全 文 ：·药材·
国产姜黄属药用植物 RAPD分析与分类鉴定△
解放军 302医院药学部 (北京 100039)
肖小河 　刘峰群　史成和* * 　李隆云* * *　秦松云* * * 　　乔传卓* * * * 　苏中武* * * *
摘　要　运用 RAPD技术刻划了国产姜黄属药用植物的遗传背景差异 ,并结合经典分类和异地栽培观察和
聚类分析 ,初步澄清了姜黄属植物的一些分类学争议 ,从 DN A分子水平上为姜黄属植物分类与中药鉴定提
供了参考依据。
关键词　姜黄属　 RAPD　植物分类　中药鉴定
RAPD Polymorphism and Authentication of Medicinal Plants
from Turmeric (Curcuma L. ) in China
Depar tment of Pha rmacy , 302th Hospital o f PLA ( Beijing 100039)　Xiao Xiaohe and Liu Fengqun
Depar tment of Pha rmacy , Navy Gener al Hospita l　 Shi Chenghe
Chongaing Academ y of Chinese Ma teria Medica　 Li Longyun and Qin Songyun
Colleg e o f Pharmacy, th e Second M ilitary Medical Univ er sity　 Qiao Chuanzhuo and Su Zhongw u
Abstract　　 By the biological tech nique RAPD, the dif ferences among their g enetic backg round and
i ts significance in the classification of the medicinal plants f rom Curcuma L. in China w ere sco red w ith
morpho logical classification and cluster analysis. Consequently , some controv ersies on the classification
and identification of Curcuma plants w ere clari fied. These results have provided some valuable info rmation
and bases f rom DNA mo lecular lev el fo r the authentication o f medicinal plants of Curcuma L. , and also
show ed that RAPD is ef fectiv e and practicable in tax onomy and pharmacogno sy especially in the classifica-
tion and identi fica tion o f those plants w hich are close in biosystematics o r confusable in mo rpholog y.
Key words　　Curcuma L.　 RAPD　 plant tax onomy　 authentication
　　姜科姜黄属 (Curcuma L. )植物全世界约有 60
种 ,我国 10余种 ,常用中药郁金、莪术和姜黄等都
来源于该属。 姜黄属分布广 ,生态和栽培变异大 ,并
且不少种类不易采到具花标本 ,因而该属植物的亲
缘关系、系统分类和中药鉴定一直存在很大的争
议 [1 ]。我们运用随机扩增 DNA多态性 ( RAPD)分析
技术 ,定性定量地刻划了姜黄属药用植物的遗传背
景差异及其分类学意义 ,为姜黄属中药鉴定提供了
新的科学依据。
1　材料与方法
1. 1　实验材料: 供试材料为新鲜叶片 ,来源于姜科
姜黄属 10个种 ,均系肖小河等于 1994～ 1995年分
别从中科院华南植物园、广西药用植物园及各道地
药材产地引种至重庆市中药研究院 (原四川省中药
研究所 )标本园栽培而得。植物学名为中科院华南植
物园刘念教授、重庆市中药研究院陈善墉教授、广西
药用植物园吴忠发高级工程师和李德荣高级工程
师、肖小河博士鉴定 (表 1)。
1. 2　主要仪器和试药
DNA扩增仪: Gene GyclerTM型 , Bio-Rad公司。
超速离心机: BECKMAN J2-21M型。 Taq DN A聚
合酶: 购于 Promega公司。 随机引物: 为 Operon
Tech nologies公司生产的十聚体核苷酸。
1. 3　 DNA提取方法:采用 CATB法 [2 ] ,略有改动。
取叶片 1 g,用液氮研磨成粉状 ,研磨时加入 0. 2 g
PV P粉 ,立即加入 2 mL CT AB提取缓冲液 ( 200
mmol /L Tris-HCl pH 8. 0, 0. 25 mmol /L EDTA
pH 8. 0, 250 mmo l /L NaCl , 0. 5% SDS, 0. 5% β -巯
基乙醇 ) , 60℃ 水浴保温 45 min,加入等体积的氯
仿 -异戊醇混合液 ( 24∶ 1) ,反复轻摇混匀 , 5 500 r /
min离心 10 min。取上层水相 ,再加入等体积氯仿-
异戊醇 ( 24∶ 1) , 5 500 r /min离心 10 min。重复 2～
·209·中草药　 Ch inese Tradi tional and Herbal Drugs　 2000年第 31卷第 3期
Address: Xiao Xiaohe, Department of Pharmacy, No. 302 Hospi tal of PL A, Beijing
* * 海军总医院药局　　* * * 重庆市中药研究院　　* * * * 第二军医大学药学院△ 国家自然科学基金项目 ( No. 39470058)
3次 ,直至水相层绿色不明显。在水相中加入 2 /3体
积的预冷的异丙醇 ,于 - 20℃ 静置 30 min以上或
过夜。 10 000 r /min离心 10 min,沉淀用 300μLTE
( 10 mmo l /L Tris-HCl pH 7. 6, 0. 1 mmol /L ED-
T A pH 8. 0)溶解 ,加入 Rnase A,终浓度 20μg /
m L, 37℃ 保温 1 h,然后分别用等体积平衡酚、平
衡酚-氯仿 ( 1∶ 1)及氯仿 -异戊醇 ( 24∶ 1)各抽提 1
次。吸取上层水相 ,加入等体积异丙醇沉淀 DNA,
1 000 r /min离心 10 min,沉淀用 75% 冰醋酸洗涤
1～ 2次 ,干燥后 200μL TE溶解 , - 20℃ 保存备
用。
表 1　用于 RAPD分析的姜黄属植物
序　号 植物名称 产地来源
1 姜黄 Curcuma longa 从四川双流县引种 ,道地产区
2 川郁金 C. chuanyuj in 从四川双流县引种 ,道地产区
3 温郁金 C. wenyujin 从浙江瑞安县引种 ,道地产区
4 毛郁金 C. aromatica 从广西药用植物园引种
5 蓬莪术 C. phaeocaulis 从四川双流县引种 ,道地产区
6 顶花莪术 C. yunnanensis 从华南植物园引种 ,原产云南
7 黄莪术 C. zedoaria 从华南植物园引种 ,原产美国
8 广西莪术 C. kwangsiensis 从广西横县引种 ,道地产区
9 印尼莪术 C. xanthorrhiz a 从华南植物园引种 ,原产印尼
10 细莪术 C. ex igua 从华南植物园引种 ,原产四川
1. 4　 PCR反应
参照 William的方法 [11 ] ,稍加改动。 反应总体
积 25 μL, 引 物 0. 2 μmmol /L, dN TPs 各 0. 1
mmol /L , TaqDN A酶 1单位 , T ris-HCl( pH 8. 3) 10
mmol /L , KCl 50 mmol /L, MgCl2 2. 5 mmo l /L,
g ea tin 0. 001% ,上覆 25μL石蜡油。
反应温度循环为: 94℃ , 1 min; 35℃ , 2 min; 72
℃ , 2min; 5个循环后改为 94℃ , 30 s; 35℃ , 1 min;
72℃ , 2 min; 40个循环后于 72℃延伸 5 min。
扩增产物于 1. 3% 琼脂糖 (内含 1μg /mLEB)
凝胶电泳检测 (图 1)。
引物: OPA20
图 1　姜黄属植物基因组 RAPD指纹图谱
2　结果与分析
在筛选的 50余个随机引物中有 25个在供试
材料上获得了较好的基因组 DNA多态性指纹图
谱 , 其 中 O PA20、 O PB6、 OPD18、 O PD2 0、 O PB14、
O PC6、 OPA4、 O PA15、 O PA16、 O PC2、 O PC11、 O PB15、
O PB16、 O PA9、 OPA18等引物的扩增产物条带信号
强、重现性和特征性好。根据姜黄属植物叶绿体基因
组 DNA的 RAPD多态性 ,笔者运用聚类分析方
法 ,并结合经典分类和异地栽培观察 ,定性定量地刻
划了姜黄属药用植物的遗传背景差异及其系统分类
学意义。 结果见图 2。
图 2　姜黄属植物 RAPD聚类分析图
2. 1　 RAPD分析与姜黄属植物分组:当取分类阈
值 λ1= 12. 4时 ,国产姜黄属 10种药用植物可分为
2大组 ,即绿脉组和紫脉组。 绿脉组包括 C. longa,
C. chuanyujin , C. aromatica , 和 C. wenyuj in;紫
脉组包括 C. phaeocaulis , C . yunnanensis , C . ze-
doaria , C . kwangsiensis, C . xanihorrhiza 和 C .
exigua。两组的主要区别是后者叶中脉两侧有紫色
斑 ,而前者则无紫色斑。
2. 2　 RAPD分析与姜黄属植物分类:当取分类阈
值 λ= 9. 0时 ,可将国产姜黄属原 10种划为 6组 ,
分述如下:
2. 2. 1　姜黄 C . longa L. 和川郁金 C . chuanyujin
C. K. Hsieh et H. Zhang:包括 1和 2号材料。1号
材料即 C . longa ,分布最广 ,变异亦最大 ,栽培措施
和产地对 C . longa形态影响较大 ,如在印度和中国
四川双流县为 C. longa根茎发达 ,块根不发达 ,主
要产出物是姜黄 ;在中国四川双流县 C. longa块根
发达 ,主要产出物为黄丝郁金。
2号材料即川郁金 C. chuanyuj in ,稀见 ,与 C .
longa混生或逸为野生 ,是当地药农栽培黄丝郁金
和姜黄药材的淘汰品种。 植株较高大 ,根茎发达 ,比
C. longa根茎粗大 ,但色较淡 ,为淡黄色至黄色 ;根
系入土深 ,郁金生成少。块根作黄白丝郁金或黄丝郁
金用 ,根茎主要作姜黄用。过去 C. chuanyujin常被
列入 C . aromatica项下 ,但后者根茎断面类白色 ,
侧根茎不发达 ,叶片两面茸毛明显 ,二者差异较大。
笔者认为将川郁金 C. chuanyujin订为姜黄 C . lon-
·210· 中草药　 Ch inese Tradi tional and Herbal Drugs　 2000年第 31卷第 3期
ga L. 的栽培变种比较合理 ,即: 川郁金 C . longa
L. cv. chuanyujin。
2. 2. 2　毛郁金 C . aromatica Salisb. 和温郁金 C.
wenyujin Y. H. Chen et C. Ling
指 3和 4号材料。 温郁金 C . wenyujin和毛郁
金 C . aromatica十分接近 ,主要区别是后者叶背有
毛 ,前者叶背未见柔毛 ,但手触多少有毛感 ,在显微
镜下观察亦偶见毛茸 ,可见叶片有无毛茸在 C.
wenyujin与 C. aromatica之间并无严格间断。鉴于
物种生物学的发展趋势和本草沿革历史 ,建议将二
者合为 1个种 ,并沿用国内外曾经通过的学名郁金
C . aromatica Salisb.。 亦可考虑将温郁金作为毛郁
金之栽培变种处理 ,即温郁金为 C. aromatica Sal-
isb. cv. wenyuj in [ 6]。
2. 2. 3　黄莪术 C. zedoaria ( Christm ) Rosco. 、蓬
莪术 C. phaeocaulis Valet和顶花莪术 C . yunna-
nensis N. Niu et Senjen Chen
包括 5, 6和 7号材料 ,即原蓬莪术 C. phaeo-
caul is、顶花莪术 C. yunnanensis和黄莪术 C . ze-
doaria 。中药莪术主流品种蓬莪术的原植物学名更
迭频繁 ,曾先后被订为 C . zedoaria , C. aerugi-
nosa, C . phaeocaul is ,三者是独立的种?还是同一所
指或学名误订? 顶花莪术 C. yunnanensis与 C.
phaeocaul is和 C. zedoaria的 RAPD聚光谱系十
分接近 ,新种顶花莪术 C. yunnanensis是否成立?
这些问题均有待进一步研究。
文献记载蓬莪术 C. phaeocaulis、项花莪术 C.
yunnanensis和黄莪术 C . zedoaria的主要区别在于
根茎断面的颜色 [7～ 9 ]。如 C. zedoaria根茎断面淡黄
色或类白色 ,而 C. phaeocaulis根茎断面淡蓝色或
黄绿色至墨绿色或深褐色。但据我们多年观察 ,它们
的根茎断面在不同发育时期、不同干燥过程中甚至
同一主根茎纵剖面的上下方颜色都是不尽一致的。
一般来说 ,老根茎断面为淡黄色至黄绿色 ,幼嫩根茎
断面为灰蓝色或黄绿色至墨绿色 ;干燥后常为墨绿
色至黑褐色或铅灰色或深褐色 ;同一剖面上方一般
为淡黄色、淡蓝色或类白色 ,下方多为深蓝色或黄绿
色至墨绿。
综上 ,建议将顶花莪术 C. yunnanensis与中药
莪术主流品种蓬莪术合并 ,同时恢复中药蓬莪术原
植物学名 C. zedoaria ( Christm ) Rosco. [6 ]。组织图
像定量分析和化学成分分析亦基本支持上述观
点 [10, 11 ]。
2. 2. 4　广西莪术 C . kwangsiensis S. G. Lee& C.
F. Liang
指 8号材料 ,即广西莪术 C. kwangsiensis (紫
脉型 )。广西莪术 C. kwangsiensis系一多型种 [6, 9 ] ;
叶片既有紫脉型 ,又有无紫脉型 (即绿脉型 ) ;花序既
有从根茎单独抽出 ,亦有从叶鞘内直接抽出 ;有的叶
背被毛 ,有的则无毛。但是其地下部分根茎和块根的
形态和色泽基本一致。 本试验中绿脉型 C .
kwangsiensis栽培成活差 ,提取的 DNA材料大多未
扩增出 RAPD谱带 ,未做统计分析。 鉴于广西莪术
种内性状的多态性 ,建议将广西莪术作为种复合体
或多型种处理 ,即:广西莪术 Curcuma kwangsiensis
S. G. Lee& C. F. Liang complex。
2. 2. 5　印尼莪术 C. xanthorrhiza Robx.
指 9号材料 ,即 C . xanthorrhiza。 该种系从印
尼爪哇引种 ,体型粗大 ,株高可达 2 m ,叶脉两侧具
有紫色带 ,类似“莪术类” ;但叶脉本身及叶背叶脉处
均着紫色斑 ,主根茎特别发达 ,郁金少见 ,根茎和块
根断面均为黄红色 ,又近“姜黄类” ;并且该种既含酚
性姜黄素类成分 ,又含非酚性姜黄素类成分。近年我
国云南发现有分布 [12 ]。
2. 2. 6　细莪术 C . exigua N. Liu
指 10号材料 ,即 C . ex igua。该种系四川野生 ,
体型细小 ,株高 30～ 50 cm ,叶脉两侧具有狭长紫色
带 ,近“莪术类” [7 ] ;但主根茎不发达 ,侧根茎发达 ,其
形态断面颜色和气味均类似“姜黄类”。
可见 C. ex igua和 C . xanthorriza都是比较独
特的类群 ,二者叶片叶脉两侧均具紫色带 ,近“莪术
类” ,但根茎和块根断面淡黄色至黄色 ,又类似姜黄 ,
但二者植株大小和主根茎发达程度等方面区别明
显。
3　小结与讨论
姜黄属植物的分类、名称及其与商品药材的关
系一直比较混乱 ,近年来新种不断有发表和学名不
时更迭 ,更增添了分类与鉴定的困难。 本文基于
RAPD多态性的数值分类将从分子水平上为研究
姜黄属遗传背景差异及植物分类与中药鉴定提供了
支持依据。
RAPD分析用于分类和鉴定 ,有其独到的优
势 ,但目前尚属探索阶段 ,亦存在一定的局限性 ,如
RAPD片段的基因组来源不明 (细胞核或细胞器 )
以及凝胶电泳迁移率相同的谱带的核苷酸同源性不
明等情形易造成干扰 ,有时电泳迁移率相同的片段
并非同源 ; RAPD反应条件繁杂而严格 ,扩增产物
的稳定性难以控制。 笔者认为 ,包括 RAPD分析在
·211·中草药　 Ch inese Tradi tional and Herbal Drugs　 2000年第 31卷第 3期
内的 DNA分子遗传标记技术可作为分类鉴定的一
种有益的辅助手段 ,但不能替代传统的分类学。
目前分子标记技术在生物多样性及系统分类与
中药鉴定中的应用方兴未艾。 我们认为利用包括
RAPD在内的现代分子生物学技术 ,筛选和寻找药
用植物重要性状的分子标记 ,开展中药材分子标记
育种、中药材品质人工调控及生产基因工程药物 ,将
是 21世纪生药学的新课题。
参 考 文 献
1　肖小河 ,等 . 中草药 , 1997, 28( 2): 114
2　 Scot t O R, et al . J Plant M ol Biol Manual, 1988, A6: 1
3　 Williams J G, et al . Nucleic Acids Res, 1990, 18: 6531
4　陈秀香 ,等 .广西植物 , 1984, 4( 2): 133
5　张　浩 ,等 .华西医科大学学报 , 1990, 21(2) : 179
6　吴德邻 ,等 . 中国植物志 . 16卷 ( 2册 ) . 北京: 科学出版社 ,
1981: 59
7　刘　念 ,等 .广西植物 , 1987, 7( 1): 15
8　吴德邻 ,等 .中科院华南植物所汇刊 . 第 5集 . 1987: 26
9　陈毓亨 ,等 .药学学报 , 1981, 16( 50): 385
10　肖小河 ,等 .中国药学杂志 , 1998, 33( 2): 76
11　夏文娟 ,等 .中国中药杂志 , 1999, 24( 7): 423
12　童绍全 .云南植物研究 , 1986, 8( 1): 37
( 1999-04-19收稿 )
异地栽培大青叶和原栽培品种的抗内毒素作用比较△
第二军医大学药学院 (上海 200433)　　王　寅 　乔传卓
摘　要　比较异地栽培后的大青叶和其原栽培品种的抗内毒素作用 ,结果显示生态环境改变后 ,大青叶仍能
保持其原栽培品种品质:不同居群大青叶在药理活性方面的差异也不因生态环境的趋同而丧失。 表明大青叶
是一类种质主导型的药材 ,环境因素对药材品质的形成不起主要作用。
关键词　大青叶　异地栽培　药材品质　抗内毒素活性
Comparison of the Antiendotoxic Activities of Transplanted Indigoblue Woad
( Isat is ind igot ica ) with the Originally Cultivated Breeding
Colleg e o f Pharmacy, th e Second M ilitary Medical Univ er sity ( Shanghai 200433)　Wang Yin and Qiao Chuanzhuo
Abstract　　 The antiendotoxic activi ty of transplanted Isatis indigotica Fo rt. was compared wi th the
o rig inally cul tiv ated breedings. The resul t showed that the former kept the cha racter of the lat ter w hi le a l-
tering the mode o f li fe and relations to their env ironment and that di fferences in pha rmaco logical effect of
I . indigotica f rom di fferent populations stil l remained af ter they w ere transplanted in the same place,
w hich indicated that I . indigot ica i s a g ermplasm-dominant type crude drug and the environmenta l facto r
show ed li tt le effect on i ts quali ty.
Key words　　 Isatis indigot ica Fo rt.　 t ransplantation　 quali ty of crude drug　 antiendo toxic activi ty
　　大青叶是常用的清热解毒中药材 ,主要来源于
十字花科植物菘蓝 Isatis indigotica Fo rt. 的干燥
叶 [1 ]。临床应用发现药材质量参差不齐 ,有必要进行
品种选育 ,保证药材质量。我们将各地不同居群菘蓝
移栽于一处 ,考察异地栽培前后大青叶药理作用的
变化 ,探讨环境因素对药材品质形成的影响 ,为筛选
优良品种、稳定和提高药材的质量提供依据。
1　材料与方法
1. 1　材料: 1996年 9月至 12月间在全国采集了 13
个栽培居群的大青叶药材 (Ⅰ )和种子 ; 1997年 5月
下旬将种子异地栽培于上海市新海农场试验田 ,按
常规方法进行田间作物管理 ,同年 11月收获移栽一
年的大青叶药材 (Ⅱ ) ,并将剩余的大青叶以居群为
单位 ,间距 5～ 10 km左右重新分隔种植 ,避免在开
花结果时互相传粉 ,在 1998年 5月时收获种子 ,将
其种植在同一块试验田 ,收获移栽两年的大青叶药
材 (Ⅲ )。 所有药材经乔传卓教授鉴定均为十字花科
菘蓝 Isat is indigotica For t.。
1. 2　试剂和仪器:鲎试剂:福州东方鲎试剂厂 ,批号
971208, 0. 1毫升 /支 ,灵敏度 0. 5 EU /mL;细菌内
毒素工作标准品:福州东方鲎试剂厂 ,批号 980105,
10 EU /支 ,以 N S溶解备用 ; 0. 9%生理盐水 ( N S) ,
·212· 中草药　 Ch inese Tradi tional and Herbal Drugs　 2000年第 31卷第 3期
Address: Wang Yin, College of Pharmacy, Th e Second Mili tary Medical University, Shanghai△国家自然科学基金资助项目 ,编号 39670878;上海市科委星火计划项目 ,编号 98X H02028