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黄芪中一种新葡聚糖的分离纯化与化学结构研究
王　莹 ,赵毅民 ,张起凤 ,乔善义 ,齐春会 ,张永祥⒇
(军事医学科学院毒物药物研究所 ,北京　 100850)
摘　要: 目的　从中药黄芪中提取免疫活性多糖并研究其化学结构。 方法　用乙醇分级沉淀、脱蛋白、 CTAB选择
性沉淀、离子交换及凝胶过滤柱层析的方法从黄芪水提物提取均一多糖 ;运用凝胶过滤法确定多糖的均一性和分
子量 ;运用糖组成分析、甲基化分析、 Smith降解、 IR及 13 CNM R等方法研究多糖的结构。 结果　得到均一多糖
A2Nb。其平均分子量为 360 000,由 D-葡萄糖组成 ,主要连接方式为α-D-( 1→ 4) -Glc,在每 25个葡萄糖中有一个 6-
O位上的分枝。结论　从黄芪中首次分离到具有促脾细胞增殖作用的高分子量葡聚糖 A2Nb。
关键词: 黄芪 ;多糖 ;葡聚糖 ;脾细胞增殖作用
中图分类号: R284. 1　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2001) 11 0962 03
Isolation and structure elucidation of novel glucan from Astragalus monghol icus
W ANG Ying, ZHAO Yi-min, ZHANG Qi-feng , Q IAO Shan-yi, Q I Chun-hui, ZHANG Yong-x iang
　　 ( Beijing Institute of Pha rmaco lo gy and Toxicolog y , Beijing 100850, China)
Abstract: Object　 To isolate the immunoactiv e po lysaccharide f rom Astragalus monghol icus Bunge
and elucidate i ts chemical structure. Methods　 The polysaccharide was purified f rom wa ter ex t racts o f A.
monghol icus by ethanol precipi tation, depro teina tion, selective precipi tation with hexadecy lt ri-methylam-
monium bromide, ion-exchange and gel-fil t ra tion ch romatog raphy. It s homogenei ty and mo lecula r w eight
w ere estima ted by gel-filt ration chromatog raphy, the structure was deduced from sugar analy sis, methy la-
tion analysis, Smi th deg radation, IR and
13
CNMR spect ropho tometry. Results　 A homogeneous polysac-
cha ride A2Nb w as obtained w ith a molecular mass of 360 000, and composed of D-gluco se wi th a majo r
linkage fo rm ofα-D-( 1→ 4) -gluco se. Side chains were found a t 6-O po si tions once in every 25 g lucose
residues. Conclusion　 A high molecular w eight glucan A2Nb was obtained from A. mongholicus fo r the
fi rst time. It showed the abili ty o f promo ting the prolifera tion o f the splenocy tes of mice.
Key words: Astragalus monghol icus Bunge; po lysaccharide; glucan; splenocyte prolifera tion
　　中药黄芪 Astragalus monghol icus Bunge为豆
科黄芪属植物蒙古黄芪的干燥根。味甘 ,性微温 ,是
一种常用扶正中药。对黄芪水溶性多糖的研究已有
一些报道 [ 1～ 3] ,在对黄芪水提液进行系统分离的过
程中我们曾报道了其中的 2种中性杂多糖的化学结
构 ,本文报道一种新的高分子量葡聚糖的分离、纯化
及化学结构研究结果。
1　材料与方法
1. 1　仪器与试剂:蒙古黄芪 Astragalus mongholi-
cus Bunge生药样品由总后药检所鉴定。
测定结构所用的仪器包括: Wa ters 600型高效
液相泵 , Biosep sec S-3000型液相色谱柱 , Waters
410型示差检测仪 , BioRad FTS-65A型红外光谱
仪 , JNM -GX400超导核磁共振仪。 GC使用 PE X 1
型气相色谱仪 , EC-5毛细管柱。 GC-M S用 HP-
5890 /V G-TRIO2气质联用仪 , EC-5毛细管玻璃
柱。单糖标准品 Sephacray l S-400为 Pharmaciachu
出品。 纤维素薄层板为 Merck公司出品。 T系列
Dex tran标准品为 FLU KA公司出品。硼氢化钠及
三氟乙酸为 Aldrich出品。 其它试剂均为国产 AR
级。
1. 2　分离与纯化: 10 kg黄芪以 8倍水煎煮 3次 ,
水煎液合并浓缩至一定浓度 ,用 Sevag法除蛋白 ,以
95%的乙醇分级沉淀 ,除去 30%乙醇沉淀部分后 ,
·962· 中草药　 Chinese Traditiona l and He rbal Drug s　 2001年第 32卷第 11期
⒇收稿日期: 2001-02-20基金项目:国家自然科学基金重点资助项目 No. 39730480
从 60%乙醇沉淀部分得到粗多糖 A2,取 2. 5%的十
六烷基三甲基溴化铵 ( CTAB) 10 mL对粗多糖 A2
100 mg进行选择性沉淀 ,从中得到 CT AB沉淀部
分 A2A和上清部分 A2N。 A2N经 ( Cl- ) DEAE-纤
维素柱柱层析 ,以 H2O和不同浓度的 NaCl梯度洗
脱 ,按峰合并 ,得到水洗脱部分和多个盐洗脱部分。
水洗脱部分浓缩干燥得中性多糖 A2N-1。 经
Sephacry1 S-400纯化 , 从 A2N-1中分离 得到
A2Nb。
1. 3　结构鉴定
1. 3. 1　纯度与分子量的测定 [4 ]:样品 A2Nb及标准
多糖 Dex tran T系列分别经 HPLC(流动相为 0. 01
mol / L的 NaCl溶液 )分离 ,根据峰型判断样品纯
度 ,由标准多糖的分子量对数与洗脱体积求得标准
曲线 ,再由标准曲线求得样品的平均分子量。
1. 3. 2　糖组成分析 [5 ]: A2Nb( 5 mg )溶于 2 mol /L
三氟乙酸 ( TFA) 3 m L中 , 120℃水解封管 2 h,除去
T FA后 ,水解产物溶于 H2O。 一部分进行纤维素薄
层板 T LC法分析 ,展开溶剂 EtOAc-C2H5N-HOAc-
H2O( 5∶ 5∶ 1∶ 3) ,苯胺 -邻苯二甲酸显色。 TLC表
明仅含有葡萄糖。剩余水解产物经硼氢化钠还原 ,制
备成乙酰化衍生物进行气相色谱分析 ,结果表明含
有葡萄糖及微量的阿拉伯糖。
1. 3. 3　甲基化分析 [6, 7 ]: 采用改良的 Hakomo ri法
进行甲基化 ,甲基化产物用 90%甲酸 110℃水解 6
h,蒸干 ,再用 2 mol /L的 T FA 100℃水解 6 h,去酸
后用 NaBH4还原 ,乙酰化 ( Ac2O, 100℃ 1 h)后进
行 GC和 GC-M S分析。
1. 3. 4　高碘酸氧化 [8 ]: 多糖样品 5 mg溶于 0. 01
mol /L的高碘酸钠溶液 10 mL中 ,避光于 4℃氧
化。间隔一定的时间取样用分光光度法测定高碘酸
钠的消耗量 ,直至氧化不再进行为止。在氧化完全的
多糖溶液中加入乙二醇 5滴 ,用水透析 24 h,加
NaBH4于室温还原 12 h,再用 0. 5 mol /L醋酸调至
pH5. 0,透析 24 h,浓缩至干 ,加 1 mo l /L TFA,封管
水解 6 h ,乙酰化后进行 GC分析。
1. 3. 5　红外光谱和核磁共振波谱测定: A2Nb 2 mg
用 KBr压片 ,在 BioRad FTS-65A型红外光谱仪上
测定。 碳谱的测定使用 JNM-GX400超导核磁共振
仪。样品 20 mg溶于 0. 5 m L D2O中 , TM S为内标 ,
常温测定。
2　结果与讨论
2. 1　 A2Nb为白色粉末 ,易溶于水及 DM SO。 凝胶
柱层析显示单一对称洗脱峰 ,表明为均一组分。由其
洗脱时间从标准曲线上求得分子量为 360 000。紫外
扫描无 260 nm的核酸特征吸收峰和 280 nm的蛋白
特征吸收峰。与碘试剂反应不呈蓝色 ,说明该多糖结
构有别于直链淀粉。
2. 2　该多糖以 2 mol /L三氟乙酸完全水解后进行
纤维素薄层层析 ,只检测到一个斑点 , Rf值与葡萄
糖一致 ,提示它由单一葡萄糖组成。酸水解产物经硼
氢化钠还原 ,制成全乙酰化衍生物 ,进行 GC分析 ,
只显示全乙酰化葡萄糖醇一个峰 ,证明其仅含有葡
萄糖 ,确认该多糖为葡聚糖。
2. 3　该多糖按改良的 Hakomo ri法 [6 ]全甲基化 ,以
红外光谱检测 ,甲基化产物在 3 400 cm- 1附近的羟
基吸收峰完全消失 ,表明甲基化完全。 经酸水解、还
原、乙酰化处理后 ,做 GC-M S分析 ,结果见表 1。 将
GC的保留时间 ( tR )及 M S主要碎片 ( m /z)与文献
值 [9 ]比较 ,显示反应产物中有 1, 4, 5-三乙酰基-2, 3,
6-三甲基葡萄糖 , 1, 5-二乙酰基 -2, 3, 4, 6-四甲基葡
萄糖及 1, 4, 5, 6-四乙酰基 -2, 3-二甲基葡萄糖 ,其摩
尔比为 25∶ 1∶ 1,另有极微量的 1, 4, 5-三乙酰基-
2, 3-二甲基阿拉伯糖。表明 1→ 4连接葡萄糖构成了
该多糖的基本骨架 ,在 6-O位上有少量的分支结
构。
表 1　 A2Nb甲基化产物的 GC-MS数据
化合物 tR 克分子比 MS( m /z) 连接方式
1, 4, 5-O-Ac3 -2,
3-O -Me2-Ara
0. 8 Trace 43, 87, 101, 117,
129, 161, 189
5　　 1
→ Ara—
1, 5-O-Ac2 -2, 3,
4, 6-O -Me4-Glc
1. 0 1. 0 43, 45, 71, 87,
101, 117, 129,
145, 161, 205
　 1
Glc—
1, 4, 5-O-Ac3 -2,
3, 6-O -Me3-Glc
1. 6 25. 0 43, 45, 71, 87,
107, 129, 145,
161, 205, 233
4　　 1
→ Glc—
1, 4, 5, 6-O-Ac4 -
2, 3-O -Me2-Glc
2. 4 1. 0 43, 45, 85, 101,
117, 129, 145,
161, 205
4↓ 6 4
→ Glc—
　　* Reten tion time of alditol acetate relat ive to 1, 5-di-o-acetyl-2,
3, 4, 6-tet ra-o-meth yl-D-glucitol。
2. 4　 A2Nb用高碘酸钠完全氧化 , Smi th降解产物
的 GC分析结果主要是赤藓醇及少量的丙三醇。 其
摩尔比约为 26∶ 1。赤藓醇为 1, 4-及 1, 4, 6-葡萄糖
残基的降解产物 ,丙三醇为非还原末端葡萄糖残基
的降解产物。这一结果与甲基化分析的结果一致。
2. 5　 A2Nb的 IR谱中除含有多糖的特征吸收峰
外 ,在 840 cm- 1有一个 α-葡聚糖的特征吸收峰。
13
CNM R中端基碳信号在δ101. 7,表明 A2Nb的糖
苷键为α-型。将所得结果与文献 [2, 10 ]相对照 ,确定了
13
CNM R中各信号的归属 (表 2)。表明多糖 A2Nb
的结构与文献 [2 ]中的葡聚糖 AG-1结构相似。
·963·中草药　 Chinese Traditiona l and He rbal Drug s　 2001年第 32卷第 11期
表 2　 A2Nb和其它多糖的 13CNMR数据
样品 化学位移
C-1 C-2 C-3 C-4 C-5 C-6
A2N b 101. 7 73. 4 75. 2 78. 8 73. 0 62. 2
AG-1 101. 4 73. 3 75. 1 78. 7 73. 1 62. 3
　　上述分析结果表明 , A2Nb为α构型的葡萄糖 ,
分子量 360 000。主链由 1, 4连接的葡萄糖构成的 ,
每 25个葡萄糖残基有一个 6-O上的分枝。分子中还
有少量的端基葡萄糖存在。
以 α-D-( 1→ 4) -Glc为主链的黄芪葡聚糖已有
报道 [1, 2 ] ,但其分子量均在 100 000以下 ,且 6-O位分
支点的比例与 A2Nb不同。 药理活性评价表明 ,
A2Nb具有较强的促小鼠脾细胞增殖的作用 ,其药
效作用机制正在进一步的研究中。
参考文献:
[1 ]　方积年 . 黄芪葡聚多糖的化学结构 [ J] . 化学学报 , 1988, 46
( 11): 1101-1104.
[2 ]　黄乔书 ,吕归宝 ,李雅臣 ,等 . 黄芪多糖的研究 [ J] . 药学学报 ,
1982, 17( 3): 200-206.
[ 3 ]　方圣鼎 ,徐小异 ,叶纯渠 ,等 . 中药黄芪有效成分的分析 [ J ].
有机化学 , 1982, ( 2): 26-31.
[4 ]　魏运安 ,方积年 . 高效凝胶色谱法测定多糖纯度及分子量 [ J ].
药学学报 , 1989, 24( 7): 532-536.
[ 5]　 Jacob L. Simul taneous gas-liquid chromatog raphic determina-
tion of ald oses and aldu ronic acids [ J ] . J Ch rom, 1987, 408:
245-253.
[ 6 ]　方积年 . 多糖的甲基化分析方法 [ J ] . 国外医学药学分册 ,
1986, 13( 4): 222-226.
[7 ]　 Narui Takao, Takahashi Kunio, Kobay ashi M iyoko, et a l.
Permeth ylation of polysaccharides b y a modified Hak omori
method [ J] . Carboh ydr Res, 1982, 103( 2): 293-295.
[ 8]　刘方明 ,李志孝 ,孟廷发 ,等 .红芪多糖 RHG的分离纯化与化
学结构 [ J ]. 药学学报 , 1997, 32( 8): 603-606.
[ 9 ]　 Bjo rndal H, Hellerqvist C G, Lindberg B, et al . Gas liquid
chromatograph y and mass sp ectromet ry in m ethly tion analysis
of polysacch aride [ J ] . Ang ew Ch em ( In t Ed ) , 1970, 9 ( 9):
610-619.
[ 10 ]　张维杰 . 糖复合物生化技术研究 [M ] .杭州:浙江大学出版
社 , 1994.
多歧沙参化学成分的研究
赵奎君 1 ,刘锁兰 1 ,杨　隽 1 ,李秀青 1 ,颜小林 1 ,郑成贵 1 ,屠鹏飞 2 ,陈虎彪 2⒇
( 1. 北京军医学院药学系 ,北京　 100071;　 2. 北京大学药学院 ,北京　 100083)
摘　要: 目的　对多歧沙参 Adenophora wawreana的根进行较系统的化学成分研究。 方法　采用系统溶剂分离法
和硅胶柱色谱法进行提取分离 ,用光谱法 ( IR、 1HNM R、13CNM R、M S等 )进行结构鉴定。 结果　从石油醚提取部位
分离得到 12个化合物 ,鉴定了其中 9个化合物的结构 ,它们分别为十六酸 -3-β-谷甾醇酯 (β -sitoster yl h exade-
canoate, Ⅰ )、十八酸-3-β-谷甾醇酯 (β -sitoster yl oc tadecanoat e, Ⅱ )、α-香树脂醇乙酸酯 (α-am yrin acetate, Ⅲ )、羽
扇豆烯醇乙酸酯 ( lupeo l acetate , Ⅳ )、羽扇豆烯酮 ( lupenone, Ⅵ )、木栓酮 ( friedelin, Ⅶ )、β-谷甾醇 (β -sito ster ol,
Ⅸ )、 7α-羟基 -β -谷甾醇 ( lkshustero l, Ⅹ )和胡萝卜苷 ( dauco stero l, ⅩⅡ )。结论　 9个化合物均首次从本植物中分离
得到 ,其中化合物Ⅰ 、Ⅱ 、Ⅲ 、Ⅳ、Ⅶ 为首次从沙参属植物中分离得到。
关键词: 多歧沙参 ;沙参属 ;化学成分
中图分类号: R284. 1　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2001) 11 0964 03
Studies on chemical constituents of Adenophora wawreana
ZHAO Kui-jun1 , L IU Suo-lan1 , YANG Jun1 , L I Xiu-qing1 , YAN Xiao-lin1 ,
ZHENG Cheng-gui1 , TU Peng-fei2 , CHEN Hu-bia o2
　　 ( 1. Depa rtment o f Pharmacy, Beijing Medical Co llege o f PLA, Beijing 100071, China; 2. Co lleg e o f Pharmacy, Beijing
Univ ersity, Beijing 100083, China )
Abstract: Object　 To study systematically on the chemical consti tuents of th e ro ots o f Adenophora
wawreana Zahibr. . Methods　 The chemical constituents w ere ex t racted and isolated sy stematically w ith
solvents and silica g el chromato graphy. Thei r st ructures w ere determined on the basis o f spect ral data
( IR,
1
HNM R,
13
CNMR and M S) . Results　 Tw elv e compounds w ere obtained, nine of them were identi-
·964· 中草药　 Chinese Traditiona l and He rbal Drug s　 2001年第 32卷第 11期
⒇收稿日期: 2000-12-13基金项目:教育部高等学校博士学科点专项科研基金资助项目 No. 9501023作者简介:赵奎君 ( 1959-) ,男 (满族 ) ,辽宁省抚顺市人 ,副教授 ,硕士学位。 毕业于中国药科大学生药专业 ,现任中国人民解放军北京军医学院药学系副主任 ,从事生药学方面研究。 Tel: ( 010) 66947773