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13种生药提取物及化学成分的抗真菌活性筛选
王理达 ,胡迎庆 ,屠鹏飞 ,吴之伟 ,郑俊华 ,果德安
(北京大学药学院 ,北京　 100083)
摘　要: 目的　对 13种生药的醇提物及 13种单体化合物进行啤酒酵母突变性 GL7和威克海姆原藻敏感性测试。
方法　采用显镜直接计数法和 M TT(噻唑蓝 )法确定微生物的最低抑菌浓度 ( M IC)及其抑菌效果。结果　黄柏、丁
香、乌梅、黄连、山豆根对二者均有强烈抑制作用。 澳洲茄对威克海姆原藻 (Prototheca wickerhamii )的 M IC比啤酒
酵母突变型 GL7( Saccha-romyces cerevisiae GL7)的 M IC低 40倍。结论　各种生药提取物及化学成分对不同微生
物的抑制效果有显著不同 ,澳洲茄胺是甾醇生物合成途径的阻断剂 ,紫檀 、 7-羟基 -4′-甲氧基黄烷和白鲜碱对 2
种微生物中的甾醇生物合成途径没有影响。
关键词: 生药 ;抗真菌 ;甾醇生物合成 ;啤酒酵母 ;威克海姆原藻
中图分类号: R285. 5　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2001) 03 0200 03
Antifungal activity screening on 13 crude drug extracts and chemical constituents
WAN G Li-da, HU Ying-qing , TU Peng-fei, WU Zhi-wei, ZHENG Jun-hua , GUO De-an
Key words: crude drug; antifungal activi ty; stero l biosynthesis; Saccharomyces cerevisiae; Prototheca
wickerhamii
　　致病真菌对人类的危害是广泛而严重的。 寻找
高效低毒的抗真菌药物已成为当务之急。 很多具有
抗真菌活性的传统中药是值得开发的重要资源。
麦角甾醇作为真菌细胞膜的构建成分 ,没有或
缺少麦角甾醇 ,真菌就不能正常生长甚至死亡 ,通过
寻找麦角甾醇生物合成的阻断剂是寻找抗真菌药物
的重要手段之一。 目前对抗真菌化学合成药物的研
究也主要集中在设计麦角甾醇的生物合成抑制剂 ,
但从生药中寻找麦角甾醇生物合成抑制剂作为抗真
菌药物的研究尚未见报道。
威克海姆原藻 (Prototheca wickerham ii )寄生或
腐生于木材、蔬菜和粪便中 ,引起人皮肤、皮下组织、
口腔、鼻、浆膜等处病变 ,统称无绿藻病 ( proto theco-
sis) ,偶尔可引起系统性感染 [1 ]。临床上把它归为真
菌病 ,用抗真菌药物进行治疗。自 Davies等 [2 ] 1964
年报道首例无绿藻病例 ,目前该病仍有上升趋势 ,尚
无特别有效的治疗药物 ,往往需要手术治疗。啤酒酵
母突变型 GL7( Saccharomyces cerevisiae GL7)自身
不能合成甾醇 ,需饲喂甾醇以维持正常生长 ,因此可
对其生物合成途径进行监测。 这两种微生物的生物
合成途径已被阐明 [3, 4 ] ,二者的甾醇生物合成途径不
同 ,因此应用这两种微生物有利于研究抗真菌天然
产物对甾醇生物合成途径的影响。
为此作者选择了已有报道的有较好抗真菌活性
的中药川芎 [ 5]、栀子 [6 ]、黄柏 [5, 6 ]、丁香 [ 6]、紫草 [6 ]、乌
梅 [7 ]、使君子 [ 5, 7]、白芷 [6 ]、黄连 [6 ]、龙胆 [ 5]、秦艽 [5 ]、防
·241·中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　 2001年第 32卷第 3期
收稿日期: 2000-03-23基金项目:中华医学基金专项人才基金和教育部跨世纪优秀人才基金作者简介:果德安 ,男 ( 1962-04-) ,山东郓城人 ,北京大学药学院教授 ,博士生导师。 现任北京大学天然药物及仿生药物国家重点实验室副主任 ,天然药物学系副主任。先后在国内外杂志上发表论文 100余篇 ,其中有 28篇 SC I收录论文 ,被 SCI引用 120余次。获得包括国家杰出青年基金、国家教育部跨世纪优秀人才基金等 5项人才基金。通讯地址:北京海淀区学院路　 38号北京大学药学院。 电子邮件: gda@ mai l. b jmu. ed u. cn
己 [5 ]、山豆根 [7 ]等药材的醇提物及天然产物进行了
啤酒酵母突变型 GL7和威克海姆原藻的敏感性测
试 ,以期从天然产物中寻找作用靶点在甾醇生物合
成途径上的抗真菌药物 ,为开发高效低毒的抗真菌
天然药物奠定基础。
1　材料与方法
1. 1　材料: 啤酒酵母突变型 GL7( Saccharomyces
cerev isiae GL7)和威克海姆原藻 (Prototheca wicker-
hamii )菌种均由 W. Dav id Nes博士 ( Department of
Chemistry and Biochemist ry, Texas Tech Univ er-
si ty , Lubbock 79409, TX, USA)赠送。
1. 2　仪器: HZQ-Q全温振荡器 (哈尔滨东联电子技
术开发公司 ) ,酶标仪 ( BioRad550型 )。
1. 3　药品与试剂: 蛋白胨 ( Peptone, 购自 DIFCO
公司 ) ,酵母提取物 ( Yeast Ex t ract, 购自 OXOID公
司 ) ,葡萄糖 (汕头市光华化学厂 ) ,两性霉素 B
( AmB,购自 GIBCO公司 ) ,噻唑蓝 ( M T T,购自北
京原平生物技术公司 ) ,酮康唑 (西安杨森制药有限
公司 ) ,试剂均为分析纯。
1. 4　方法
1. 4. 1　微生物细胞培养:培养基为蛋白胨 2% ,葡
萄糖 2% ,酵母提取物 1% ,每瓶接种适量微生物细
胞 ,终浓度为 104 cfu /mL。置于 30℃ , 100 r /min摇
床培养。
1. 4. 2　生药粗提物的制备 ,生药各 250 g,粉碎 ,过
20目筛 ,分次用 70%乙醇浸 72 h,每次加 5倍量乙
醇 ,共 3次 ,滤过 ,滤液合并 ,减压回收乙醇得流浸
膏。流浸膏用 70%乙醇配成 1∶ 1药液 ,用培养基分
别稀释成 1 /10, 1 /20, 1 /40, 1 /80浓度 ,于 4℃冰箱
保存备用。
1. 4. 3　检测药物对微生物细胞抑制效果的方法:
( 1)显微镜直接计数法 [8 ] ,用血球计数板在镜下
( 400X)计数。为了区分死细胞和活细胞采用活体染
色法。用美蓝配成一定的浓度 ,再与等体积的细胞悬
液混合 ,经一段时间后 ,活细胞表现出无色 ,而衰老
或死亡的细胞呈蓝色或淡蓝色。 ( 2) M TT法 [9 ] ,
M TT用磷酸缓冲液 ( 0. 2 mol /L PSB, pH7. 2)溶解
配成 1 mg /mL溶液 ,药物配成 3 mg /mL母液 ,
M TT及药液均用 0. 45μm微孔滤膜过滤灭菌。 96
孔细胞培养板在紫外灯下照射 40 min。第一孔药物
终浓度为 1 mg /mL,依次稀释 10倍或对倍稀释 ,以
不加药液为阴性对照 ,两性霉素 B为阳性对照。 每
孔加 0. 1 mL菌悬液 (细胞终浓度为 104 cfu /mL)。
作 3组重复。置 30℃培养 3 h,每孔加 50μL MT T,
15 min后产生蓝色颗粒 , 3 000 r /min离心 10 min,
吸弃上清液 ,每孔加 100μL二甲基亚砜 ( DM SO) ,
振荡 10 min以彻底溶解颗粒 ,用酶标仪 570 /630
nm读取吸光度值。 ( 3) M IC80与 M IC100的确定 ,
M IC80为与对照相比抑制 80%生长的最低药物浓
度。 M IC80作为抗真菌剂 ( fungista tic)的最低抑菌浓
度 ,即虽未杀死细胞但抑制其生长。M IC100为没有可
见的细胞生长的最低药物浓度。 M IC100为杀真菌剂
( fungicide)的最低抑菌浓度。 精确称取一定量的药
品 ,用 DM SO溶解 ,配成一定浓度的药液 ,再稀释成
不同浓度。将处于对数生长期的细胞接种含药的培
养基中 ,细胞终浓度为 104 cfu /mL,于 30℃恒温箱
中培养 , 48 h在不搅动情况下用肉眼观察 ,溶液澄
清透明视为无细胞生长 ,取完全不生长管最低药物
浓度为最低抑菌浓度 ( M IC)。
2　结果与讨论
生药醇提物及生药活性成分对 P. wickerhamii
及 S. cerevisiae GL7的抑制效果如表 1, 2所示。
表 1　生药醇提物对 S . cerevisiae GL7和 P . wickerhamii的抑制效果 (% )
1 /10 1 /20 1 /40 1 /80
生药 P S P S P S P S
川芎　 100 　　　 74. 6 　　　 100 　　　 61. 0 　　　 83. 3 　　　 29. 7 　　　 74. 6 　　　 7. 6
栀子　 83. 9 70. 6 58. 5 50. 2 20. 3 45. 0 8. 5
黄柏　 100 84. 8 100 66. 9 85. 9 55. 1 77. 3 61. 0
丁香　 100 100 100 100 84. 2 100 84. 2 86. 4
紫草　 100 24. 1 100 　　　 - 100 100
乌梅　 65. 1 47. 7 62. 1 51. 7 44. 4
使君子 15. 0 18. 2 　　　 - 　　　 -
白芷　 8. 5 60. 6 　　　 - 60. 2
黄连　 100 84. 2 100 84. 9 100 68. 4 100 77. 6
龙胆　 - 81. 8 40. 9 40. 9 40. 9
秦艽　 97. 0 68. 4 92. 5 56. 1 80. 6 36. 0 37. 3
防己　 83. 3 47. 9 75. 4 32. 4 74. 6 　　　 -
山豆根 100 100 100 100 75. 8 81. 4 59. 5 68. 6
　　　　 - :无抑制　 P: Prototheca wickerh am ii , S: Saccha romyces cerevisiae GL7
·242· 中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　 2001年第 32卷第 3期
从表中可知黄柏、丁香、乌梅、黄连、山豆根对二者均
有强烈抑制作用 ,紫草、龙胆对 S. cerev isiae GL7抑
制作用很强 ,而对 P . wickerham ii则无作用。反之 ,
白芷对 P . wickerham ii有较好的抑制作用 ,却对 S.
cerev isiae GL7的生长无影响。可见各种药物对细胞
作用机制不同 ,导致其对不同种类细胞抑制效果的
差异。如果能阐明一种药物对微生物的作用机制 ,则
用其作为治疗药物可减少盲目性 ,提高治疗效率。
　　　表 2　生药活性成分对 S. cerev isiae GL7和
P . wickerhamii的抑制效果 (% )
100μg /mL 10μg /mL
样品
S P S P
小檗碱　 55. 7 94. 0 9. 0 32. 1
紫草素　 70. 4 48. 2 51. 9 -
药根碱　 19. 2 45. 4 9. 0 7. 1
麻黄碱　 45. 3 46. 0 - 21. 4
浙贝素乙 25. 9 17. 9 14. 6 -
贝母素甲 27. 4 29. 6 16. 1 18. 5
鬼臼毒素 34. 5 22. 2 28. 7 14. 8
巴马汀　 48. 7 - -
苦参碱　 36. 8 - 21. 9
　　 - : 无抑制 P: Prototheca wickerhami i , S: Saccha romyces cere-
visiae GL7
几种生药活性成分对两种微生物的抑制效果如
表 2所示 ,小檗碱对 P. wickerhamii的抑制效果好
于对 S. cerevisiae GL7的抑制效果 ,紫草素则相反 ,
对 S. cerevisiae GL7有较好的抑制效果。其他几种
天然产物则未表现出好的抗真菌活性。 经作者实验
证明这几种天然产物的作用靶点也不在甾醇生物合
成途径上。
几种抗真菌生物活性成分对 P. wickerhamii和
S. cerevisiae GL7的最低抑菌浓度如表 3所示。 酮
康唑 ( ketoconazole)是临床上广泛应用的治疗系统
性真菌病的药物 ,作用靶点是甾醇生物合成途径中
的 14位去甲基酶。 24-(R , S ) -25-epiminolanostero l
是一种化学合成的 24-甾醇甲基转移酶的真菌甾醇
生物合成抑制剂。为此本实验以酮康唑和 24-( R,
S ) -25-epimino lanostero l为阳性对照样品。 从表中
可见各种抗真菌剂对两种微生物的敏感性有差异 ,
其中澳洲茄胺与 24-(R , S ) -25-epiminolanosterol对
P. wickerhamii和 S. cerev isiae GL7的最低抑菌浓
度差异更大 , P. wickerhamii和 S. cerevisiae GL7
的甾醇生物合成途径有较大差异 , 经作者研究表明
表 3　抗真菌剂抑制浓度 (μg /mL)
P. wickerh am ii S. cerevisiae GL7
样品 M IC80 M IC100 IC50 M IC80 MIC100 IC50
澳洲茄胺 2. 5 5 1. 25 100 200
白鲜碱 50 100 125 250 62. 5
7-羟基 -4′-甲氧基黄烷 50 25 100
紫檀芪 32. 5 50 2. 03 75 37. 5
24-(R , S ) -25-epiminolanos terol 0. 125 0. 25 100 400 50
酮康唑 > 250 250 500
澳洲茄胺抗真菌作用的主要靶点在甾醇生物合成途
径中的关键酶 24-甾醇甲基转移酶 ( stero l C-24
methyl transferase)上。澳洲茄胺对 P . wickerham ii
的 M IC是 S. cerev isiae GL7的 M IC 1 /40,在 P.
wickerhamii中甾醇生物合成途径中 24位甲基化反
应是第一步反应 ,在 14位去甲基反应和 8( 9)位双
键移位之前 ,此步被抑制后累积前体环陈屯醇 ( cy-
cloartenol ) ,其不但不能支持微生物的生长 ,反而对
细胞膜有损害作用。而在 S. cerev isiae GL7中甲基
化酶抑制剂的加入将引起酵母甾醇的累积 ,酵母甾
醇的结构与麦角甾醇更多相似之处 ,可部分地起到
麦角甾醇的细胞膜骨架作用 ,但酵母甾醇不是细胞
膜的最佳构建成分 ,不能完全替代麦角甾醇 ,从而影
响了的正常生长代谢 ,所以澳液茄胺对 S. cerevisi-
ae GL7仍表现出一定的生长抑制。紫檀 、 7-羟基 -
4′-甲氧基黄烷和白鲜碱显示了较好的抑菌作用 ,但
研究表明它们对 2种微生物中的甾醇生物合成途径
没有影响 ,其抗真菌作用机现有待进一步研究。
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海星总皂苷抗肿瘤作用的实验研究
王　兵 1 ,郑意端 2
( 1. 深圳海王生物工程股份有限公司 ,广东 深圳　 518054;　 2. 深圳源政药业有限公司 ,广东 深圳　 518057)
摘　要: 目的　对从南海海星 Craspidastet hesperus Muller et tr oschel中分离提取的总皂苷进行抗肿瘤活性研究。
方法　采用体外肿瘤细胞培养和体内抗肿瘤实验方法 ,测定海星总皂苷的体外和体内抗肿瘤作用。 结果　海星总
皂苷对体外培养的小鼠移植性肿瘤肉瘤 S180、肝癌 H22细胞有直接的细胞毒作用 ;能明显的抑制小鼠移植性肉瘤
S180的生长 ,延长 H22腹水小鼠的生存时间。 结论　海星总皂苷具有明显的抗肿瘤活性 ,可望用于恶性肿瘤的治疗。
关键词: 海星总皂苷 ;抗肿瘤 ;细胞毒
中图分类号: R979. 1　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2001) 03 0244 02
Study of astersaponin on antitumor effects
W ANG Bing1 , ZHENG Yi-duan2
　　 ( 1. Neptunus Bio eng ineering , Co. Ltd. , Shenzhen Guangdong 518054, China; 2. Shenzhen Yuanzheng Pharmaceutical
Co. L td. , Shenzhen Guangdong 518057, China)
Key words: astersaponin; anti tumo r effects; cytotoxici ty
　　皂苷在自然界中分布很广 ,具有增强免疫功能、
抗幅射、抑制肿瘤生长、抗炎、降血糖等广泛的生物
学活性 [1 ] ,近年越来越受到人们的普遍关注。我国海
域辽阔 ,海洋生物资源十分丰富 ,海洋生物中的生理
活性物质是研究和发展新化学成分 ,开发新药的天
然宝库。海星属棘皮动物门海星纲 ,是海洋中常见的
无脊椎动物之一。 我们对从南海海星 Craspidastet
hesperus Muller et t ro schel中提取的总皂苷进行了
体外和体内抗肿瘤实验研究。
1　实验材料
1. 1　动物与瘤株: N IH纯系小鼠 ,体重 ( 20± 2) g ,
雌雄各半 ,由广东省卫生厅医学实验动物中心提供。
腹水型肉瘤 ( S180 )和腹水型肝癌 ( H22 )小鼠由广州中
山医科大学肿瘤研究中心提供。
1. 2　药品与试剂: 四甲基偶氮唑盐 ( 3-4, 5-die-
methyl thiazo1-2, 5-diphenyl tet ra zo lium bromide,
M T T) , Sigma公司产品 ,溶于 Hank s液 , 4℃短期
存放。 RPM I-1640购自 Gibco公司。
2　实验方法
2. 1　海星总皂苷的提取: 海星用石油醚脱脂 ,然后
用 95%乙醇回流提取 3次 ,减压浓缩至一定体积 ,
加水溶解 ,水溶液用正丁醇提取 ,抽得液经减压浓
缩 ,残留物溶于少量乙醇 ,加大量丙酮即析出沉淀
物 ,加乙醇溶解 ,加丙酮沉淀 ,反复处理 3次 ,取沉淀
干燥 ,得浅棕色粉末。取少量浅棕色粉末 ,经浓硫酸
显色反应和溶血反应证明其为总皂苷 [2 ]。 临用时以
生理盐水配成一定浓度备用。
2. 2　细胞培养:实验时分别无菌抽取 6 d龄 S180和
H22小鼠腹腔内瘤细胞 ,以 Hank s液洗涤 2遍 ,以含
100 U /mL青霉素和链霉素 , 20%小牛血清 RPM I-
1640培养液调整成一定浓度的细胞悬液 ,置 CO2培
养箱内 ,在 5% CO2、 37℃、充分湿化条件下培养 24
h备用。
2. 3　体外抑瘤实验:依据文献 [3, 4 ] ,生长良好的 S180
细胞和 H22细胞 ( 1. 0× 109 cfu /L)分别接种于 96孔
培养板 ,每孔 180. 0μL,再加入一定浓度的海星总
皂苷 20. 0μL,以生理盐水为空白对照组 ,每组做 4
个平行孔 ,然后于 5% CO2、 37℃、充分湿化条件下
培养 48 h后 ,每孔加入 50. 0μL MT T,继续培养 4
h后小心去除上清液 ,加入二甲亚砜 ( DM SO) 150. 0
·244· 中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　 2001年第 32卷第 3期
收稿日期: 2000-07-11作者简介:王　兵 ,男 ,中山大学药学系硕士毕业 ,现在深圳海王生物工程股份有限公司从事新药研究开发工作。 Tel: 0755-6405410