全 文 ：·药材·
同种不同产地牛蒡子 DNA指纹图谱特征研究
徐朝晖 ,杨松松 ,康廷国
(辽宁中医学院 中药系 ,辽宁 沈阳　 110032)
摘　要: 目的　探讨同种不同产地牛蒡子 DN A指纹图谱特征。 方法　采用 RAPD技术对全国四大商品区的中药
牛蒡子生品和其中两个商品区的制品进行了 DNA指纹图谱特征研究。结果　四大商品区的生品牛蒡子 DN A指纹
图谱一致 ,制品牛蒡子的 DN A指纹图谱与生品的有较大差异。 结论　 DN A指纹图谱用于鉴定同种药材的生品结
果可靠。
关键词: 牛蒡子 ; RAPD; DN A指纹图谱
中图分类号: R282. 7103　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2001) 06 0541 02
Studies on DNA fingerprinting of Arctium lappa from different localities
XU Zhao-h ui, Y ANG Song-song , KAN G Ting-guo
　　 ( Depa rtment o f Chinese Ma teria Medica , Shenyang Co lleg e o f TCM , Shenyang Lia oning 110032, China )
Abstract: Object　 To study the DN A fingerprinting of Arctium lappa L. obtained from di fferent lo-
cali ties. Methods　 DNA fingerprinting of samples of crude and processed A . lappa co llected f rom four
la rg e commercial centers were examined by RAPD. Results　 All crude A. lappa show ed similar fing er-
printing characteristics, while the processed products g ave considerable di fferent resul ts. Conclusion　
DNA fingerprinting study is a reliant method to dif ferentiate crude A. lappa from i ts processed product.
Key words: Arctium lappa L. ; RAPD; DN A fingerprinting
　　前文已报道过 RAPD法鉴别中药牛蒡子及其
混淆品 [1 ] ,本文在此基础上 ,对全国同种不同产地中
药牛蒡子的 DNA指纹图谱特征进行了研究。
牛蒡子又称大力子 ,根据产地和商品流通区域划
分主要有关大力 (东北及华北东部 )、杜大力 (华东 )、
川大力 (西南 )、泽大力 (华中 )四种。根据中药“逢子必
炒”的炮制原理 ,在市场流通中有很多是炒制品。
1　材料
本实验采用了全国四大商品区的生品和其中两
个商品区的制品 (表 1) ,旨在探求同种药材不同产
地及同一产地生、制品药材的 DNA指纹图谱特征。
表 1　实验材料
药材 基源 生 (制 )品 采集地区 采集时间 标本号
关大力 Arctium lappa L. 生品 黑龙江木兰 1998-07 1
制品 1996-09 5
杜大力 A. lappa 生品 浙江桐乡 1998-03 2
制品 1996-04 6
泽大力 A. lappa 生品 河南郑州 1997-02 4
川大力 A. lappa 生品 四川成都 1995-04 3
2　试剂和仪器
试剂: T ris、 dN TPs、 Buf fcr、 Tag酶、β -硫基乙
醇、引物、 BSA、琼脂糖、 SDS、 100 bp DN A ladder购
自上海生工生物工程有限公司 ,其余试剂均为国产
分析纯。
仪 器: PCR 仪 ( PTC-100TMProg rammable
Ther-ma l Control ler, M J Research, Inc, USA) ,电
泳仪 ( DYY-III8B型 ,北京六一仪器厂 ) ,紫外可见
分光光度计 ( UV755B,上海分析仪器总厂 ) ,台式高
速离心机 ( TGL-16G,上海医用分析仪器厂 ) ,紫外
反射透射仪 (W FII-201型 ,上海分析仪器总厂 )。
3　方法
3. 1　总基因组 DNA的提取与纯化:根据王培训 [2 ]
等的植物总 DNA提取法加以改进 ,取 0. 2 g各实验
药材样品于乳钵中用液氮冷却研碎成细粉 ,放入
1 mL Ep管中 ,加入 400μL 56℃提取缓冲液 ( 100
mmol /L NaOAc, 50 mmol /L ED TA, 500 mmol /L
NaCl, 2. 5% PV P, 3% SDS, 1% β -硫基乙醇 , p H
5. 5) ,于 56℃水浴 30 min后 , 10 000 r /min离心
·541·中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　 2001年第 32卷第 6期
收稿日期: 2000-07-07基金项目:国家“九· 五”科技攻关课题　基金号: 96-903-02-01作者简介:徐朝晖 ( 1970-) ,男 ,安徽省芜湖市人。2000年 7月毕业于辽宁中医学院 ,获医学博士学位。主要研究方向为天然药物化学和中药新药的研究与开发。 现在上海浦东张江高科技园区从事天然产物的研究与开发工作。
10 min,取上清液加入 2 /3体积的 KOAc溶液 ( 2. 5
mol /L, pH4. 8) ,于 4℃放置 15 min后 , 10 000
r /min离心 10 min,吸上清液移入另一支 1 mL EP
管中 ,加入等体积氯仿 -异戊醇 ( 24∶ 1)抽提 ,混匀
后 , 10 000 r /min离心 10 min, 吸取上清液 ,重复用
氯仿 -异戊醇 ( 24∶ 1)抽提 2次 ,上清液加入 2倍体
积无水乙醇混匀后于 - 20℃冰箱中静置 20 min,
10 000r /min离心 10 min后所得 DNA沉淀用 70%
乙醇洗 2次 ,空气干燥后溶于无菌重蒸馏水中 ,在 4
℃保存备用。
3. 2　 RAPD扩增反应: 反应总体积为 25μL,其成
分为: 10× Buf fcr w /Mg2+ 加 2. 5μL 200μmol /L
dN TPS, 0. 5 g /L BSA, 2 U TaqDN A聚合酶 , 20
ng模板。扩增程序为: 94℃ , 1 min; 36℃ , 35 s; 72
℃ , 70 s; 2个循环。随后 94℃ , 10 s; 36℃ , 35 s; 72
℃ , 70 s; 42个循环。最后 72℃ 保温 5 min。
3. 3　扩增产物检测: 取 RAPD反应液 10μL于
1. 6%琼脂糖凝胶上用 10× TBE电泳缓冲液
( 0. 045 mo l /L Tris-硼酸 , 0. 001 mo l /L EDT A,
pH8. 0)电泳 ,电压 5 V /cm,电泳距离 4 cm。 经 EB
染色 ,在紫外透射反射仪下观察并照相 ,扩增产物长
度与 100 bp DN A ladder标记物比较。
4　结果
对 20个随机抽选的引物进行了扩增实验 ,结果
四个引物扩增出 DNA条带 ,其中引物 S1367 ( 5′-
CACGAG TCTC-3′)扩增的结果稳定 ,如图 1所示:
关大力、川大力、杜大力、泽大力生品扩增的 DNA
指纹图谱完全一致。 分别在 500, 700, 900和 1 000
bp出现条带。而关大力与杜大力制品则与前四者有
差异 ,关大力制品 900 bp的条带不明显 ,多出 400
bp的条带 ,而杜大力制品仅在 500和 700 bp处出
现两条条带。
5　讨论
5. 1　从以上实验结果可知 ,采用与上一个实验相同
的引物 [1 ] ,同种不同产地的四种生品牛蒡子扩增出
的 DNA条带的位置与上一个实验完全一致 ,均出
M-100 bp DNA ladder 1-关
大力　 2-杜大力　 3-川大力
4-泽大力　 5-关大力 (制品 )
6-杜大力 (制品 )
图 1　同种不同产地牛蒡
子的 RAPD指纹图
谱
现在 500, 700, 900, 1 000
bp。这说明采用该引物在
上述实验条件下反应具有
较好的重现性。同时 ,同种
不同产地的四种生品牛蒡
子扩增出的 DNA指纹图
谱相同 ,再次证明 [3 ] DNA
指纹图谱用于鉴定同种药
材的生品结果可靠。
5. 2　本实验所提取的基
因 组 总 DNA 纯 度 , 按
A260 /A280之值判断 (结果见
表 2) ,均符合扩增要求 [4 ]。
而经过炮制的牛蒡子与其
生品的 DNA指纹图谱相
比 ,主要缺少较长碱基对
的扩增条带 ,推测是由于在高温下 DNA降解所造
成。这表明对于炮制过的中药材 ,如何能从中提取出
未降解的基因组总 DNA,还有待进一步探讨。另外 ,
同种炮制方法 (炒牛蒡子 )的杜大力和关大力制品 ,
DN A指纹图谱差异较明显 ,提示: DN A指纹图谱可
用于中药炮制品的质量控制和指导炮制工艺研究。
当然 ,尚需做大量深入的研究工作。
表 2　各样品的总 DNA纯度测定数据
样品 纯度 样品 纯度
对照药材　 1. 9 杜大力　　 1. 4
关大力　　 1. 5 杜大力 (制 ) 1. 3
关大力 (制 ) 1. 4 泽大力　　 1. 5
川大力　　 1. 3
　　致谢: 本实验得到沈阳农业大学辽宁省农业生物
技术中心李浩戈老师 ,吴元华教授的大力协助。
参考文献:
[ 1 ]　徐朝晖 ,涂　为 ,杨松松 ,等 . RAPD法结合 TLC鉴别中药牛
蒡子及其混淆品 [ J]. 中草药 , 2000, 31( 6): 455-458.
[2 ]　王培训 ,黄　丰 ,周　联 ,等 . 植物中药材总 DNA提取方法的
比较 [ J ]. 中药新药与临床药理 , 1999, 10( 1): 18-20.
[ 3 ]　张　荣 ,邵建本 ,田学明 ,等 . 用 RAPD分析法对铁线莲属 7
种中药的鉴定研究 [ J] .中草药 , 1996, 27( 11): 686-687.
[4 ]　王培训 ,黄　丰 ,周　联 ,等 . RAPD在商品中药鉴别中若干问
题的探讨 [ J] .中药新药与临床药理 , 1999, 10( 2): 112-115.
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