全 文 ：接种量增加了 3. 65倍。接着是细胞的缓慢生长期 ,
细胞在这一时期生物量略有下降。细胞中 GKB的
含量在接种后的 3～ 6 d略有下降 , 12～ 18 d是银杏
内酯的快速积累期 ,第 18天细胞中的银杏内酯含量
最高 ,达到 302μg /gDW ,之后至第 21天含量略有
下降。 因此在以后的研究中 ,细胞的收获期不超过
20 d。
2. 4　继代悬浮培养过程中银杏内酯 B合成稳定性
研究:在悬浮培养过程中 ,很多植物细胞由于形态分
化受到抑制和染色体发生变异 ,使目的产物含量降
低甚至消失 ,如红豆杉中的紫杉醇 ,随着继代次数的
增加 ,紫杉醇的含量迅速降低 ,因而建立具有高而稳
定的目的产物的细胞系是实现细胞大规模培养生产
次生代谢物的关键之一。我们对细胞系 MH-3进行
了连续 6代的继代培养 ,结果如表 3。在继代培养过
1-银杏内酯 B　 2-生物量
图 1　悬浮培养时细胞生长和银杏内酯合成
时间进程
程中 ,细胞的生长指数和银杏内酯含量没有随继代
次数的增加而明显下降 ,其变异系数分别为 0. 073
和 0. 131,性状表现稳定。
采用缺氧胁迫小细胞团法从愈伤组织中选育高
表 3　细胞系 MH-3继代培养的稳定性
继代次数 1 2 3 4 5 6 平均值 X 变异系数 ( s /x)
生长指数 3. 68 4. 16 3. 46 3. 78 4. 01 3. 52 3. 77 0. 073
GB含量 (μg /gDW) 340± 45. 2 260± 31. 2 280± 22. 4 310± 34. 3 320± 48. 0 240± 26. 4 291± 38. 1 0. 131
产银杏内酯细胞系取得明显效果 ,选出的细胞系生
产银杏内酯 B的能力比原来的愈伤组织有了显著
提高 ,且其生产能力在继代过程中表现稳定 ,在细胞
悬浮培养过程中银杏内酯合成代谢的优化控制将另
文报道。这些研究为今后实现银杏细胞大规模培养
生产银杏内酯打下了良好基础。
参考文献:
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5S-rRNA基因间区序列变异用于金银花药材道地性研究初探
李　萍 ,蔡朝晖 ,邢俊波
(中国药科大学 生药学教研室 ,江苏 南京　 210038)
摘　要: 目的　研究金银花药材道地性形成的基因基础。方法　用 SDS法提取金银花 Lonicera japonica不同居群、
外类群细毡毛忍冬 L . similis和山银花 L . conf usa的总 DN A,进行 5S-rRN A基因间区的 PCR扩增和测序 ,并用软
件 Mega进行分析。结果　 Lonicera L. 属植物 5S-rRN A基因间区约 210 bp,其中 G+ C含量较高 ,达 70%左右 ,不
同居群的 L . japonica碱基序列有差别 ,通过测序可以进行鉴别。 L . conf usa与 L . japonica间的遗传距离较大。结论
　种间 5S-rRN A基因间区的序列差异大于种内 ;道地药材之间的遗传距离较小 ;道地与非道地药材之间的遗传距
·834· 中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　 2001年第 32卷第 9期
收稿日期: 2000-12-04基金项目:国家自然科学基金重点项目 ( 39730500) ,教育部优秀教师资助计划项目 ,江苏省“ 333”工程项目资助作者简介:李　萍 ( 1960-) ,女 ,辽宁大连人 ,教授 ,博士生导师 ,理学博士 ,国家有突出贡献的中青年专家。 1982年毕业于辽宁中医学院中药系 , 1988年毕业于中国药科大学生药学专业 ,获得博士学位。 1992年任副教授 , 1995年破格晋升为教授。主要研究方向:中药材的品种鉴定、质量评价及活性成分研究。 Tel: ( 025) 5322256　 Fax: 025-5322448　 E-mail: lipingli@ publicl. p tt . js. cn
离大于道地药材之间的遗传距离。
关键词: 金银花 ;道地性 ; 5S-rRN A基因间区序列
中图分类号: R282. 710. 3　　　文献标识码: B　　　文章编号: 0253 2670( 2001) 09 0834 04
Preliminary attempt to identify geoherbalism of Flos Lonicerae by
sequence divergence of 5S-rRNA gene spacer region
L I Ping , CA I Zhao-hui, X ING Jun-bo
　　 ( Depa rtment o f Pharmacogno sy, China Pha rmaceutical Univ ersity, Nanjing Jiang su 210038, China )
Abstract: Object　 To study the fo rmation of geoherbalism of Flos Lonicerae on th e mo lecula r level.
Methods　 Genomic DN As from di fferent populations of Lonicera japonica Thunb. , outg roup Lonicera sim-
il is Hemsl. , and Lonicera conf usa DC. w ere ex t racted, the 5S-rRN A gene spacer region amplified, sequ-
uenced, and analy sed wi th M ega 1. 02. Results　 The fragments of 5S-rRN A gene spacer region in Lonicera
L. w as about 210 bp w ith G+ C content up to about 70% . The sequences w ere di fferent in va rious popula-
tions, and can be identified by sequencing. The genetic distance betw een L .conf usa and L . japonica was
la rg er. Conclusion　 The genuine distance between species w as larg er than tha t w ithin species; the genetic
distance among genuine crude drugs w as smaller; the genetic distance among genuine and ungenuine crude
drug s w ere big ger than tha t among genuine crude drug s.
Key words: Flos Lonicerae; g eoherbalism; sequence of 5S-rRN A gene spacer region
　　金银花为忍冬科植物忍冬 Lonicera japonicca
Thunb. 的干燥花蕾或初开的花 ,有较强的抗菌作
用 ,对多种急、慢性炎症等有较好的疗效。 金银花药
材有明显的道地性 ,如通过我们对氯原酸含量的初
步测定表明 ,道地产区河南和山东金银花的绿原酸
含量普遍高于其它非道地产区 ,显示药材质量与地
域、生境等密切相关 [ 1]。品质优良是道地药材的表现
型 ,它是道地药材基因型内因与特定的环境饰变外
因长期作用的结果 ,特定的基因产生特定的酶 ,进而
调控次生代谢产物的产生 ,因而特定的基因是药材
道地性形成的关键。
在真核生物细胞中 ,编码 5S-rRN A的基因以
串联重复的形式存在 ,每个重复单位包括一个大约
120 bp的编码区和长度在 100～ 700 bp之间的转录
间隔区。编码区的序列非常保守 ,而间隔区在不同的
种间 ,甚至在种内都会有差别 [ 2～ 5] ,因此通过测定间
隔区的碱基序列可以进行种间或种内水平的差异的
研究。 为此我们以 5S-rRN A编码区的两段寡核苷
酸序列 AS和 AS-1为引物 ,对金银花不同居群及细
毡毛忍冬、山银花的 5S-rRN A基因间区片段进行
扩增并测序。 以期研究金银花药材道地性的基因基
础 ,并探讨 DNA多态性对道地药材鉴别的意义。
1　材料与方法
1. 1　材料:样品为植物的新鲜嫩叶 ,快速干燥。金银
花分别采自河南封丘 ,山东平邑、日照 ,河北石家庄 ,
四川雅安 ,江苏南京 ( J1-J6 ) ,细毡毛忍冬采自重庆
( J7 ) ,山银花采自广西南宁 ( J8 )。均经本文作者鉴定 ,
其中 J1 , J2 , J3为道地药材。
1. 2　试剂和仪器: Taq DN A聚合酶 , dN TPs, A-
garose Gel DN A Ex traction 试 剂 盒 , BamHI,
Boehringer Mannheim公司 , TA Cloning试剂盒 ,
T7 Sequencing
TM试剂盒 , Pharmacia Biotech nolo gy
公司 ; WizardTM Plus Minipreps DN A Purification
System , λDN A /HindIII分子量标记 , Promega 公
司 ; [α-35 S ]d AT P, Amersham公司 ;引物 AS, AS-1
由 Gibco-BRL公司合成。
Robocycle Gradient 40 PCR扩增仪 ( St rata-
gene ) , IS 1000 Digi tal Imaging System ( Alpha In-
no tech Corpo ration) , Sequi-Gen Sequencing Cell,
MODEL 583干胶机 ( Bio-RAD)等。
1. 3　总 DNA的提取: 参照文献 [7 ]方法。
1. 4　 PCR扩增:参照文献 [ 6]方法。
1. 5　亚克隆和测序: PCR产物亚克隆到 T A克隆
载体 pT Ag中。 连接产物转化入 JM 109细胞后 ,铺
于 LB平板培养基中。 通过颜色鉴别挑取白色的克
隆在 3 mL LB液体培养基中 37℃振荡培养过夜 ,
碱裂解法进行质粒 DNA的小量制备。质粒 DNA经
Bam HI酶解检查后 ,选取重组质粒用 WizardTM
Minipreps DN A Purification System试剂盒进行制
备。 用 T7 SequencingTM试剂盒进行测序。
1. 6　数据分析:所得序列输入计算机 ,经 Clustal W
软件排序 ,然后手工作适当调整以尽量减少排列所
需缺隙 (g ap)的数目 ,排列好的序列用 Mega分子进
化 遗传 分 析 ( Mo lecular Evolutionary Genetics
·835·中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　 2001年第 32卷第 9期
Analysis) 1. 02软件进行序列分析 ,统计各样品序列
间的 DNA差异百分率 (相对遗传距离 )和转换+ 颠
换数 (绝对遗传距离 )。
2　结果与讨论
2. 1　 PCR扩增和测序: 所用的两段寡核苷酸引物
分别位于 5S-rRN A上。 直接取总 DNA进行 PCR
扩增 ,结果没有任何条带扩增出 ,可能是有 RNA干
扰的缘故。 对总 DNA进行基因纯化 ,即取总 DNA
20μL经琼脂糖凝胶电泳后 ,切取含有未降解 DNA
片段处的凝胶 ,加入适量的 Milli-Q水 ,放置过夜
后 ,取此 DNA作为模板进行 PCR扩增 ,此模板已
除去了小片段的 DNA和 RNA,扩增出了 5S-rRN A
间区的特异片段 (图 1)。从图 1看出 ,同属不同种和
金银花不同居群所扩增出的 5S-rRN A间区的长度
几近相同 ,约为 300 bp。
M　 J1　 J2　 J3　 J4　 J5　 J6　 J7　 J8
J1-L . japonica (河南封丘 ) ; J2-L . japonica (山东平邑 ) ;
J3-L . japonica (山东日照 ) ; J4-L . japonica (河北石家庄 ) ;
J5-L . japonica (四川雅安 ) ; J6-L . japonica (江苏南京 ) ;
J7-L . simil is (重庆 ) ; J8-L . conf usa (广西南宁 )
图 1　金银花 5S-rRNA基因间区 PCR扩增产物凝胶
电泳图谱 MK:λDNA /Hind III分子量标记
对 PCR产物经克隆后测序 ,每个样品测定 3个
克隆 ,以避免 PCR扩增可能带来的误差。除去位于
5S-rRN A基因上的 85 bp,约为 210 bp,这些样品的
基因序列已登录到 GenBank上 L . japonica ( J1 )
AF207727, L . japonica ( J2 ) AF207728, L . japonica
( J3 ) AF207729, L . japonica ( J4 ) AF207733,
L . japonica ( J5 ) AF207734, L . japonica ( J6 )
AF207736,L . sim ilis ( J7 ) AF207732, L . confusa ( J8 )
AF207735)。
从测序结果看出 ,不同样品的 5S-rRN A基因
间区碱基序 列有差别 ,可以通 过测序鉴别。
L . japonica的不同居群间 5S-rRN A基因间区碱基
序列长度变化幅度大 ,相差 0～ 7个碱基 ,作为外类
群的细毡毛忍冬 L. sim ilis和山银花 L . confusa序
列长度介于金银花 L . japonica各居群之间。金银花
属植物 5S-rRN A基因间区序列的 G+ C含量较其
它科属的植物要高 ,达 70%左右。 道地和非道地药
材的 5S-rRN A基因间区序列间没有大片段的缺失
和插入 ,仅是碱基间的替代。道地产区的 L . japoni-
ca ( J1和 J2 J3 )基因间区序列的 G+ C含量较不同居
群和不同种金银花略高。
2. 2　 5S-rRN A基因间区序列在道地药材研究中的
价值: 将排列好的 5S-rRN A基因间区序列经软件
Mega1. 02分析。各居群间的变异位点为 40,信息位
点为 9。 除去缺失 (g ap)和对对 (碱基 )比较时 ,可得
到序列间的绝对遗传距离及相对遗传距离以反映序
列的分化 ,结果显示 ,种间遗传距离较大 , L . confusa
与其它样品间的遗传距离最大 ,最高达 18 bp( L .
conf usa与河北产 L . japonica ) ,其次为 L . similis与
L . conf usa间的遗传距离为 17 bp, L . japonica与
L . similis、 L . confusa间的相对遗传距离分别为
5. 93% , 6. 53% , L . sim ilis与 L . confusa间的相对遗
传距离为 5. 34% ,种间平均为 5. 93% 。 L . japonica
种内道地与非道地药材间的相对遗传距离平均为
4. 03%。
道地药材间遗传距离较小 , J1、 J2和 J3之间相对
遗传距离分别为 1. 44% , 0. 84%和 1. 89% ,平均为
1. 20%。 J2与 J3两个居群的金银花产地相近 ,但表
型有较大差别 , J2俗称大毛花 ,全身密被长柔毛 ; J3
俗称鸡爪花 ,花蕾着生于花枝顶端 ,集中丛生 ,犹如
鸡爪状 ,测序结果表明 ,它们有 4个碱基的差别 ,但
远小于不同种间的碱基差异数 ,这可能是天然杂交
和人工选择的结果。
我们的研究结果表明 ,道地药材之间及道地与
非道地药材之间 ,绿原酸的分析结果 [1 ]与本实验
5S-rRN A基因间区序列变异是一致的 ,因此认为其
成分差异与遗传基因变异有关 ,亦即基因的差异是
金银花药材道地性的因素之一。另外我们的研究还
表明 ,环境因子也有一定的影响 ,有关金银花药材道
地性与基因的变化及环境因子的相关性目前正在深
入研究中。
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药用矿物蒙脱石的红外光谱分析
翟永功 ,左明雪
(北京师范大学生命科学学院生物医学研究所 ,北京　 100875)
摘　要: 目的　弄清蒙脱石层状晶体结构中水的变化规律 ,为其药用机制研究和药物的开发利用提供依据。方法　
从粘土矿物中分离纯化蒙脱石 ,运用红外光谱分析技术 ,对蒙脱石的化学结构进行分析。结果　得到了有关蒙脱石
分子水的信息和化学结构变化的基本规律。 结论　蒙脱石是一种膨胀吸附性粘土矿物 ,可作为药物活性成分或赋
形剂。
关键词: 蒙脱石 ;红外光谱 ;结构分析
中图分类号: R282. 760. 3　　　文献标识码: B　　　文章编号: 0253 2670( 2001) 09 0837 03
Analysis of mineral drug montmorillonite by IR spectra
ZHAI Yong-gong , ZUO Ming-xue
　　 ( Co lleg e o f Life Science, Beijing No rmal Univ e rsity , Beijing 100875, China)
Abstract: Object　 In pursui t of a clear-cut v iew on the change o f w ater molecules in the cry stal lat tice
o f montmo ri lloni te, to provide a basis for the study o f mechanism of action and i ts further development.
Methods　 The chemical st ructure of the mineral w as studied by IR spect ral analysis. Results　 Info rmation
concerning the change of w ater in regard to i ts chemical st ructure w ere obtained. Conclusion　 Montmo ri-
l loni te is a mineral clay which can expand to exhibit i t s abso rption properties, and can be used as an activ e
abso rbent excipient in drug fo rmula tion.
Key words: montmorillo nite; IR spect ra; chemical st ructural analysis
　　蒙脱石是粘土矿物的一种 ,其作为药用矿物始
载于《本草纲目拾遗》 ,为少常用中药 ,主用于治疗外
创和解毒 [1 ]。别名 ,蒙脱土、白单等。蒙脱石粘土系凝
灰岩或其他火山岩在碱性水的作用下蚀变而成。性
味甘 ,温。近年来 ,国外有关蒙脱石类粘土矿物的药
用研究日趋增多 ,特别是美国、法国、德国等国家在
矿物药学 ( Pharmaco-oryctolog y )方面的研究已较
深入 ,用于治疗胃肠道疾病 ,尤其是治疗腹泻的天然
矿物新药 ,如 SMECTA、 DIASO RB、 GELO FALK
均已上市 ,其基本矿物成分为二八面体蒙脱石
( Dioctahedral smecti te, DS) ,已被美国 FDA认证
为 “非处方药” ,用于治疗腹泻性疾病 [3 ] , 1982年列
入 WHO腹泻病控制计划 ( The Dia rrhea Disease
Contro l Prog ram) [4 ]。最新的药物临床研究报道 ,蒙
脱石类矿物药对 HIV病毒感染的 AIDS病患者的
腹泻有显著疗效 [2 ]。但矿物药材的地域性很强 ,不同
的地质环境和同一矿床的不同层面 ,其矿物的化学
组成和形态特征差异较大。本文是在对国产蒙脱石
粘土进行化学分析、 X-射线衍射分析、热分析和电
镜分析的基础上 ,为了进一步揭示蒙脱石矿物的内
部结构和药用物质基础 ,应用红外光谱分析技术 ,对
蒙脱石粘土矿物进行了分析研究 ,为蒙脱石的药效
学和药理学研究提供依据。剖析蒙脱石的药用物质
基础 ,研究其药用性能 ,探讨具有我国自身的资源特
色和医学背景的药用蒙脱石矿物 ,无疑对新药开发
和矿物药理学研究具有重要意义。
·837·中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　 2001年第 32卷第 9期
收稿日期: 2000-11-12基金项目:国家新药基金资助项目作者简介:翟永功 ( 1961-) ,男 ,陕西省岐山县人 ,副教授 ,西安交通大学生物医学工程博士 ,北京师范大学生物学博士后。 现在北京师范大学生物医学研究所主要从事分子生物医学和天然药物化学方面的研究。主持国家新药基金、国家星火计划和省级科研基金项目 6项 ,参加国家“八· 五”、“九· 五”攻关项目 2项 ,发表论文 32篇 ,参编著作 2部。
Tel: ( 010) 62206656　 Fax: ( 010) 62206656　 E-mail: yg zh ai369@ yahoo. com