全 文 ：·药材·
诃子及其混淆品 RAPD分析△
广州中医药大学临床药理研究所 ( 510405)　　黄　丰 　王培训　周　联　曹柳英　梁瑞燕
广州中医药大学中药资源研究室　　　　　　徐鸿华　　刘军民
摘　要　目的:对不同品种的诃子进行 DNA指纹图的鉴别研究 ,并对 RAPD在中药材鉴别中存在的一些问题进
行研究。方法: 应用 RAPD技术对诃子及其常见混淆品进行 DNA指纹图多态性的比较。结果: DN A指纹图显示 ,
各样品间具有不同的遗传关系 ,根据这些差别可进行鉴别 ,同时对存在的若干问题提出了解决的方法。结论: RAPD
可以有效地鉴别诃子及其混淆品。
关键词　诃子　 RAPD　 DN A指纹图
Identification of the Fruit of Terminalia chebula from Its Comfusable Varieties by
RAPD Analysis
　　 Institute o f Clinica l Pha rmaco log y , Guang zhou Univ er sity of TCM ( Guang zhou 510405)　 Huang Feng , Wang Peixun,
Zhou Lian, Cao Liuying and Liang Ruiyan
　　Depar tment of Resource of TCD, Guang zhou Univ e rsity of TCM　Xu Honghua and Liu Junmin
Abstract　　 Dif ferent v arieties of Term inalia chebula Retz. w ere identi fied by DN A finger prints, and
a t the same time, some problems encountered during the applica tion of RAPD for the identi fica tion of
TCM were studied. The polymo rphic fea tures of DN A finger prints o f di fferent species w ere compared.
Results o f the study show ed that they w ere dif ferently related in heredi ty w hich can provide a basis for the
di fferentia tion of one species f rom the o ther. M eans fo r the solution o f problems arised during RAPD
application were suggested. It was concluded that RAPD is an effectiv e method to identi fy T . chebula f rom
i ts confusable v arieties.
Key words　　 f ruit o f Term inal ia chebula Retz.　 RAPD　 DNA finger prints
　　随机扩增多态 ( RAPD) 是在聚合酶链反应
( PCR) 技术上发展起来的 DNA多态性检测技
术 [1, 2 ] ,具有微量、无放射污染、准确、快速等优点 ,已
成功地用于遗传多样性检测、基因作图、品系分类及
鉴定等。近几年在中药材中也得到了广泛应用 ,如西
红花 [3 ]、溪黄草 [ 4]、郁金 [5 ]、细辛 [6 ]、人参 [7 ]等。
诃子为我国重要南药之一 ,为使君子科植物诃
子 Terminal ia chebula Retz. 和绒毛诃子的干燥成
熟果实 ,具有敛肺、敛肠之功效。 目前市场流通的商
品来源较为复杂 [8 ] ,为准确鉴定和使用诃子药材 ,我
们应用 RAPD技术进行了鉴定。对中药材的 RAPD
鉴别中尚存在如何统一模板浓度、模板降解度对反
应的影响、合适引物的选择等问题进行了探讨。
1　材料和方法
1. 1　材料:见表 1,所有样品均为原产地购买 (采集
时间不详 ) ,并由徐鸿华教授鉴定。
1. 2　试剂 Tris ( B. M. ) , SDS ( serv a ) , Ma rker (为
加拿大 MBI的 100 bp DN A Ladder Plus) , Taq酶、
随机引物 (上海 Sango ) ,琼脂糖 ( Promega ) ,其余试
剂均为国产分析纯。
1. 3　主要仪器: 低温高速离心机 ( Beckman GS-
15R) ;紫外 -可见分光光度计 ( Pharmacia 4000) ;凝
胶成像仪 ( UV P GDS 7600G) ;低温恒温式电泳仪
( LKB) ; PCR仪 ( PE 2400)。
1. 4　 DNA提取:称取各中药材样品 0. 3 g用玻璃
砂研磨 ,采用我们改进的高盐、低 pH法 [9 ]获得总
DNA。
1. 5　 DNA扩增: 反应体积为 25μL。其成分为:
·697·中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　 2000年第 31卷第 9期
Address: Huang Feng, Ins ti tu te of Clinical Pharmacolog y, Guangzhou Universi ty of TCM, Guang zh ou黄　丰　男 , 29岁 ,广州中医药大学 97级博士生 ,专业为中西医结合基础 ,主要研究方向为分子生物学技术在中药鉴别中的应用。曾参加国家、部、省级课题共 6个。已发表论文共 5篇。参与编辑《免疫中药学》 ;主编教材《分子生物学技术在中药鉴别中的应用》 ,该书为国家级中医药 继续教育项目用书。 现在北京军事医学科学院博士后流动站 ,研究方向为基因芯片 ( 2000年 8月开始 )。 E-mai l: xytong
@ public. guangzhou. gd. cn△国家中医药管理局科研基金 ( 950379) ,广东省五个一工程科研基金
MgCl2 2. 5μL ( 25 mmol /L ) ,引物 2μL ( 5μmo l /
L ) , BSA 1μL( 25 g /L) , 4种 dN T P 0. 25μL ( 100
mmol /L ) , 10× buf fer缓冲液 2. 5μL (无 Mg2+ ) ,
2. 0 U Taq酶 , 25 ng样品。循环参数为先 94℃ ,变
性 3 min;然后 94℃ , 1 min; 39℃ , 45 s; 72℃ , 60
s; 35个循环。 最后 72℃ , 3 min。
1. 6　扩增产物检测: 取扩增产物 10μL于 1. 5%
琼脂糖凝胶上用 1× TAE电泳缓冲液电泳 ,用 EB
染色 30 min于凝胶成像仪上进行分析。
1. 7　数据分析:电泳图谱中每 1条带代表 1个引物
结合位点 ,根据分子迁移率及其有无进行统计: 有带
计为 1,无带计为 0。任意两个样本间的遗传差异用
遗传距离指数 D衡量。
F= 2Nxy /Nx+ Ny　 D= 1- F
F为共享度 , Nx、 Ny分别为第 x 个和 y个体拥有的
RAPD标记数 , N xy为 x和 y个体共享的 RAPD标记数。
采用 Phlip软件包的 U PGM A软件进行分析 ,
建立种系发生图。
2　结果和讨论
2. 1　 DNA提取: 核酸提取是核酸研究的第一步 ,
中药材加工运输的过程中 ,均可能受到外源 DNA
的污染 ,因此 ,我们在取样之前 ,先将样品洗净 ,并用
紫外照射 30 min以去除外源 DNA。取样时 ,最好选
用核仁提取 DNA。经过反复提取 ,发现各种诃子的
皮和壳较难得到 DNA,而种仁 DNA含量较为丰
富。但需注意的是 ,仁含有较多油状物质 ,必须用氯
仿 -异戊醇 ( 24∶ 1)多抽提 1次 ,另外 ,各样品 DNA
的 TE溶液都为不同程度的黄褐色 ,经纯化后也难
以去除 ,我们在 PCR反应中加入了 BSA ( 1. 0
g /L) ,使 PCR反应得到了有效扩增。
2. 2　 DNA模板浓度对 RAPD结果的影响:经过多
次实验比较 ,本研究采用了 25 ng /25μL,重复性较
好。关于 RAPD的最佳浓度有关报道不一 ,通常在
10～ 100 ng 之间 [ 4, 5] ,我们认为不同的品种其最佳
扩增浓度可能是不相同的 ,实验时应分别进行对比
研究以找到最佳扩增浓度。
2. 3　反应介质: BSA对 PCR的扩增有一定影
响 [10, 11 ] ,在龟板和鳖甲的 PCR扩增中用各种方法
甚至 PROMEGA的纯化试剂盒均不能去除反应中
的抑制物 ,但加入 BSA后则获得了较好的扩增。许
多中药材中所含杂质较多 ,有时经多次纯化也难以
去除 ,所以在反应中加入 BSA能中和抑制 PCR反
应的物质 ,使反应顺利进行 ,经过比较 ,我们在实验
时采用了 1. 0 g /L ( BSA) 进行 PCR扩增 ,得到了
清晰的指纹图 ,所以在反应中应当加入 BSA以使
PCR扩增顺利进行。另外 , Mg2+ 、 dN T P也能影响扩
增 ,主要是影响某些弱带的扩增 ,建议在各物质的有
效扩增范围内 ,应尽量选取偏低的浓度 ,以减少非特
异扩增。
2. 4　 DN A纯度及降解度: 在本研究中 ,所用样品
均为原产地干品 ,所得 DNA纯度大多较低 (见表
1) ,说明有不同程度的杂质存在 ,但经过稀释等处理
后并不影响反应的进行 [12 ]。由于许多中药材均含有
未知杂质 ,有时难以提到纯度较高的 DNA,研究发
现只要采取适当措施 [11 ] ,并不影响 PCR的反应 ,所
以过多的纯化是不必要的。
表 1　样品基原
样品 产地 纯度
A260 / A280
1.绒毛诃子 Terminalia chebula var. tomentella Kurt. 云南 1. 01
2.诃子 T . chebula Retz. 广东 1. 05
3.小诃子 T . chebula Retz. f. macrocarpa 广东 1. 05
4.恒河诃子 T . chebula var. gan getica ( Robx. ) C. B. Clar ke 广西 1. 04
5.银叶诃子 T .a rg yro phylla pott. et Prain. 云南 1. 03
6.大诃子 T . chepula f. macrocarpa nov. ined. 广东 1. 06
7.毛诃子 T .biller ica ( Gaertn. ) Roxb. 云南 1. 08
　　由于各种原因 ,中药材大都降解程度较大 ,所以
用完整的基因组 DNA来进行扩增是难以实现的 ,
但只要引物选择合适 ,在 200～ 2 000 bp内是能够
扩增出有效 DNA指纹图的 (图 1、表 2)。
左→右 ( 1→ 7孔 )
1-绒毛诃子 (云南 )　 2-诃子 (云南 )　 3-小诃子 (广东 )　 4-
恒河诃子 (广西 )　 5-银叶诃子 (云南 )　 6-大诃子 (广东 )　
7-毛诃子 (云南 )　 8-Marker。 从上至下为 3 000, 2 000,
1 500, 1 200, 1 031, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200,
100。
a-引 物 S354: CACCCGGATG; b-引 物 S30: GT GATC-
GCAG
图 1　样品 DNA指纹图
2. 5　 PCR结果: 本实验所得 DNA指纹图多态性
的特征为: ( 1)能够产生清晰 DNA指纹图的引物
少 , 121条引物仅筛选出 8条 ,占 6. 61% ,根据这些
引物可进行鉴别。 ( 2) 8条引物中有 1条各样品指纹
图基本一致 (图 1-a) , 7条能产生多态性 (图 1-b为
其中一条 ) ,低于我们在其他中药研究中的比率 ,说
·698· 中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　 2000年第 31卷第 9期
表 2　样品 DNA指纹图
引　物 序　列
Primer Sequence
S30 GTGATCGCAG
S161 ACCTGGACAC
S207 GGCAGGCT GT
S208 AACGGCGACA
S341 CCCGGCA TAA
S359 GGACACCACT
S429 TGCCGGCT TG
S443 CTGT TGCT AC
总数 8
明各样品之间有着较近的亲缘关系。
2. 6　多态性的遗传分析:按 1. 7中的公式进行了计
算 ,结果见表 3。
　　从图 2中可看出 , 4号 (恒河诃子 )与 6号 (大诃
子 )亲缘关系最近 ,而与 1号 (绒毛诃子 )关系最远。
现在关于诃子的品种及分类存在一定争论 ,从遗传
树来看 ,绒毛诃子 ( 1号 )与诃子 ( 2号 )的相似性系数
仅为 38. 17% ,应为诃子的变种 ,这与文献 [13 ]等观点
一致。这种基因的改变除了已导致外观的改变外 ,对
表 3　 7个样本间的遗传距离 (D)
1 2 3 4 5 6 7
1 0. 000 0
2 0. 612 9
3 0. 757 6 0. 556 6
4 0. 657 1 0. 526 3 0. 150 0
5 0. 600 0 0. 488 4 0. 333 3 0. 191 5
6 0. 764 7 0. 567 6 0. 230 8 0. 122 0 0. 260 9
7 0. 515 2 0. 611 1 0. 421 1 0. 300 0 0. 300 0 0. 282 1 0. 000 0
图 2　根据 RAPD分
析的数据 ,用
UPGMA法得
到 的系 统树
(样品序号同
表 1)
诃子的药用成分会产生何种影
响 ,是值得深入研究的课题。
传统的中药鉴别方法主要
靠外观性状特征 ,有经验的老
药工根据药物的形状、大小、色
泽、表面特征、质地、断面、气味
等进行鉴别 [ 14] ,现代则从生物
分类学、组织学、化学的角度建
立了比较客观的中药质量评价
标准 [ 15]。随着科学技术的迅速
发展 ,染色体分析、同功酶分
析、蛋白质分析及免疫测定 [16 ]
等研究方法也广泛地应用到中
药的品质评价中。
80年代 ,随着分子生物学
的迅猛发展 [17, 18 ] ,生物分类的
手段从形态表征扩展到了生物
遗传物质 DNA, DN A序列含有生命有机体构建、
维持和繁殖生命所必需的遗传信息 [ 19, 20]。一方面 ,
同种生物具有相同的 DNA序列 ,保持同种生物体
的遗传性状 ,具有相对的稳定性 ;另一方面 ,这些物
种又具有多态性 [21, 22 ] ,分子生物学的研究发现 ,生
物的“物种”的多样性是由于其基因多态性所致 ,而
基因的多态性可从分子水平进行检测 ,它比形态、组
织、化学等传统的方法更能代表生物的遗传信
息 [23 ] ,更能体现物种间的亲缘关系。因此 ,用基因的
多态性来作为鉴别的依据 ,具有重要的意义 ,而
RAPD技术的发展正适应了这种要求。药用诃子主
要为植物诃子和绒毛诃子 ,但目前市场上的混用品
较多 ,这些混用品的亲缘关系与药用品较近 ,化学成
分较为类似 [7, 12 ] ,常规方法较难区分。 而 RAPD技
术利用 10 bp的短引物以模板结合 , PCR扩增所得
多态性丰富 ,根据这些多态所产生的差别 ,对于近缘
属甚至同一品种不同产地的植物都可进行鉴别。
RAPD技术本身对仪器设备要求不高 ,与其他
方法结合使用 ,必将推动中药材鉴别技术的发展。
参 考 文 献
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( 2000-01-27收稿 )
山东产木贼科草药形态解剖学的研究△
山东中医药大学 (济南 250014)　　郭庆梅 　周凤琴
威海市中医院　　　　　　　　 　王汝新
摘　要　目的: 为山东产木贼科草药经典分类提供属种间形态解剖学依据。 方法: 采用光镜和扫描电镜对山东产 2
属 5种 1变种木贼科草药进行了形态解剖学的研究。结果:木贼属和问荆属在气孔类型、气孔保卫细胞表面附属物
及内皮层层数等方面有显著差异 ;山东木贼科植物维管束内均有侧生木质部。结论: 依据茎的内部结构和表面特征
可将它们进行属间分类 ,但属内种间差异较小。
关键词　木贼科　形态解剖学　分类
Morphological and Anatomical Studies on the Medicinal Material of
Equisetaceae from Shandong Province
　　 Shandong Univ ersity o f TCM ( Ji nan 250014)　 Guo Qingm ei and Zhou Fengqin
　　Weihai Hospital o f TCM　Wang Ruxin
Adbstract　 　 The mo rpholog y and anatomy o f tw o genera , fiv e species and one variety of
Equisetaceae produced in Shandong Province were studied under ligh t and scanning elect ron microscope.
There are rema rkble dif ferences betw een Equisetum L. and Hip pochatete Milde in the type o f stomas,
a ttachments on the surface of stoma gua rd cells and the number of epi thelia l layers; and the presence of
la teral x ylem in all vasula r bundle of Equisetaceae f rom Shandong. The results show ed that they can be
identi fied taxonomically according to thei r inner st ructual and epidermal cha racteristics of stem betw een
di fferent g enera, but wi th li t tle di fference among species of same genus.
Key words　　 Equisetaceae　 morpholo gy and anatomy　 tax onomy
　　木贼科植物中一些种类作药材或民间药用。《本
草纲目》载木贼有疏风散热、解肌退翳之功 ;问荆能
“主结气瘤痛 ,上气气急” [ 1]。据记载 ,节节草功效与
木贼相似 [2 ] ;犬问荆也可作问荆入药 [3 ]。山东产的 5
种 1变种木贼科植物在各地均作民间药使用。 由于
本科植物外形相似 ,共用性很多 ,科以下等级分类较
难 ,药材上混用现象较多 ,而前人的研究多侧重于形
态分类方面 [4, 5 ]。我们对山东产 5种 1变种木贼科植
物进行了内部结构及表面微形态的研究 ,为药材鉴
定和木贼科植物的分类提供了形态解剖学的依据。
1　材料和方法
1. 1　材料:见表 1。
表 1　形态解剖学实验所用材料
植　物　名 产　地 标本号
节节草 Hippochaete ramosissimum ( Des f. ) Boerner 鲁西北地区 李建秀 70022、 70023
中日节节草 H. ramosissmum var. japonicum ( Mi lde) J. X . Li et F. Q. Zh ou 东营黄河三角州 李建秀、周凤琴 890-92
问荆 Equisetum arvense L. 蒙山 李建秀 850-510
草问荆 E. pratense Eh rh. 牙山 李建秀 980-51
林下问荆 E. sylvat icum L. 崂山 李建秀 980-146
犬问荆 E. palustre L. 昆嵛山 李建秀 960-518
·700· 中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　 2000年第 31卷第 9期
Address: Guo Qingmei , Sh and ong Univ ersi ty of TCM , Ji nan郭庆梅　 1989年于吉林农业大学获学士学位 , 1994年于山东大学获硕士学位 ,讲师 ,现主要从事药用植物研究 ,已发表论文数篇。△山东省自然科学基金项目 Y95C1335