全 文 ：养物性能稳定 ,有利于提供稳定的次生代谢产物。
由墨旱莲获得的毛状根为绿色 ,该毛状根在 12
h /d光照 ,光照强度 2 000 lx条件下较黑暗中生长
迅速 ,光照下第 18天时重量增加 52倍 ,而黑暗条件
下仅增重 34倍 ,并且颜色也不相同 ,光照下生长的
呈黑绿色 (图 1-A) ,在黑暗条件下生长的为淡绿色
(图 2-B)。据报道 ,毛花洋地黄及鬼针草属、万寿菊
属的植物诱导出的毛状根在光下培养变成绿色毛状
根 ,其次生代谢产物的合成能力显著增加 [9, 10 ] ,其机
制尚不清楚。 墨旱莲的次生代谢产物合成能力如何
A-光照条件下　 B-黑暗条件下
图 1　墨旱莲毛状根
也需要进一步的研究。
致谢:墨旱莲种子经我室郑汉臣教授鉴定 ,谨此
致谢。
参考文献:
[ 1 ]　王关林 ,方宏筠 .植物基因工程原理与技术 [M ] .北京:科学
出版社 , 1998.
[2 ]　汤海峰 ,赵越平 ,蒋永培 . 中药墨草莲的研究概况 [ J ]. 西北药
学杂志 , 1999, 14( 1): 32-34.
[3 ]　中国药典 [ S] . 2000年版 .一部 .
[ 4 ]　孙敬三 . 植物细胞工程实验技术 [M ] . 北京: 科学出版社 ,
1995.
[ 5]　M organ A J, Cox P N, Tu rner D A, et al . T ransformation of
tomato using an Ri plasmid v ector [ J ] . Plant Science, 1987,
49(1): 37-49.
[6 ]　常振战 ,果得安 ,沈　昕 ,等 . 掌叶大黄毛状根培养及培养物中
蒽醌类成分分析 [ J] .药学学报 , 1998, 33( 11): 869-872.
[7 ]　费厚满 ,梅康凤 ,沈　昕 ,等 . 发根农杆菌对绞股蓝的转化及毛
状根中皂甙的产生 [ J] .植物学报 , 1993, 35( 8): 629-631.
[ 8]　刘伟华 ,姜　静 ,石　锐 ,等 . 发根土壤杆菌 Ri质粒对黄瓜进
行遗传转化的研究 [ J ]. 植物研究 , 1997, 17( 4): 436-440.
[9 ]　王　毅 ,张美萍 ,关贺群 ,等 . 发根农杆菌感染龙胆再生植株的
研究 [ J] .吉林农业大学学报 , 1994, 16( 2): 43-45.
[ 10]　 Yosh imatsu K, Satake M , Sh imomu ra K, et al . Determina-
tion of card enolid es in h ai ry root cul tu res of Digitali s lanata
by enzym e-lin ked immunosorben t ass ay [ J ] . J Nat Prod,
1990, 53( 6): 1498-1506.
当归药材道地性的 RAPD分析
高文远 1 ,秦恩强 2 ,肖小河 2* ,余惠 2 ,高光跃1 ,陈四保1 ,赵扬景 1 ,杨世林 1
⒇
( 1. 中国医学科学院 药用植物研究所 ,北京　 100094;　 2. 中国人民解放军 302医院 ,北京　 100039)
摘　要: 目的　从 DNA分子水平上探讨当归药材道地性的生物学基础。方法　对来自不同产地的 18个当归样品 ,
提取其基因组 DNA,并进行 RAPD分析。对筛选出的 10个引物的 RAPD结果进行聚类分析 ,得出 18个当归样品
的聚合树状图。结果　显示地理分布距离越小 ,当归的遗传差异越小 ;反之 ,越大。但生态环境特别是小生境对当归
遗传差异的作用亦不可忽视。 结论　为我们从分子生物学角度研究当归药材道地性提供了新的启示。
关键词: 当归 ;道地性 ; RAPD
中图分类号: R282. 7　　　文献标识码: B　　　文章编号: 0253 2670( 2001) 10 0926 04
Analysis on Genuineness of Angel ica s inensis by RAPD
GAO Wen-yuan1 , QIN En-qiang2 , X IAO Xiao-he2 , YU Hui-ming2 , GAO Guang-yao1 , CHEN Si-bao1 ,
ZHAO Yang-jing1 , YANG Shi-lin1
　　 ( 1. Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academ y of Medical Sciences, Beijing 100094, China; 2. Hospi-
tal 302 o f PLA, Beijing 100039, China)
Abstract: Object　 To investig ate the genuineness o f Angel ica sinensis ( Oliv. ) Diels from the lev el of
molecular biolog y. Methods　 The genomic DN As of 18 samples of A. sinensis co llected f rom di fferent lo-
cali ties w ere isola ted and analysed by RAPD. Based on the cluster analysis o f their RAPD strips, the
molecular phylog enetic t ree o f 18 A. sinensis samples w as described. Results　 The rusults indicated that
the smaller the geog raphic distance betw een two A. sinensis samples, the smaller their genetic dif ference;
w hi le the genetic di fference became g rea ter as th eir geog raphic distance increa ses. How ever i t should no t
·926· 中草药　 Chinese Traditiona l and He rbal Drug s　 2001年第 32卷第 10期
⒇ 收稿日期: 2001-05-09基金项目:国家自然科学基金重点项目 (编号 39730500)
* 联系人: Tel: ( 010) 66933324; E-mai l: xiaoxh@ hotmail. com
be overlooked that the na tural envi ronments, especially the local ecological conditions may also show some
influence on the genetic va riations among dif ferent A. sinensis samples. Conclusion　 It has provided us
w ith the enlightenment of study on the genuineness of A. sinensis f rom the lev el of molecular biolog y.
Key words: Angelica sinensis ( Oliv . ) Diels; g enuineness; RAPD
　　在中医药长期医疗实践中 ,道地药材一直是评
价药材品质的独特的综合性标准。道地药材与非道
地药材物种来源一致或十分相近 ,在形态、生药性状
及化学成分等特征上具有高度相似性 ,因而道地药
材的鉴别往往不易 ,具有很大的主观性。
作为现代分子生物学技术重要手段的 DNA分
子遗传标记方法 ,将使从居群和分子水平上阐明药
材道地性的生物学实质成为可能。 陈永久等 [1 ]利用
RAPD技术研究了冬虫夏草 Cordyceps sinensis的
不同地理群体间的遗传分化现象 ,结果表明:来自同
一地方的样品遗传差异甚微 ,同一区域不同地方的
样品间遗传差异较大 ,不同区域的样品间遗传差异
最大 ,这为冬虫夏草的药材道地性研究提供了分子
水平的支持依据。肖小河等 [ 2]研究表明 , RAPD技术
不仅能正确鉴别姜黄属不同种间群体 ,而且对种内
等级亦能进行有效的刻划 ,可作为姜黄属药用植物
的分类鉴定与道地性评价的新手段。
当归 Angelica sinensis ( Oliv. ) Diels为伞形科
多年生草本药用植物 ,其根含藁本内酯、阿魏酸等多
种有效成分 ,有补血活血、润燥滑肠之功能。主产于
甘肃省 ,一般认为甘肃岷县为其道地产区 ,但甘肃省
宕昌、武都、漳县以及四川省南坪的当归也作药
用 [3 ]。为探讨当归药材道地性形成的基因基础 ,为当
归 GAP生产提供理论依据 ,我们采集了来自当归
不同产区的 18个样品 ,采用 RAPD法对其基因组
DNA进行了分析 ,并结合聚类分析定性定量地探讨
了不同产区 (居群 )的 18个当归样品的基因组 DNA
多态性 ,从 DNA分子水平上表征了当归药材道地
性的生物学差异的实质。
1　材料
植物的材料来源见表 1,这些材料均由中国医
学科学院中国协和医科大学药用植物研究所冯毓秀
教授鉴定。
2　实验方法
2. 1　 DNA的提取:采取 CTAB法 [4 ] ,并略有修改。
取叶片 1 g,用液氮研磨成粉末 ,研磨时加入 0. 2 g
PV P粉。研磨后立即加入 2 mL CTAB提取缓冲液
化 ( 200 mmo l /L Tris-HCl pH 8. 0, 0. 25 mmol /L
EDTA pH8. 0 , 2 5 0mmo l / L NaCl , 0. 5% SDS ,
表 1　用于 RAPD分析的当归材料 (叶片 )
编号 植物名称 产地
1 Angel ica sinensis 武都 01
2 A . sinensis 武都 02
3 A . sinensis 武都 03
4 A . sinensis 武都 04
5 A . sinensis 南坪 01
6 A . sinensis 南坪 02
7 A . sinensis 南坪 03
8 A . sinensis 宕昌 01
9 A . sinensis 漳县 01
10 A . sinensis 漳县 02
11 A . sinensis 岷县 01
12 A . sinensis 岷县 02
13 A . sinensis 岷县 03
14 A . sinensis 岷县 04
15 A . sinensis 岷县 05
16 A . sinensis 岷县 06
17 A . sinensis 岷县 07
18 A . sinensis 岷县 08
0. 5% β-巯基乙醇 ) , 60℃水浴保温 45 min,加入等
体积的氯仿 -异戊醇 ( 24∶ 1) ,反复轻摇混匀 , 5 500
r /min离心 10 min ( BECKM AN J2-21M型超速离
心机 )。取上层水相 ,再加入等体积的氯仿 -异戊醇
( 24∶ 1) ,反复轻摇混匀 , 5 500 r /min离心 10 min。
重复 2～ 3次 ,直到水相层绿色不明显。 在水相中加
入 2 /3体积的预冷的异丙醇 ,于- 20℃静置 30 min
以上。10 000 r /min离心 10 min,沉淀用 300μL TE
( 10 mmol /L Tris-HCl pH7. 6, 0. 1 mmol /L EDTA
pH8. 0)溶解 ,加入 Ranse A, 终浓度为 20μg /mL,
37℃保温 1 h,然后分别用等体积平衡酚 ,平衡酚-
氯仿 ( 1∶ 1)及氯仿 -异戊醇 ( 24∶ 1)各抽提 1次。 吸
取上层水相 ,加入等体积异丙醇沉淀 DNA, 1 000 r /
min条件下离心 10 min,沉淀用 75%冰醋酸洗涤
1～ 2次 ,干燥后用 200μL T E溶解 , - 20℃保存备用。
2. 2　 PCR反应: 参照 William[ 5]的方法 ,并稍加改
动。从 200个随机引物 ( Olig o公司 )中筛选 20个
RAPD引物进行 PCR扩增。反应总体积为 25μL,内
含模板 DNA 1～ 10 ng ,引物 0. 2μmol /L, dN T Ps
各 0. 1 mmol /L, Taq DN A酶 ( Promega公司 ) 1单
位 , T ris-HCl( pH8. 3) 10 mmo l /L, KCl 50 mmol /
L, MgCl2 2. 5 mmo l /L, g ela tin 0. 001% ,上盖有 25
μL石蜡油。 PCR扩增反应在 Gene CyclerTM型 DNA
扩增仪 ( Bio-Rad公司 )上进行。反应循环为: 90℃ ,
·927·中草药　 Chinese Traditiona l and He rbal Drug s　 2001年第 32卷第 10期
1 min; 35℃ , 2 min; 72℃ , 2 min; 5个循环后改为
94℃ , 30 s; 35℃ , 1 min; 72℃ , 2 min; 40个循环后
于 72℃延伸 5 min。 PCR扩增产物于 1. 3%琼脂糖
(内含 1μg /mL EB)凝胶中进行电泳检测。
2. 3　数据处理:任意两个样品之间的遗传距离 ( D)
可以通过以下公式进行计划: D= 1- F。其中 F为两
个样品 RAPD标记的共享度 , F= Nxy / ( Nx+ Ny ) ,
Nx y为样品 X和样品 PCR扩增产物分子量相同的
DNA片段总数 , Nx、 Ny分别为样品 X和样品 Y的
PCR扩增产物的 DNA片段总数。根据遗传距离
( D) ,利用 UPGMA ( unw eigh ted pair method wi th
a ri thmetic mean)法进行聚类分析 ,并构建聚合树
状图。
3　结果与分析
首先采用 25个 10 bp的随机引物进行扩增 ,从
中筛选出谱带清晰并呈多态性的引物共 10个 ,表 2
列出了这 10个引物的序列 ,图 1显示了引物 Oligo
11-1098 PCR扩增产物的电泳结果。 每个引物扩增
的 DNA片段数为 3～ 9个 ,筛选出的 10个引物在
每个样品中获得的 DNA片段总数平均为 55个。
表 2　筛选出的 10个引物的序列
引　　物 序　　　　列
Oligo 11-1006 GCT CTCTGGC
Oligo 11-1021 T GAG TAACCG
Oligo 11-1034 ACCCT TCCCG
Oligo 11-1043 GAT CCCGCCG
Oligo 11-1050 CTCTCCTCCG
Oligo 11-1058 T GTGGAAGCG
Oligo 11-1064 GGGGAACGCG
Oligo 11-1089 C TGGGATGCG
Oligo 11-1094 CCTT GCTGCG
Oligo 11-1098 CCAGAAACCC
　　
M 1为 l leb ladd er; M2为λDN A/ Hae+ HindⅢ
图 1　引物 Oligo 11-1098 PCR扩增产物的电泳结果
　　根据筛选出的 10个引物的 PCR扩增结果 ,计
算了各样品间的遗传距离。根据遗传距离 ,利用聚类
分析构建了不同产地当归 18个样品的聚类树状图
(图 2)。从图 1可以看出 ,在同一引物的 RAPD指纹
图谱中 ,不同供试材料的主谱带基本一致 ,说明它们
的遗传背景具有很大的相似性 ,这也是鉴定当归真
伪的重要标记。但不同样品的次谱带之间存在着不
同程度的差异 ,说明不同产地当归居群的遗传背景
又具有丰富的多样性 ,这为当归的药材道地性研究
提供了分子水平上的参考信息。
图 2的聚类分析结果综合显示了不同产地的
18个当归样品由 10个筛选出的引物进行 PCR扩
增的结果。图 2比较直观地表明绝大多数地理分布
距离越近的样品 ,如 1～ 3之间 , 5～ 7之间 , 9, 10之
间及 11～ 18之间 ,在聚类树状图上的距离越近 ,说
明它们之间的遗传背景差异越小。反之 ,地理分布距
离越远的样品 ,如上述各组之间 ,在聚类树状图上的
距离越远 ,说明它们之间的遗传背景差异越大。但生
1～ 18为样品编号
图 2　 18个当归样品
的 RAPD聚类系统图
态条件特别是小生境对当归
遗传差异的影响亦不可忽视 ,
如 4号样品和 1, 2, 3号样品
之间在地理分布距离上虽然
较近 ,但在分子系统树上的距
离却较远 ,说明它们之间的遗
传差异较大 ,这可能是由于样
品之间小生境的不同造成的。
此外 ,图 2还显示在当归道地
产区甘肃省岷县采集的 8个
样品 ( 11～ 18号样品 )中 , 12
号与 17, 18号样品 , 11号与
15号样品 , 16号与 13, 14号
样品之间在分子系统树上的
距离更近 ,表明它们在遗传背景上更为接近。 这在进行
生态遗传与当归药材道地性的相关分析时要引起注意。
可见 ,基于当归 RAPD多态性的聚类分析结果
与当归主要产区的地理分布比较吻合 ;同一地理分
·928· 中草药　 Chinese Traditiona l and He rbal Drug s　 2001年第 32卷第 10期
布范围内 ,产地生态环境条件不同 ,当归的遗传背景
又存在不同程度的差异。这为我们从分子生物学角
度研究当归药材道地性提供了新的启示。可以说 ,药
材的道地性不仅仅是一个地理意义上的概念 ,同时
具有广泛的生物学内涵 ,更具有丰富的遗传特质。而
作为现代分子生物学的重要手段 , RAPD分子标记
技术对揭示道地药材与非道地药材之间的地理—生
态—遗传的差异将是一种十分有效的手段。
参考文献:
[ 1 ]　陈永久 ,王　文 ,杨跃雄 ,等 . 冬虫夏草 (Cordyceps sinensis )的
随机扩增多态 DN A及其遗传分化 [ J ] . 遗传学报 , 1997, 24
( 5): 410-413.
[ 2 ]　肖小河 ,刘峰群 ,史成和 ,等 . 中药分子鉴定学概念 [ J] . 中药
材 , 2000, 23( 2): 107-109.
[3 ]　肖小河 .国产姜黄属药用植物 RAPD分析与分类鉴定 [ J ]. 中
草药 , 2000, 31( 3): 209-212.
[4 ]　 Sco tt O R. Ext raction of DN A from Plant Tissue [ J ] . Plant
Mol Biol Manual , 1988, A6: 1-6.
[5 ]　奥斯伯 F,布伦特 R,金斯顿 R E, 等 (颜子颖 ,王海林译 ) . 精
编分子生物学实验指南 [M ] .北京:科学出版社 , 1998.
pH对红豆杉愈伤组织生长、 PAL活性和紫杉醇含量的影响
盛长忠 ,王淑芳 ,王　勇 ,王宁宁
⒇
(南开大学 生物化学与分子生物学系 ,天津　 300071)
摘　要: 目的　研究不同 p H值对东北红豆杉和南方红豆杉愈伤组织生长和紫杉醇含量的影响。 方法　采用不同
p H值的 B5培养基培养两种红豆杉愈伤组织 ,测定生长率、 PAL活性和紫杉醇含量。结果　不同红豆杉愈伤组织所
需最适 p H值不同 ,而有利于愈伤组织生长的 pH值均不利于 PAL活性的提高和紫杉醇的积累。即:愈伤组织生长
快时 , PAL活性将下降 ,紫杉醇含量也减少。结论　 p H值明显影响红豆杉愈伤组织的生长及次级代谢水平 ,从而影
响了紫杉醇的合成与积累。
关键词: 红豆杉 ;愈伤组织 ; PAL;紫杉醇
中图分类号: R282. 13　　　文献标识码: B　　　文章编号: 0253 2670( 2001) 10 0929 03
Effect of pH on callus growth, PAL activity and paclitaxel content of plants of Taxus L.
SHENG Chang-zhong , WANG Sh u-fang , W ANG Yong , W ANG Ning-ning
　　 ( Depa rtment o f Bio chemistr y and Molecular Bio lo g y, Nankai Univ er sity , Tianjin 300071, China)
Abstract: Object　 To study the ef fect of pH on cal lus tissue g row th and pacli tax el content of Taxus
cuspidata Sieb. et Zucc. and Taxus chinensis va r. mairei ( Lemee et Le　′vl. ) Cheng et L. K. Fu. Methods　
The cal lus ti ssues w ere cultured on B5 medium with def ferent pHvalues, and the grow th rate, PAL activi-
ty and paclitaxel content w ere determined. Results　 Different callus ti ssues o f taxus need dif ferent opti-
mum pH values. The pH values, w hich could promo te callus g row th significantly , w ere all inhabitory to
PAL activi ty and accumula tion of paxlitaxel. Conclusion　 pH had g rea t influences on the g row th of the
callus and the level o f secondary metabolism , thereby the synthesis and accumula tion of pacli tax el w ere af-
fected.
Key words: Taxus L. ; callus ti ssue; pheny lalanine ammonialyase ( PAL) ; pacli tax el
　　红豆杉植物中有多种紫杉烷类似物 ,其中 10余
种具有抗肿瘤活性 ,尤其是紫杉醇 ( Pacli tax el )活性
最高。 紫杉醇主要存在于植物树皮中 ,来源有限 ,因
此药源十分紧张。近年来 ,对红豆杉细胞大规模培养
这一有希望长期供应紫杉醇来源技术的研究引起国
内外高度重视。与之有关的研究也有很多报道。 pH
值是影响植物组织生理代谢的重要理化因素之一。
Fet t-Neto
[1 ]指出培养基 pH值在 4. 8～ 7. 8范围内
东北红豆杉愈伤组织生长无明显差别 ,而在我们所
进行的红豆杉愈伤组织培养中发现 ,愈伤组织对 pH
值非常敏感。为此 ,本文以东北和南方红豆杉愈伤组
织为材料 ,研究了 pH值对其生长、 PAL(苯丙氨酸
转氨酶 ,为催化苯丙氨酸形成肉桂酸反应的酶 ,经一
些实验证明在紫杉醇合成过程中 ,肉桂酸可能参与
了紫杉醇前体物质 wintersein的形成 )活性及紫杉
醇含量的影响 ,以期为细胞大规模培养生产紫杉醇
提供理论和实验依据。
1　材料与方法
·929·中草药　 Chinese Traditiona l and He rbal Drug s　 2001年第 32卷第 10期
⒇ 收稿日期: 2001-01-16