔺
子甲素和 乙素 ,分别用甲醇溶解 ,各吸取相当
于马蔺子甲素和 乙素分别为 1 0 、 25 、 5 0 、 1 0 、
2 0 0
、
5 0 0 和 1 0 0 0 n g , 置于试管内 ,加 内标物
溶液 50 拼L , 在氮气下挥干溶剂 , 残 留物用
2 5 0 拌L 流动相振摇溶解 ,进样 50 拼L 进行色
谱分析 , 以峰面积比与浓度进行回归 ,得到标
准曲线方程 , 马 蔺子 甲素 : aY 一 0 . 0 0 3 0 5 +
0
.
o o o 9 5 l l X
, r = 0
.
9 9 9 0 ( n = 7 ) ; 马 蔺子 乙
素 : Y 。 = 0 . 0 0 1 5 7 2 + 0 . 0 0 0 9 5 7 3X , r = 0 . 9 9 9 7
(n 一 7 ) 。 结果显示浓度与峰面积比具有良好
的线性关系 。
,
A d d r e s s
:
L iu C h a n g x i a o
,
T i a n j in In s t i t u t e o f P h a r m a e e u t i e a l R e s e a r e h
,
T i a n jin
《中草药 》 1 9 9 8 年第 29 卷第 8 期 5 3 3
2 .1 3 .校正曲线 :称取一定量的马蔺子甲素
和 乙素 ,分别用甲醇溶解 ,各吸取相当于马蔺
子 甲素和 乙 素分别为 10 、 2 5 、 5 0 、 1 0 0 、 2 0 0 、
50 0 和 1 0 0 n g ,置于试管内 ,加 内标物溶液
50 拌L , 在氮气下挥干溶剂 , 各加入大 鼠血清
1 m L
,混合有机溶剂 (正 己烷 一异丙醇 一 95 ,
5 ) 5 m L 混合 ,振荡 ,离心 , 吸取有机相 4 m L ,
在氮气下挥干溶剂 ,残留物用 2 0 拼L 流动相
振荡溶解 ,进样 50 拌L 进行色谱分析 ,以峰面
积 比与浓度进行回归 ,得到校正曲线方程 ,马
蔺子甲素 : Y a = 一 0 . 0 0 4 8 6 2 + 0 . o o o 5 6 6 3X , r
= o
·
9 9 9 7 ( n = 7 ) ; 马 蔺 子 乙 素 : Y b = 一
0
.
0 0 9 0 8 2 + 0
.
0 0 0 7 6 8 8X
, r = 0
.
9 9 8 0 ( n = 7 )
。
结果显示浓度与峰面积比具有良好的线性关
系 。
验 , 以未经血清处理的标准液和从血清中提
取分离的样品在已确定的分析条件下进行定
量分析 ,计算回收率 , 马蔺子甲素平均 回收率
(% )
:
76
·
O士 .4 0 ; 马蔺子 乙素平均 回收率
( % )
:
8 2
.
3士 1 0 . 6 。 由此可见 ,在 2 5 n g /m L一
1 0 0
n g /m L 浓度范围内 ,其平均 回收率在
75 %以上 。
2
.
1
.
5 精密度和灵敏度试验 : 以 2 5 、 2 0 0 和
1 0 0 gn / m L 3 种浓度 , 按校正 曲线制备方
法 , 从血清中提取药物 ,每一浓度制备 5 份样
品 ,用每一浓度测定的均值和标准差计算出
相对误差 ( R S D % ) ,考察当 日和间 日测定的
精密度和重视性 。 结果如表 1所示 。 本法测
定的灵敏度为 s gn /m L 。 经测定精密度和灵
敏度考察表明本法符合生物样 品测 定的要
求 。
表 1 日内和日间测定的精密度和重现性
马蔺子甲素 马蔺子乙素浓度
( n g /m L ) 日内
RS D (% )
日间
RS D (% )
日内
R S D (写)
日间
RS D (肠 )
A
一空白血浆 B一含马蔺子 甲素 、 乙素及内标的血浆
1
一马蔺子甲素 ( tR 一 14 . 3) 2一马蔺子乙素 (奴 一 15 . 2)
3
一内标 ( t二一 7 . 9 )
图 1 测定马蔺子素原型药色谱图
2
.
1
.
4 回收率 : 用 2 5 、 2 0 0 和 1 0 0 0 n g /m L 3
种浓度的马蔺子甲素和 乙素进行 回收率试
.
5 3 4
.
25 18
.
4 20
.
2 1 0
.
5 14
.
3
20 0 9
.
4 7
.
3 5
.
5 8
.
5
1 00 0 1
.
8 3
.
9 0
.
9 3
.
5
2
.
2 应用
2
.
2
.
1 体外转化试验 : 取大鼠新鲜血清及
20 %肝匀浆 1 m L ,加入马蔺子甲素和乙素对
照液 , 制成 l o 0 n g /m L 的样品 ,各 5 份样
品 ,于 3 7℃环境下温浴 ,分别于 。 、 1 0 、 2 0 、 3 0 、
6 0 m in 取样测定原型药物的浓度 , 测定方法
为采样 1 m L , 加 内标物溶液 50 拜L ,混合有
机 溶剂 (正 己烷 一异丙醇一 95 : 5 )5 m L , 混
合 ,振荡离心 ,吸取有机相 4 m L ,在氮气下挥
干溶剂 , 残留物用 20 0 拼L 流动相振摇溶解 ,
进样 50 拌L 进行色谱分析 , 测定原型药物浓
度 ,结果见表 2 。 可见马蔺子甲素和 乙素在血
清中的转化快于肝匀浆中的转化 。
2
.
2
.
2 体内血药浓度测定 : 大鼠 19 8 0 m g /
k g 马 蔺子 素 (含 马 蔺子 甲素 86 % , 乙 素
1 4% )
, 于给药后 。 、 5 、 1 5 、 3 0 、 6 0 、 1 2 0 、 1 8 0 和
24 0 im n 采血 , 分离出血清 , 测定其血药浓
度 。 测定程序为 : 取大鼠血清 1 m L ,混合有机
ǎ匕Q白9臼ù勺n乃R…9曰UQ八6ltJlo1山勺O夕ú
溶剂 (正 己烷 一异丙醇 一 95 : 5 )5 m I J 混合 , 振
荡 , 离心 , 吸取有机相 4 m l 子 ,在氮气下挥干溶
剂 , 残留物用 20 0 琳 J 流动相振摇溶解 , 进样
50 拌L 进行色谱分析 , 用校正曲线计算其血
药浓度 , 结果见表 3 。 可见给药后血药浓度很
低 , 而且测不出马蔺子 乙素 。
表 2 体外转化试验
时间 ( m in ) 0 1 0 2 0 3 0 6 0
20 写肝匀浆
马蔺子甲素
浓度 ( n g / rn L ) 1 0 0 0 7 9 4 5 0 3 5 9 5 5 9 5
含量 (% ) 1 0 0 . 0 7 9 . 4 5 0 . 3 5 9 . 8 5 9 . 8
转化率 (% ) 0 2 0 . 6 1 9 . 7 4 0 . 2 4 0 . 2
马蔺子乙素
浓度 ( n g /m L ) 1 0 0 0 7 1 9 5 0 1 72 1 4 3 2
含量 (% ) 1 0 0 . 0 7 1 . 9 8 0 . 1 7 2. 1 4 3 . 2
转化率 (% ) 0 2 5 . 1 1 9 . 9 2 7 . 9 5 6 . 5
易变化 ,在体内也易代谢 , 因此给生物分析带
来困难 。 一是要求测定方法具有稳定性 , 二是
要求测定体内的药物的灵敏度必须达到 gn /
m L 的水平 , 为此样 品处理过程必须在避光
条件下完成 , 生物提取样 品尽可能富集后测
定 , 以达到应有的灵敏度 。
表 3 大鼠 ig 给药后的马蔺子甲素浓度 ( gn / m L )
t 动 物 编 号
( m in ) 1 2 3 4 5
` 工士 s
ù丫目乃9自六dla
.…月了ó口八舀OULa连óOd,月L一l
1 2 0
1吕0
1 2
.
8 1 4
.
9 10
.
6
1 9
.
9 4 9
.
5 38
.
4
2 8
.
0 1 7
.
1 3 8
.
4
2 0
.
1 2 2 5 9 3
1 4
.
1 1 4
.
3 1 6
.
0
1 9
.
5 1 6
.
9 1 4
.
4
1 2
.
8士 1 . 8
4 0
.
0士 1 2 . 0
3 1
.
4士 1 0 . 9
2 1
.
7士 8 . 6
1 6
.
2士 2 . 2
1 5
.
4士 3 . 2
51306
3370016.16.835.55
5566418.81545
血清
马蔺子甲素
浓度 ( n g /m L )
含量 (% )
转化率 (% )
马蔺子乙素
浓度 ( n g /m L )
含量 (% )
转化率 (% )
1 0 0 0 4 7 7 2 4 3
10 0
.
0 4 7
.
7 2 4
.
3
0 5 2
.
3 7 5
.
7
1 0 0 0
10 0
.
0
0
3 7 7 1 9 7
1 9
.
7
8 0
.
3
2 4 0 1 3
.
2 1 0
.
9 6
.
9 3
.
0 10
.
8 9
.
0士 4 . 0
通过分析测定条件的比较研究 , 获得较
理想的 H IP 尤 条件 , 经过方法学验证 , 体外
转化试验和给药后的血药浓度测定证明所拟
定的试验条件能满足体内药物分析的基本要
求 , 在此基础上完成了马蔺子甲素的动物药
物动力学研究 、 吸收分布排泄 、 代谢和蛋白结
合试验 ,这部分研究将另文报告 。
参 考 文 献
1 江纪武 , 等 . 植物药有效成分手册 . 北京 : 人民卫生 出
版社 , 1 9 8 6 : 6 13
2 李德华 . 中国肿瘤临床 , 1 9 97 ; ( 3 ) : 4
3 张 力 ,等 . 中国肿瘤临床 , 1 9 9 7 ; ( s ) : 2 3
( 1 9 9 8
一
0 3
一
3 1 收稿 )
月了OJ
3762
3 讨论
马蔺子甲素和乙素是马蔺子的有效化学
成分 , 由于其 为醒类结构化合物 ,在体外和体
内均具有不稳定的特点 ,在分析处理过程中
S t
u d i e s o n t h e D e t e r m i n a t io n o f I r i s q u i n o n e A a n d B i n B i o l o g i e a l S a m P le s
L iu C h
a n g x i o
,
L i Q u a n s h e n g
,
G
a o l
,
i a n y o n g ( T ia n j i
n I n s t i t
u t e o f P h a r m a e e u t ie a l R e s e a r e h
,
S t
a t e P h
a r m a
-
e e u t ie a l A d m in i s t r a t io n o f C h i n a
,
T i a n zi n 3 0 0 1 9 3 )
A b s t r a e t A n H P L C m e t h o d 15 u s e d t o d e t e r m in e e o n e e n t r a t i o n s o f i r i s q u in o n e A a n d B in b io lo g i e a l
s a m p le s
·
B
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k a n d w i t h g o o d p r e e i s io n
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T h e m e t h d a f f o r d s t h e s e n s i t iv it y o f 5 n g /m l
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i r i s q u in o n e A a n d B
, r e s p e c t iv e ly
·
I r i s P
a l l a s i l v a r
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C h i n e n s i s I r i s q u in
o n e A I r s q u i n o n e B b i o 一 a n a ly s i s H P L C
《中草药 》 19 9 8 年第 29 卷第 8 期 一 5 3 5 -