全 文 ：测试 ,进样量各为 10μL,分析结果见表 2。
表 1　回收率实验结果
样　品
进样浓度
( mg /mL)
峰面积
回收率
(% )
平均值
(% )
RSD (% )
(n= 4)
大豆苷 0. 038 6 23 894 23 869 23 919 23 892 99. 74 0. 085 5
大豆黄素 0. 016 5 56 530 57 006 57 489 57 008 100. 01 0. 686 8
染料木苷 0. 017 1 58 682 59 732 59 137 59 184 100. 08 100. 05 0. 726 4
染料木素 0. 041 5 98 595 98 465 98 724 98 593 100. 36 0. 107 2
表 2　导入基因大豆后代的异黄酮的含量 (mg /100 mg)
样品 大豆黄素 染料木素 大豆苷 染料木苷
Y10 -10-3 0. 000 5 0. 001 3 0. 009 5 0. 017 6
Y10 -12-1 0. 001 2 0. 001 5 0. 011 7 0. 010 4
Y10 -12-2 0. 010 2 0. 012 5 0. 057 3 0. 056 8
Y10 -15-3 0. 001 2 0. 001 9 0. 007 2 0. 012 0
Y10 -15-13 0. 001 1 0. 002 0 0. 018 3 0. 028 7
Y10 -30-1 0. 005 7 0. 008 4 0. 027 9 0. 030 1
Y10 -30-2 0. 004 8 0. 005 6 0. 018 8 0. 020 8
Y10 -30-3 0. 002 0 0. 003 8 0. 019 8 0. 032 4
Y10 -42-1 0. 000 8 0. 001 2 0. 011 1 0. 015 2
Y10 -43-2 0. 001 5 0. 002 4 0. 021 5 0. 031 4
Y10 -53-1 0. 001 0 0. 002 3 0. 011 5 0. 021 1
湘春豆 10号 0. 001 2 0. 001 7 0. 015 3 0. 018 5
3　小结
3. 1　对 12批样品 4种异黄酮类成分含量测定结果
表明 ,导入西洋参 DNA基因后的大豆异黄酮类含
量发生了广泛的变异 ,与样本湘春豆 10号比较 ,就
大豆黄素成分而言 ,高于受体亲本的样品数有 5个 ;
染料木素成分 ,有 8个样品明显高于亲本 ,大豆苷成
分 ,有 6个样品 ;染料木苷成分 ,有 7个样品。 其中
Y10-30-2, Y10-30-3, Y10-12-2, Y10 -30-1样品的 4种
成分含量大大的高于亲本湘春豆 10号。此结果也表
明 ,西洋参 DN A导入大豆后 ,提高了大豆的有效成
分含量 ,从中可望筛选出有效成分含量较高的株系
进一步栽培 ,培育出大豆新的种资源。
3. 2　经反复实验 ,此 HPLC法能同时测定大豆中
的 4种异黄酮类成分的含量 ,分离良好 ,方法比较简
便 ,快速。
参 考 文 献
1　麻　浩 ,等 .中草药 , 2000, ( 1): 51
2　郭建平 ,等 .中草药 , 1995, 26( 3): 163, ( 6): 298
3　白井智之 ,等 .第 57回日本癌学会总会 ,横滨 , 1998, 92
4　国家医药管理局中草药情报中心站编 .植物药有效成分手册 .
北京:人民卫生出版社 , 1986: 493
5　早川顺子 ,等 .药学杂志 , 1984: 104( 1): 50
( 1999-02-09收稿 )
SFE-HPLC测定银杏叶粗提物中黄酮类化合物的含量
第二军医大学药学院药物分析教研室 (上海 200433)　　 佳红 　柳正良
摘　要　采用超临界流体萃取法提取银杏叶粗提物中总黄酮苷 ,确定最佳萃取条件为: 压力 41 364 Pa;温度
60℃ ;静态萃取时间 4 min;动态萃取体积 4 m L;改性剂加入量 0. 2 m L乙醇 ;用 HPLC测定含量 ,结果表明:
本法简便快速 ,萃取完全 ,为银杏叶粗提物的分离、纯化、测定提供了一种有效可靠的方法。
关键词　超临界流体萃取法　银杏叶粗提物　黄酮类化合物　 HPLC法
　　银杏叶为银杏科植物银杏 Ginkgo biloba L.的
叶子 ,经现代药理和临床研究表明 [1 ] ,银杏叶提取物
可软化血管 ,增加冠状动脉血流量 ,对心绞痛 ,脑血
管疾病具有显著疗效 ,并广泛用于临床。而黄酮类化
合物为其主要有效成分之一 ,其制剂质量通过测定
黄酮含量来控制 [2, 3 ]。传统的提取方法均采用有机溶
剂提取 ,费时且残留有害溶剂 ,超临界流体萃取
( SFE)因其特有的高选择性、高效性及低毒害的优
点 ,在中草药的提取方面具有广泛应用 [4～ 6 ]。我们采
用 SFE技术萃取银杏叶粗提物中的黄酮类成分 ,用
HPLC测定含量 ,提取效率高 ,杂质少 ,具有一定的
优点。
1　试剂与仪器
1. 1　仪器: ISCO 100DX, 100DM泵 , SFX2-10M超
临界流体萃取仪 (美国 ISCO公司 ) , Wa ters高效液
相色谱仪 (美国 Waters) , N EC pow ermate 433电子
计算机 (日本 N EC公司 )
1. 2　试剂: 槲皮素对照品 (中国药品生物制品检定
所 ) ,山柰素对照品 ( Sigma公司 ) , CO2 ( 99% ) (上海
酒精总厂 ) ,甲醇为色谱纯 ,水为重蒸水 ,其余试剂均
为分析纯。
2　方法与结果
2. 1　色谱条件: 色谱柱: μ BondapakTM C18 ( 300
mm× 3. 9 mm , Waters) ;流动相: 甲醇 -0. 4%磷酸
·101·中草药　 Ch inese Tradi tional and Herbal Drugs　 2000年第 31卷第 2期
Address: She Jiahong , Department of Analysi s Materia M edica, College of Pharmacy, Second Mili tary Medical University, Shanghai
( 60∶ 40) ;流速: 1 mL /min;检测波长: 266 nm;柱
温:室温 ;进样量: 20μL。
2. 2　对照品溶液的制备:精密称取干燥至恒重的槲
皮素对照品 12. 70 mg ,山柰素对照品 10. 01 mg ,分
别加甲醇溶解 ,定容于 10 m L容量瓶中 ,即为对照
溶液。
2. 3　供试品溶液的制备: 精密称取银杏叶粗提物
20 mg,装入萃取池中 ,加入 0. 2 mL乙醇 ,在 41 364
Pa、温度 60℃下 ,静态萃取 4 min,动态萃取 4 mL,
以乙醇为接收液 ,萃取完毕定容至 10 mL,然后将萃
取液置于 50 mL烧瓶中 ,加入 1. 5 mL 25%盐酸溶
液 ,混匀 ,水浴回流 30 min,迅速冷却至室温 ,然后
转移至 25 mL量瓶中 ,加甲醇至刻度 ,摇匀 ,作为供
试品溶液。
2. 4　标准曲线的绘制: 精取槲皮素对照品溶液
( 1. 270 mg /mL) 2. 5, 5, 10, 20, 40μL,置于 1 mL容
量瓶中 ,依次加入山柰素对照品溶液 ( 1. 000 mg /mL)
2. 5, 5, 10, 20, 40μL,加甲醇至刻度 ,混匀后分别进样
测定 ,以峰面积 ( A )对进样浓度 (C )进行回归 ,回归方
程为: A槲皮素 = 67 596. 7C+ 58 380, r= 0. 999 9( n=
5) ; A山柰素= 68 601C- 568 6, r= 0. 999 7(n= 5)。
　　标准品的色谱图　　　　　　样品的色谱图
1-槲皮素　 2-山柰素
图 1　提取物水解液的色谱图
2. 5　加样回收率试验:精密称取银杏叶粗提物 (约
20 mg ) , 6份 ,各精密加入槲皮素和山柰素对照品
25, 50μg ,按样品分析方法操作 ,计算回收率 ,测定
结果见表 1。
表 1　回收率试验结果
加入 25μg( n= 3) 加入 50μg ( n= 3)
回收率 (% ) RSD (% ) 回收率 (% ) RSD (% )
槲皮素 98. 36 3. 52 96. 23 2. 41
山柰素 97. 20 2. 86 94. 81 3. 27
2. 6　重现性试验:按样品测定方法 ,对银杏叶粗提物
进行 5次平行试验 ,结果分别为 RSD槲皮素 = 4. 13%
(n= 5) ; RSD山柰素 = 5. 24% (n= 5)。
2. 7　样品测定:分别精密吸取对照品溶液、供试品
溶液适量 ,进样 ,按上述色谱条件测定 ,以外标法计
算含量 ,结果槲皮素含量为 0. 609 mg ,山柰素含量
为 0. 472 mg;总黄酮苷含量= 2. 64×山柰素+ 2. 51
×槲皮素= 2. 78 mg。
3　讨论
3. 1　超临界流体萃取条件的选择
3. 1. 1　萃取压力的选择:超临界 CO2流体在一定
的温度下 ,密度和介电常数可随压力增大而增加 ,但
不呈线性相关。到达某一压力后 ,溶解能力随压力增
加而变化不大。我们在 27 576～ 44 811 Pa之间 ,每
隔 3 447 Pa萃取一个样品 ,结果见图 2,从图中发现
采用 41 364 Pa压力较好。
3. 1. 2　改性剂的选择: 超临界 CO2流体的极性较
弱 ,难以萃取出极性较强的物质 ,因此通过加入极性
改性剂提高萃取效率 ,经试验采用乙醇为改性剂 ,无
毒且萃取效率高 ;同时对其加入量进行考察 ,结果见
图 2,从图中可见采用加入 0. 2 mL乙醇为最佳。
3. 1. 3　萃取温度的选择: 在一定的压力下 ,温度升
高 ,溶质的蒸气压升高 ,溶解度增加 ,但升高温度 ,
CO2流体密度变小 ,溶解能力下降 ,对 55℃～ 70℃
间每隔 5℃萃取一个样品 ,结果见图 3,从图中可见
以 60℃时萃取效果较好。
3. 1. 4　动态萃取体积的影响:固定其它因数 ,分别
选择 3, 3. 5, 4, 4. 5, 5 mL流体体积进行考察 ,发现 4
mL流体萃取较适宜 ,结果见图 2。
3. 1. 5　静态萃取时间的影响:整个萃取过程同时存
在溶质的传导和扩散 ,适宜的静态萃取时间有利于
溶质的溶解 , 考察 2, 3, 4, 5, 6 min静态萃取时间对
A-压力　 B-加入改性剂　 C-温度　 D-动态萃取体积　 E-静态萃取时间
图 2　各条件对萃取总黄酮苷量的影响
·102· 中草药　 Ch inese Tradi tional and Herbal Drugs　 2000年第 31卷第 2期
结果的影响 ,结果见图 2。
综上萃取的最佳条件为: 压力 41 364 Pa;温度
60℃ ;改性剂 0. 2 mL乙醇 ;动态萃取体积 4 mL;静
态萃取时间 4 min。
3. 2　对样品的水解 ,经试验: 10 mL的萃取液加入
1. 5 mL 25%盐酸液水解 30 min,水解完全。
3. 3　在我们所测的样品中 ,未发现异鼠李素的存
在。
3. 4　采用本法测定银杏叶粗提物中黄酮苷的含量 ,
方法简便 ,快速 ,重现性好。
3. 5　文献报道 [ 7]在测定槲皮素和山柰素时有拖尾
现象 ,本文的色谱条件两者分离度好 ,峰形对称 ,杂
质无干扰。
参 考 文 献
1　 Beek T A. J Chromatogr, 1991, 543: 375.
2　 Hasler A, et al . J Chromatog r, 1992, 605( 1): 41
3　栗晓黎 ,等 .药物分析杂志 , 1998, 18( 3): 186
4　 Ches ter T L, et al . Anal Chem, 1994, 66: 106
5　 Jerry W K. J Ch romatog r Sci , 1990, 28( 1): 9
6　 Sanagi M M, et al . J Chromatog r Sci, 1993, 31( 1): 20
7　谢大年 ,等 .色谱 , 1994, 12( 5): 384
( 1999-02-04收稿 )
纤维素酶在黄连提取工艺中的应用
黑龙江省医药工业研究所 (哈尔滨 150040)　　马桔云 　赵晶岩　姜　颖* * 　于喜水
摘　要　用黄连提取小檗碱之前 ,经纤维素酶进行酶解 ,可以提高小檗碱的收率 ,从而考察是否可将纤维素酶
用于其它中药材的提取中 ,达到提高有效成分收率的目的。
关键词　纤维素酶　酶解　盐酸小檗碱
　　近年来 ,纤维素酶在国外各个领域得到广泛应
用 ,例如:食品工业 ,饮料工业 ,制取各种糖类以及提
取天然产物等。然而我国的工业化用酶目前仍不普
遍。大部分的中药材的细胞壁是由纤维素构成的 ,植
物的有效成分往往被包裹在细胞壁内 ;纤维素则是
由 β -D-葡萄糖以 1, 4-β葡萄糖苷键连接 ,用纤维素
酶酶解可以破坏 β-D-葡萄糖键 ,使植物细胞壁破
坏 ,有利于对有效成分的提取。 根据这个原理 ,我们
选用黄连提取小檗碱 ,对其加酶组和未加酶组进行
对有效成分小檗碱提取的影响。
1　实验材料和药品
纤维素酶粗品 (活力单位 2 000 U /g )海林万力
达集团公司提供 ;盐酸小檗碱对照品中国药品生物
制品检定所提供 ;黄连为黑龙江省药材站购进 ,经黑
龙江省医药工业研究所生药鉴定室王有志副主任药
师鉴定为毛茛科植物黄连 Coptis chinensis Franch.
的根茎 ;日本岛津 CS-930双波长薄层扫描仪。
2　实验方法与结果
2. 1　黄连中小檗碱提取工艺 [1 ]:黄连粗粉 50 g (酶
解 ) 3倍量的水浸泡 , 0. 3% H2 SO 4
pH5 40℃水浴恒温 90 min 置 渗 漉 筒 中 　
0. 3% H2 SO4渗漉
收集渗漉液 500 m L 渗漉液
用石灰乳调 pH 10～ 12
沉淀、抽滤 滤液
用浓 HCl调 pH1～ 2,加精制食盐使含盐量达到 7%
搅拌充分溶解 ,静置 24 h ,得粗品 60℃烘干 干燥粗品
图 1　层析图
2. 2　黄连中小檗碱的酶提取工艺:
此工艺比原工艺多了一步酶解实
验 ,即每克生药 10 U的量 ( 0. 25 g )
加入纤维素酶 ,充分搅拌 ,其它工艺
同原工艺 2. 1。
2. 3　薄层层析:将加酶粗提取物甲
醇溶液 ( 1) ,未加酶粗提物甲醇溶液
( 2) ,盐酸小檗碱甲醇溶液 ( 3) ,于硅
胶 G薄层板上展开 ,取出 ,晾干 ,紫
外灯下观察比较。
展开剂:正丁醇 -冰醋酸-水 ( 7∶
1∶ 2) ,展距 10 cm。 层析结果见图 1。
2. 4　收率与提取结果的比较:对不同工艺提取物进
行含量测定 [2 ] ,结果见表 1。
3　小结与讨论 [2 ]
从纤维素酶提取黄连有效成分小檗碱实验中 ,
可以初步看出 ,在纤维素酶的作用下 ,小檗碱提取量
大大提高 ,由 t检验可以看出 P < 0. 01,两种工艺提
·103·中草药　 Ch inese Tradi tional and Herbal Drugs　 2000年第 31卷第 2期
Address: Ma Ju yun, Hei long jiang Ins ti tu te of Pharmacentical Indus t ry, Harbin马桔云　女 , 1984年毕业于黑龙江中医学院 ,医学学士 ,副主任药师 ,黑龙江医药工业研究所植化研究室主任。 主要从事中药的开发与新药的研究。 参与多个新药的研究 ,在《中成药》、《中国中药杂志》、《黑龙江医药》等学术刊物上发表论文 20余篇。
* * 黑龙江完达山制药厂