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生物技术在长春花研究中的应用
陈　敏 ,廖志华 ,孙　敏 ,罗　学
⒇
(西南师范大学生命科学学院 ,四川 重庆　 400715)
摘　要: 长春花为重要的抗癌药用植物 ,对细胞组织培养、 Ti和 Ri质粒遗传转化等生物技术在长春花研究中的应
用作一综述 ,并对长春花的开发利用和长春花生物碱的工业化生产存在问题和前景作了分析。
关键词: 长春花 ;生物技术 ;应用
中图分类号: Q813; R282. 7　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2001) 01 0078 04
Application of biotechnology in studies of Catharanthus roseus
CHEN Min, L IAO Zhi-hua, SUN Min, LUO Xue
　　 ( Faculty of Life Science, Southwest No rmal Univ ersity, Chongqing Sichuan 400715, China)
Key words: Catharanthus roseus ( L. ) G. Don; bio technolog y; application
·78· 中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　 2001年第 32卷第 1期
收稿日期: 2000-04-26;修回日期: 2000-06-07基金项目:重庆市科委攻关项目 ( 985067)作者简介:陈　敏 ( 1975-) ,女 ,贵州省贵阳市人 ,现于西南师范大学生命科学学院攻读硕士研究生。 从事药用植物基因工程及其次生代谢产物获得方面的研究 ,先后在核心期刊发表论文 10余篇 ,其中《发根农杆菌对甘薯的遗传转化》获四川省细胞生物学会、四川省、重庆市人类遗传学会青年优秀科技论文奖。 Tel: ( 023) 68254061　　 E-mail: m minch en@ netease. com
　　长春花 Catharanthus roseus ( L. ) G. Don是夹竹桃科
( Apocynaceae)长春花属一种重要的药用植物 ,它含有长春
碱 ( vinblastine )、长春新碱 ( vindristine )、阿吗碱 ( a jmali-
cine )、蛇根碱 ( serpentine)、文朵灵碱 ( v indoline)、洛克定
碱、洛克辛碱等 100多种吲哚生物碱 ,多数具有生物活性。其
中长春碱和长春新碱是目前应用最广泛的天然植物抗肿瘤
药物 ,可用于治疗何杰金氏病、恶性淋巴肿瘤等疾病 ,其硫酸
盐已广泛用于临床 [1]。目前主要从天然植物中提取长春碱和
长春新碱 ,但是它们在植物体中的含量极其微小 ,仅为百分
之几至十万分之几 ,化学合成和半合成也不太理想。 为了更
有效地生产长春花生物碱 ,科学工作者正致力于将生物技术
应用于长春花的研究与开发。 笔者就长春花的组织培养、细
胞培养、遗传转化的研究进展作一综述。
1　组织培养及细胞工程
长春花吲哚生物碱生物合成途径有两条 [2]:莽草酸途径
和甲羟戊酸途径。由莽草酸途径来的色胺和甲羟戊酸途径经
多步反应生成的裂环马钱子苷 ( secolog anin) 在异胡豆苷
( strictosine) 合成酶 ( SSS) 催化下偶合成吲哚生物碱的共
同前体异胡豆苷。 异胡豆苷经不同的途径生成文多灵、长春
质碱或阿吗碱等。
1. 1　利用组织培养生产次级代谢产物: 元英进等 [3]将 1 L
固体愈伤组织培养基的剩余培养基作为附加成分加入 1 L
改进的 S H培养基 A中 ,形成含剩余培养基的愈伤组织培
养基 B,培养基 B上的愈伤组织生长速度比 A上的快 ,并积
累更多的生物碱。前人认为植物细胞生长与产物积累呈负相
关 ,而元英进等利用剩余培养基所得结果呈正相关。 赵剑 [4]
等诱导长春花愈伤组织的过程中 ,叶片中含量较高的文多灵
和长春质碱迅速降解至极低水平 ,而在叶片中含量较低的蛇
根碱和阿吗碱的合成却逐渐增加。 Goswami等人 [5]用秋水仙
素处理长春花形成同源四倍体 ,产生 4种基因型 ,四倍体植
株较二倍体母体叶干物质减少。所有四倍体中的生物碱含量
都比二倍体母本有下降趋势。
1. 2　利用细胞工程生产次级代谢产物:虽然至今尚未从长
春花培养细胞中直接得到长春碱和长春新碱 ,但可以得到一
种单体生物碱长春质碱 ,所以 Endo等人将细胞培养得来的
长春质碱与另外一种单体生物碱文朵灵在长春花无细胞提
取液的作用下转化成 3′, 4′-去羟基长春碱 ,再在无细胞提取
液的催化下转化成长春碱 [6] ,因此长春花细胞大规模培养可
行。 1977年长春花细胞首次在气升式反应器中大规模培养
成功 , 1981年规模达 100 L, 1987年搅拌反应器中培养规模
已达 5 000 L[7]。
1. 3　影响因素:组织培养及细胞生长和生物碱的合成受内
部机制与外部环境共同调控 ,培养基组成、光、温度、 p H值、
外源激素、前体物质、诱导子和通气状况 、流变学特征、培养
方式等都有影响。 大规模培养的细胞生物碱产量往往很
低 [8] , Dr apeau等人认为是接种时带进 2, 4-D所致 [9] ,而郑
珍贵等用激素自养型细胞培养得到的产量依然很低 ,认为是
细胞密度大 ,氧气及营养供应不足所致 [10 ]。
1. 3. 1　培养条件的影响
( 1)初始糖浓度 [10]: 一定范围内初始糖浓度增加有利于
细胞生长和生物碱生成。郑珍贵等认为初始糖浓度对细胞干
重影响非常大 ,这是由于高浓度蔗糖不能很快被耗尽 ,且由
于渗透压较大 ,对其他离子的利用速度也减慢 ,细胞干重持
续增加 ,直至某些必需离子缺乏为止。 同时他们认为一定范
围内改变 p H值 ( 4～ 7)对生物碱生成没有显著影响。
( 2)光照对愈伤组织培养的影响: 在后指数期光强对细
胞生长有些影响 ,而对生物碱含量无明显影响 ;以白光为基
准 ,蓝光对细胞生长和生物碱积累均有促进作用 ,红光、黄光
影响程度在白光之下 ,绿光有抑制作用 [11]。一般认为光对阿
吗碱 /蛇根碱比值具有调节作用。郑珍贵等 [10]认为光照显著
减少了阿吗碱生成量 ,但光照时间对阿吗碱含量和释放量影
响不大 ,每天光照 12 h比 24 h生成的蛇根碱多 [12] ,而阿吗
碱正相反 [10]。
( 3)通气状况 [12]:体积氧传递系数和通气速率能明显地
影响细胞生长。Sma r t等人 [23]在 4 L的气升式反应器中培养
长春花细胞 ,生物量浓度和 KL呈线性关系 ,但当 KLA大于 25
h 时 ,生物量浓度和次生代谢产物率均明显下降 ,通气速率
的变化也是如此。溶解氧浓度 ( DO )与生物碱产率关系十分
密切 , Schla tmann[13]等人在 15 L搅拌式反应器中高密度培
养长春花细胞时 ,发现当 DO小于 29% 时 ,阿吗碱产率小于
0. 06μmo l /( g· d) , DO大于 43% 时 ,阿吗碱产率恒为 0. 21
μmo l /( g· d) ,而当 DO在 29%与 43% 之间时 , DO与阿吗
碱产量显著相关。
( 4)化学物质对生物碱生成的影响: 杨玉敏 [14]等用
EDTA处理长春花细胞系 ,处于生长后期的细胞比处于指
数期的细胞对外界刺激敏感 ,易得到更多的释放量 ,且处理
的浓度与时间对产物没有显著影响 ;用甲壳素处理 ,浓度较
低时 (小于 0. 25 g /L) 有利于产物释放 ;氮酮处理 ,浓度在
0. 05% 即足以促进胞内产物释放。
( 5)激素对组织分化和生物碱生成的影响: 杨玉敏 [15 ]等
用正交实验法研究不同浓度 6-BA、 NAA和间苯三酚对长春
花细胞分化的影响 ,获得高分化率的最优配比为: 6-BA 7. 0
mg /L , N AA 0. 5 mg /L ,间苯三酚 1. 0～ 5. 0 mg / L。 赵剑 [4]
等在诱导长春花愈伤组织的过程中使用不同种类和水平的
激素对生物碱的合成影响较大 ,发现 2, 4-D显著抑制生物碱
合成。
1. 3. 2　前体物质的添加:适度添加生物合成中的前体物质
可以提高次生代谢物的产量。 Whitme等人 [16]将裂环马钱子
苷 ( seco lo ganin) 添加到带有 ST RcDN A的转基因细胞系
S10的培养物中 ,在低 TDC情况下 ,色胺合成速率高 ,只要有
少量色胺存在即可提高裂环马钱子苷合成速率。色胺促进吲
哚碱的合成 ,前体物质供应不足影响 STR的催化作用。
1. 3. 3　诱导子的应用: Claudine等人 [17]用低浓度腐霉菌
py thium培养产生的诱导子处理长春花悬浮细胞 ,发现可以
刺激生物碱的产生 ,诱导子与生物碱合成可能存在一种长期
效应。 Grego rio[18]等人用 PC2500感染长春花得到的肿瘤细
胞进行液体培养 ,在得到的细胞悬浮系中分别加入不同浓度
( 0. 5～ 2. 0 mmol /L ) 的诱导子乙酰水杨酸 ( ASA ) , 1
mmol /L ASA促使总碱含量增加 5. 05倍、总酚含量增加
15. 78倍、呋喃香豆素类增加 14. 76倍。 ASA与匀浆的曲霉
素及反肉桂酸联用并未显著提高次生代谢产物含量。 王淑
芳 [19]研究了 6种不同来源的诱导子对培养了 15 d 的长春
花冠瘿瘤细胞次级代谢产物的刺激效果 ,发现均不同程度地
促进了细胞总吲哚生物碱的积累。其中在 100 m L细胞培养
养液中加入 5 m L大丽花轮枝孢菌制备的诱导子效果最好。
此外 ,用二乙氨基二氯苯酰、 5-氮胞苷、真菌多糖、甘露醇等
物质作为诱导子也有报道。可见诱导子在很多情况下不仅能
提高某些次生代谢产物的产量 ,有时有的还能产生新的化合
物。
1. 3. 4　培养技术的改进: 植物细胞大规模培养 [12]主要有悬
·79·中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　 2001年第 32卷第 1期
浮培养与固定化培养 ,悬浮培养又分为批式培养、饲喂批式
培养、半连续培养、二步培养和连续培养。采用的反应器有搅
拌式、气升式、气泡柱式、流化柱式、旋转柱式和生物膜式等。
从大规模生产考虑 ,目前最经济的培养方式为批式培
养 [20] ,连续培养工艺较复杂 ,固定化细胞培养需要将产物排
放到培养物中 ,因而目前大规模生产还有一定难度。 Asada
等人在研究中发现 ,用固定化反应器连续培养次生产物 ,贮
存在液泡中的长春花细胞生产次生代谢物是可行的 [21]。
Nuutila[22]等人比较了 3种类型的生物反应器 ,在喷气式
( air-spa rg ed)反应器中长春花发根生长和吲哚生物碱合成
均最好 ,在搅拌式和基质环流 ( medium circula tion) 反应器
中发根不能生长。植物细胞膜固定培养中 ,细胞层厚度 7～ 8
mm时生产能力可达到较高水平 ,孔径为 80μm的不锈钢丝
是适合的固定长春花细胞膜材料 ,压力脉冲是促进胞内生物
碱释放的有效手段 [23]。
2　遗传转化工程
遗传转化是利用重组 DN A、组织培养或种质系统转化
等技术将外源基因导入植物细胞或组织中获得转基因植物
的技术。 根癌农杆菌 Agrobacterium tume faciens的 Ti质粒
和发根农杆菌 A . rhizogens的 Ri质粒含有控制生长素合成
所必需的 DN A片段 ,用 Ti质粒和 Ri质粒感染培养组成或
细胞 ,获得自身能够合成生长素的转化体 ,它们在没有任何
外源激素的培养中也能正常增殖 ,并且是已分化、具有组织
特异性的组织。
2. 1　 Ti质粒转化 :王宁宁等人 [24 ]用根癌农杆菌 C58转化长
春花愈伤组织获得冠瘿组织。 实验表明 ,冠瘿组织中阿吗碱
的最高含量是愈伤组织的 2. 6倍。得到的冠瘿组织在相同培
养条件下与处于最佳生长条件下的愈伤组织相比 ,在细胞产
量、总吲哚生物碱含量和药用成分阿吗碱含量等方面都有很
强的优势。
Hallard等人 [25]将长春花编码色氨酸脱羧酶 ( TDC)和
异胡豆苷合酶 ( ST R)的 cDN A用 CaMV35s RN A启动子转
入烟草中 ,并进行悬浮培养 ,一个生长周期内 ,转基因烟草细
胞 TDC (色氨酸脱羧酶 )活力基本不变。 S TR活力提高 2～
6倍 ,未转化烟草中不能检测到酶活力。 饲喂裂环马钱子苷
后 ,转化物中积累了异胡豆苷 ,表明 TDC与 STR这两种由
T-DN A编码的酶能单独起作用。用色胺与裂环马钱子苷联
合饲喂能增强这种作用。 STR活力不能在培养基中检测到 ,
说明裂环马钱子苷的作用及异胡豆苷的合成都在细胞内进
行。编码酶的 cDN A的克隆转化技术的快速发展 ,为次生代
谢产物的生产提供了更多的可能性和更广泛的空间。
2. 2　 Ri质粒转化:用发根农杆菌侵染植物使 Ri质粒的 T-
DN A整合到植物的基因组中 ,诱发被感染植物的受伤部位
长出毛状根 ( hair y roo t) ,利用毛状根筛选有利的变异性质
的克隆以提高次生代谢物的含量。 Par r等人 [26]通过 HPLC
及放射免疫检测到长春花毛状根中含有长春碱 ,但其含量相
当低 ,仅有 0. 05μg /gdw。 也有报道认为长春花毛状根不能
合成长春碱 ,如 Toiv onen等人 [27 ]用 15834、 R1000等 6种菌
株感染长春花 ,从感染的长春花根中筛选出 47个无性系 ,没
有一个检测到长春碱。 1998 年 Moreno[28]将无激素的
Phillips & Co llins液体培养基中的微量元素增加 5倍得到
脱分化细胞 ,于 B5培养基上得到再分化根 ,将根分离培养
于与原根相同条件下 ,脱分化根的吲哚生物碱含量下降 5
倍 ,而再分化根又回到原来水平。 目前发根农杆菌诱导产生
的长春花发根培养物中含有文朵灵、长春花碱和阿吗碱 ,而
且检测到 DAT酶活性。 Pa rr等人 [28 ]等转化长春花得到的发
根培养物在 28 d的生长期内 ,发根质量增加了 320倍 ,并合
成了高产量的吲哚生物碱 ,包括阿吗碱、文多灵和长春质碱。
Moreno等人 [28 ]研究了无机盐成分对发根生长与长春花碱
积累的影响 ,发现硝酸盐对发根生长和长春花碱生成均有
利 ,铵和磷酸盐则产生相反作用 ,硼酸盐和钼盐对发根生长
和长春质碱生成均有抑制作用 ,碘化钾硫酸盐和铁盐没有太
大的影响。因此关于 Ri质粒转化技术生产长春花生物碱 ,还
有待于科技工作者进一步研究。
3　展望
目前利用细胞工程和遗传工程等生物技术在改良长春
花品质、提高生物碱含量等方面取得了一些成绩。 但是细胞
培养单位产出成本高 ,高密度培养时生物碱含量降低 ,细胞
培养不能产生吲哚生物碱二聚体长春碱和长春新碱 ,甚至不
能产生它们的前体之一文朵灵 ;利用遗传转化技术获得的转
化体中尚未得到可用于工业化生产的高产株系。随着培养技
术的不断改进和设计出更合理的反应器 ,以及将控制长春
碱、长春新碱、文多灵合成的关键酶基因克隆出来并转化成
功 ,不久的将来 ,得到高产的长春花植株或细胞株一定会成
为现实。
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硬胶囊封口技术的应用
王春龙 1 ,石　宁 2 ,张志北3 ,史金星4
⒇
( 1. 天津药物研究院 ,天津　 300193;　 2. 西安美辰制药有限责任公司 ,陕西 西安　 710043;　 3. 天津南华制药有
限公司 ,天津　 300452;　 4. 山西省医药物资供销公司 ,山西 太原　 030012)
摘　要: 结合笔者的工作介绍了硬胶囊的封口技术 ,分析了影响硬胶囊剂内装药物稳定性的外界因素及解决办法 ;
对硬胶囊封口技术在提高药物稳定性、防止假冒和保证挥发性药物质量等方面的应用进行了综述 ,认为该技术不
仅在已生产品种上具有重要的应用价值 ,而且在新药研究与开发中也会有深远的意义。
关键词: 硬胶囊 ;稳定性 ;封口技术
中图分类号: R944. 5　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2001) 01 0081 03
Application of sealing technique in hard gelatin capsule
W ANG Chun-long1 ; SHI Ning2; ZHAN G Zhi-bei3; SHI Jin-xing4
　　 ( 1. Tianjin Institute of Pha rmaceutical Resea rch, Tianjin 300193, China; 2. Xi an Meichen Pha rmaceutical CO. , L td. ;
3. Tianjin Nanhua Pharmaceutical Co. , Ltd. , Tianjin 300452, China; 4. Shanxi Supply and Marke ting Co rpo ra tion of
Medicinal Goods and Mate rials, Taiyuan Shanxi 030012, China)
Key words: hard gela tin capsules; stabili ty; sealing tech nique
　　硬胶囊剂是口服给药的重要剂型之一 ,在我国已有数十
年的生产、应用历史。 到目前为止 ,在我国药用胶囊的生产
上 ,还一直没有从根本上解决对灌装药物后的胶囊进行封口
这一难题。国家药品监督管理局“每季度的药品抽检通报”显
示 ,我国药品经营中有一些不合格品种 ,其中胶囊剂含量、水
分超标和泄漏等问题仍是影响胶囊剂药品质量的重要因素。
同时 ,药品市场也有一定量的胶囊剂假冒伪劣产品 ,使患者
用药缺乏安全感。 近几十年 ,在加拿大和美国先后就发生了
由于罪犯分子向市售的某胶囊内混入氰化物 ,导致患者服用
后中毒死亡的事故。因此 ,近几年来 ,硬胶囊封口技术已受到
·81·中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　 2001年第 32卷第 1期
⒇ 收稿日期: 2000-08-17作者简介:王春龙 ( 1960-) ,男 ,辽宁省鞍山市人 , 1983年毕业于沈阳药学院 ,现任天津药物研究院制剂研究室副主任 ,副研究员。研究方向:药物缓控释制剂、靶向制剂、微粒制剂、中药制剂现代化、药物制剂应用技术等。
Tel: ( 022) 23006880; 23006879(传真 )　　 E-mai l: ch unlongw ang@ 263. net