全 文 ：用 R A PD 分析法对铁线莲属 7 种中药的鉴定研究
邵建本
张 步振
田学明
叶 浩
荣静张杨成都军区昆明总医院药剂科 (昆明 6 5 。。3 2)
摘 要 用 R A PD 法对铁钱莲属 7 种生药的鉴定〔即山棉花 Clema tis ch rySOC~ Fr
. 、三叶五香血
藤 C . fa sc ic ul ijblia Fr . 、小九头狮子草 C . ra 二“nc u l厉d 云5 Fr . 、小木通 C . a~
摊己滋1 F r . 、红叶铁线莲
c
.
ru 从户 li a C . H . W ri gh t 、红钉耙藤 C . 加曰五““J。招 D C . 、和铁线莲 C . 刀。八J 口 T hu n h . 〕. 结果表明
R A PD 种间差异明显而同种不同产地差异不明显 .
关钮词 铁线莲属 R A P D 鉴定
R A PD (R a n d o m ly A m p lifie d Po lym o r
-
p hi 。 D N A )是最近发展起来的一种新的分子
标记方法〔幻 , 被广泛应用于生物学中〔3 ·‘, 。 该
方法与 R FL P 分析类似 , 也可 以检测 D N A
多态性 。 但检测的不是限制性内切酶切片段
长度多态性 , 而是随机引物的 PCR 特异扩增
的多态 性 。 故 其操作 简单 、 快速 , 不使 用
So ut he rn 杂交 , 仅通过 PC R 反应就可 以完
成 。 因此 , 采用 R A PD 方法用于生物类中药
的鉴定研究 , 以期探研出一种直接采用 D N A
对生物类中药进行鉴定的新方法 。
1 材料和方法
1
.
1 生药 : 为铁线莲属 7 种植物 (l , (表 ) 。 标
本存成都军区昆明总医院 , 实验材料取地上
部分 , 晒干备用 。
农 实验材料
编号 名 称 产地
l 山棉花 Cle从 a tis ‘hry soc ~ F
r
. 云南昆明
2 三叶五香血藤 C . fa s沦以确之ia Fr . 云南昆明
3 小九头狮子草 C . ra 。二以厉尽“ Fr . 云南昆明
4 红叶铁线莲 C . 侧饭局止ia C . H . W ri gh t 云南景洪
5 小木通 C . a~
n 成‘Fr . 云南景洪
6 小木通 C . a~
, di i Fr
. 云南昆明
7 红钉耙藤 C . 加翻“‘a “d‘ta D C . 云南昆明
8 铁线莲 C . 刀邵￡J 口 T hu n b . 云南昆明
1
.
2 试剂 : 引物 : 10 ~ m e r 引物购自中国科
学院 。 T a g 酶 ;购 自美国 P E 公司 。
1
.
3 PC R 仪 : 购 自美 国 PE 公 司 , 型号为
Pe r kin E lm e r C e t u s D N A T he r m a l C y
-
ele r 4 8 0
。
图 7 种铁线莲属生物的 件10 引物扩增谱
1
一山棉花 2 一三叶五香血藤 3 一小九头狮子
草 4一红叶铁线莲 5一小木通(景洪 )
6
一小木通 (昆明) 7 一红钉耙藤 8一铁线莲
1
.
4 方法 : D N A 提取 : 取 1 9 材料研碎 , 加入
Zom l提取缓冲液 (sm o l/ L U r e a , 0 . 4 m o l/ L
N a CI
,
0
.
0 5 m o l / L T r is
一
H C I
, pH 8
.
0 ,
0
.
0 2 m o l/ L E D T A
,
2 %S a r e o syl
, 5 %P he n o l)
于 60 ℃保温 3 o m in , 用等体积的氯仿提取后 ,
· A d d r e ss : Z ha n g R o n g
,
De p
a r tm e n t o f Ph a rm a e y
,
K u n m in g G e n e r a lH o s p ita l
,
C h e n g d u M ilit
a ry R e g io n
,
K u n m in g
.
6 8 6
-
上清液再用等体积的苯酚一氯仿一异戊醇 (25
: 2 4 : 1) 抽提 1 次 , 用无水 乙醇沉淀后将沉
淀的 D N A 离心分离 , 再用 70 %酒精洗两遍
后干燥 ,溶于适量 T E 中冻存 。
R A P D 反应 : 扩增总体积为 25 川 , 其 中
含 io m m o l/ L T r is 一C I(p H S . 3 ) , 2 . om m o l/ L ,
M g C 1
2 ,
d A T P
,
dC T P
,
d T T P
,
d G T P 各
0
.
lm m o l/ L
, 引 物 为 0 . 2仁m o l/ L , son g 核
D N A
,
1
.
5 单位 T ag 酶 。 整个 扩增 程序为
9 4 ℃ lm in , 3 6℃ Zm in , 7 2 oC Zm in , 经 4 5 个循
环 后 , 再 在 72 ℃延 伸 sm in 。 扩增 产 物在
1
.
4 %的琼脂糖中电泳 , 经 E B 染色 , 在紫外
灯下观察并照像 。
2 结果与讨论
对 40 个引物进行扩增实验 , 结果 5 个引
物扩增出谱条 , 如 件10 引物扩增 (图) 。 结果
表明种间有 明显差异而种内差异不明显 , 如
图中 5 、 6 号皆为小木通 , 但 6 号产昆明 , 5 号
产景洪 , 其扩增产物一致 。 本研究初步表明
R A PD 作为一种鉴定方法是合理 的 , 同时 ,
由于本研究采用干燥的材料 , 因此对干燥的
植物类中药的鉴定就更有实际应用价值 。
在本研究中发现 , T ag 酶用 1 单位 , 没有
用 1 . 5 单位好 ;循环由 30 增到 45 个后 , 扩增
效果较好 ;对于不同的扩增材料 , 扩增优化条
件也不相 同 , 而优化条件对成功的扩增极为
重要 。
参 考 文 献
1 江苏新医学院. 中药大辞典 . 上 、下册 . 上海 : 上海科学技
术出版社 , 1 98 6
2 W illia m s J G K
, e t a l
.
N u el A e id s R e s
.
1 99 0
,
1 8
:
36 5 3 1
3 L e e w o o n g Bi n
, e t a l
.
K o r e a n jo u r n al Pla n t T a x
, 19 9 3
,
2 3 (2 )
:
3 5
4 A da ms R P
, e t a l
.
T h e o re tie a l APP lie d G ene t
, 1 9 9 3
,
8 7
(l~ 2 )
:
2 2
(1 9 9 5
一 10 一2 7 收稿)
Id e n tifica tio n o f Se
v en S pe e i
es o f Cl em a ti
s (Cl em a tis L
.
)勿 R A PD A n a lysis
Z h a n g R o n g
,
Sh a o Ji
e n be n
,
T ia n X u e m in g
Id e n tifie a tio n o f s e v e n s p e e ie s o f C lema
tis L
.
(C
. ‘人犷, 3 。‘o ma F
r
. ,
C
.
a
~
n d ii F r
. ,
C
.
fa sc i
c
ul ifo lia F
r
. ,
C
·
ra
n u n c u lo ide
s F r
. ,
C
.
ru b汀blia C . H . W r ig ht , C . 加ri da T hu n b . a n d C . 厉即‘‘a u d a ta IX 二. )w a s s tu die d by
R A P D a n a lys is
.
R e s u lts sh o w e d tha t the d iffe r e n e e s o f R A PD b e tw e e n diffe r e n t s p e eie s w e r e s ig n ifiea n t
,
b u t
n o n sig n ifiea n t b e tw e e n s a m e sp e eie s o bta in e d fr o m d iffe r e n t lo e a litie s
.
一年生延胡索块茎的研究
安徽中医学院药学系(合肥 230 38) 胡 坷 , 梁益敏
摘 要 采集野生延胡索 Co ry da lis ya n hus 如 的种子 , 在苗圃中播种 , 栽培 , 发现其出苗率与种子
的大小及成熟度有关 。 对其 1 年生块茎的生长形态及内部结构进行观察 , 其虽为双子叶植物 , 但出
苗时仅 l 枚子叶 , 皮层有分泌组织 , 形成层发达 , 而木质部 、韧皮部均不发达 。
关锐词 延胡索种子 块茎 栽培 解剖
延胡索 co 勺d a lis 少a n h u s u o w · T · W a n g
e x 2
.
Y
.
Su e t C
.
Y
.
W
u 为多年生草本 , 无
毛 , 野生于丘陵坡地林下 , 也可栽培生长 。 其
地上茎高 5 ~ 2 5c m , 茎生叶 , 互生全裂 , 披针
, A d d r e ss : H u K e
,
De p
a r tm e n t o f Ph a rm a e y
,
A n h u i Co lle g e o f T ra d itio n a lC h in es e M
e diein e
,
H e fe i
《中草药) 29 9 6 年第 2 7 卷第 2 2 期 . 6 8 7 .