全 文 ：· 综述与专论 ·
红豆杉细胞培养生产紫杉醇研究进展
天津大学化工系 (3 0 0 0 7 2) 韩金玉 介 王传贵 那 平 元英进
摘 耍 红豆杉细胞培养是解决紫杉醇资源问题的有效途径之一 , 本文综述国内外近年来有关红
豆杉细胞培养生产紫杉醉的研究概况 。 分别就愈伤组织诱导 、继代培养 、悬浮培养等阶段的主要问
题以及提高紫杉醉产率的各种新方法进行了总结和分析 。
关橄词 紫杉醇 细胞培养 红豆杉
1 前言
紫杉醇 (t a x o l)是 7 0 年代由 W a n i 等〔, 〕
从短叶红豆杉 Ta x “ : bre vifo li a 树皮 中提取
出来的具有独特抗癌作用的天然产物 , 1 9 9 2 -
12 被美 国 FD A 批准用于治疗卵巢癌 , 目前
已在加拿大 、以色列 、荷兰 、英国 、挪威 、瑞士 、
瑞典等国获准上市 , 是一非常有发展前途的
抗癌新药 。我国将紫杉醇作为二类西药审批 ,
中国医学科学院药物研究所和海 口制药厂于
1 9 5
一
10 已获得新药证书 。
迄今为止 , 紫杉醇仅见于裸子植物红豆
杉科的红豆杉属 T “x u : L . 和澳洲红豆杉属
种 。 后者仅见于南半球 , 数量稀少 。 前者零星
分布在北半球 , 极少成林 , 且生长缓慢 。 紫杉
醇在该属植 物的树 皮 中含量 又极 低 , 约为
0
.
01 %一 0 . p 6 % 。 每提取 Ik g 紫杉醇 , 要砍
伐 10 0 0一 2 0 0 0 棵树以剥取足够的树皮 。按这
种提取方法来获取临床及基础研究所需的紫
杉醇 , 将给红豆杉属植物的长期存留及地 区
分布带来威胁 。因此 , 紫杉醇的原料保障就成
为该药能否长期供应的关键因素 。
目前 , 人们着手从以下几个方面进行研
究以解决紫杉醉的来源间题 : (l) 全合成 , (2)
半合成 , (3) 栽培法 , (4 )真菌生产 , (5 )植物组
织细胞培养法 . 这几种方法各有利弊 , 其中组
织细胞培养法由于具有以下优点而成为人们
所期望的商业化生产的优选方法 : ¹ 确保产
物无限 、连续 、均匀地生产 , 不易受病虫害 、季
节等因素的影响 。 º 可以在生物反应器中大
规模培养 , 并且通过控制培养条件诱导出大
量的紫杉醉 。 » 所得的产物从植物体内直接
提取 , 可以大大简化分离和纯化步骤 。¼除提
供紫杉醉外 , 还可以生产出紫杉醇半合成的
前体物以及其他有抗癌活性的 , 原植体内不
含有的化合物 。 目前 , 国内外在分化细胞株系
和培养条件方面作 了不少工作 , 摸索了外植
体 、光照 、培养基组成等因素对细胞培养及紫
杉醉生产的影响 。工艺条件已基本摸清 , 正研
究反应器的放大技术和新的技术生长点 , 可
望实现 由红豆杉细胞培养生产紫杉醇的突
破 。 美国的有关大公司 已完成 4t 的培养技
术 ,现正进行 20t 规模的工业放大研究 (与国
外学者交流信息 ) 。本文综述近年来有关红豆
杉细胞培养生产紫杉醇的研究进展 。
2 红豆杉愈伤组织的诱导
一般而言 , 植物组织培养可分为细胞培
养和器官培养两大类 。其中 , 细胞培养法因具
有相对快速的繁殖率 , 培养条件易于优化和
控制 , 产物分离较容易等优点而受到人们的
关注 。
用细胞培养法生产紫杉醇的一般步骤
为 : 诱导愈伤组织 ~ 继代培养 ~ 建立悬浮培
养~ 扩大培养 。 生产紫杉醇由于红豆杉属植
物本身所具有的特殊性质 , 如为木本 、裸子植
.
A d d r e s s
:
H a n jin yu , De p a r t m e n t o f C h e m is t r y E n g in e e r i n g
, T ia n ji n U n i v e r s i ty
,
T ia n jin
( 中草药 ) 19 9 6 年第 27 卷第 7 期 · 4 33 ·
物等 , 因此 , 诱导红豆杉植物的愈伤组织是比 等 , 在添加蔗糖及外源生长素后均可诱导外
较困难的 。不同种属的红豆杉或不同的器官 、 植体形成愈伤组织 。 其中 , 以 B S 、 S H 及 6 , 7 -
组织及生长部位 , 外植体内紫杉醇含量不等 , V 为佳 , 诱导率亦较高 。 当然 , 选择最优的愈
对应的诱导愈伤组织的培养基组成以及培养 伤培养基应针对不同的细胞株系来进行 。
条件均对愈伤组织的诱导产生不同程度的影 培养基中激素组成 、浓度或其组合对愈
响 。 伤组织的诱导起重要的作用 。 一般来说 , 培养
2
.
1 外植体条件的影响 : 由于细胞系的生长 基中含 1 . 0 一 2 . o m g /I J Z , 4 一D 或含有 2 , 4 一D
和紫杉醇生产受到多种 因素的影响 , 各外植 的激 素组合 , 对愈伤组织的诱导极 为有 利 。
体的诱导能力存在很大的差异 , 而且诱导出 Gi b s o n 〔? ,发现 了几种培养基能从短叶红豆杉
的细胞进一步培养及生产次生代谢物的能力 树皮中诱导出愈伤组织 。
不尽相同 。 培 养基中的碳源 一般 为蔗糖 , 浓 度是
首先 , 外植体的诱导能力随植物种属的 1 . 0 %一 3 . 0 % (w 八) 。 考虑到生物适应性问
不同而有所差异 。 S m ith 〔2〕、朱蔚华〔3 〕、W ick 一 题 , 多数愈伤组织的诱导是在 固体培 养基上
re m es in he 闭等均做了一定工作 。 其次 , 外植 进行 , 而 且通常使 用 的凝 固剂 是 0 . 6% 一
体的诱导能力与所选取的植物组 织密切相 1 . 0 %的琼脂 。 但 Ci no 等 〔9〕认为用液体培养
关 。迄今为止 , 选用的作为诱导红豆杉愈伤组 基进行愈伤组织的诱导 , 可以缩短从诱导 到
织的外植体有针叶 、幼茎 、 树皮 、形成层 、种子 悬浮培养的生产周期 。 用液体培养基诱导愈
及假种皮等 。 一般而言 , 以幼茎 、 形成层或树 伤组织的主要优点在于 : 在固体培养基上诱
皮诱导愈伤组织的效果较好 , 诱导率亦较高 , 导的愈伤组织在转入液体培养基时 , 由于 不
其他的外植体诱导能力较差或根本诱 一导不到 能适应液体的新环境 , 可能会出现细胞畸形
愈伤组织 。 F et t 一N et o 等〔5〕比较了东北红豆杉 或自溶现象 。因而 , 用固体培养基诱导出细胞
T
. ‘u sP id at a 的不 同组织 的诱导能 力 , 包括 后 ,还需要经过固体到液体的适应性培养 , 延
红 、绿假种皮 、种子 、幼茎及针叶 , 其中幼茎是 长了生产周期 。 使用液体诱导培养基则可直
最佳的外植体 。 而 G h ri s len 等川在研究短叶 接转入液体悬浮培养 , 无适应性的问题 。 但
红豆杉细胞培养时指出 , 树皮或形成层组织 是 , 从 Ci no 等川的实验结果看 , 经 3 周悬浮
最适于建立愈伤组织 。可见 , 不同种属有不同 培养后紫杉醇 的产量仅 为 0 . 01 一 。. 02 m g /
优选的组织作为外植体 。 还有一种观点认为 IJ , 可 见用液体基诱导愈伤组织用于紫杉醇
应该选 用紫杉 醇含量较 高的外植体 。 Ci b 一 生产的方案还有待进一步改进 。
so nt
7 〕诱导并培养短叶红豆杉的愈伤组织时 无论使用何种培养基诱导红豆杉为何种
发现 , 外植体中紫杉醇的含量对于愈伤组织 外 植体 , 其 它 最 佳 的诱 导 条件都 为 20 一
的诱导及以后的继代培养均无抑制作用 , 那 25 ‘c 、黑暗 、培养基灭菌前 p H 为 5 . 5 ~ 5 . 8 。
么 , 获得高产细胞株系的第一步工作便是筛 3 愈伤组织继代培养
选紫杉醇含量高的外植体 〔8〕作为诱导材料 , 由外植体诱导形成的愈伤组织开始 比较
如短叶红豆杉的树皮或形成层组织 , 都可以 紧密 , 只有经过较长时间的多次继代培养 , 愈
形成高产紫杉醇的细胞系 。 而当以幼茎为外 伤组织变得较疏松时 , 才能进行悬浮培养 。在
植体时 , 应选 择 T . m ed 敌 , 尤其是 T . m ed ia 继代培养过程中 , 细胞的生长情况与外植体
“
Hi ck
s i ”的幼茎 , 因为该树种幼茎 中紫杉醇 来源 、培养基及培养条件密切相关 。其中培养
的含量高于其他树种 。 基中生长调节素的添加一直是人们研究的热
2
.
2 培养基及培养条 件的影响 : 许多培养 点 。
基 , 如 M s 、 B S 、 S H 、 6 , 7 一v 、 H a r v e y 、M e e o w n 3 . 1 外植体的影响 : G ib s o n 〔, 〕的研究结果表
.
4 34
·
明 , 即使是从同一树种 (短叶红 豆杉 )的不同
个体的同一部位 (树皮 )所采集的外植体诱导
出的愈伤组织 , 无论在外部形态还是在生长
状况上均存在很大差异 。 可见外植体来源对
细胞生长的影响是很大的 。 F e t 一N et o 等 〔5〕用
东北红豆杉的各组织作为外植体诱导出愈伤
组织 , 发现幼茎所得细胞的生长情况最好 , 针
叶所得细胞的生长情况与幼茎相似 , 但生长
速率减慢期开始得较早 。 Gi b s o n 〔, 〕在研究短
叶红豆杉树皮诱导所得的细胞系的生长情况
与各激素组合 的关系时 , 发现激素对生长的
刺激作用 因细胞 系的不同而异 。 G ib so n 指
出‘, , , 细胞生长受细胞株系影响最大 , 其次才
是生长素类型和浓度 。
3
.
2 愈伤组织早期形成时间的影响 : 并非愈
伤组织形成越快越好 , 其早期生长时间对培
养将产生显著的影响 。 Gi b s o n 〔, 〕在研究短叶
红豆杉细胞时发现 , 较早形成 (2 周 内)的愈
伤组织在继代培养时 , 细胞并不增殖 , 组织发
生褐化以至坏死 。 而在诱导培养基上 4 周一
4 个月形成的愈伤组织 , 以 1 ~ 2 个月的间隔
进行继代培养时 , 愈伤组织可以持续生长 。其
中 , 以经 1一 3 个月才开始形成的愈伤组织的
继代培养存活率最高 。
3
.
3 培养基及培养条件的影响 : 对诱导红豆
杉愈伤组织而言 , 可利用多种培养基 。但对于
愈伤组织的培养 , 维持其正常生长来说 , 绝大
多数报道的均是 基本 的或改 良的 B S 培 养
基 , 少数适用的还有 S H 等 , 其它培养基对维
持愈伤组织的正常生长效果均不是很好 。
此外 , Fet t 一N e to 等〔5 〕研究了不同的基础
培养基对组织生长的影响 。结果表明 , 对于东
北红豆杉的幼茎所得 的细胞系 , 除 M S 培养
基抑 制细胞组织 的生长外 , S H 、 SH N 及 B S
培养基对生长的影响相似 。一般认为 , 培养基
中氮源的还原态和氧化态的相对含量对细胞
的生长影响较大 。 培 养基 中添加高含量 的
N H 4N O
: 可以 明显提 高培养细 胞的生长速
率 。 Ch r ie s t e n 〔‘〕曾指 出 , 在补充有一定浓度
N H汹0 3 的 B S 培 养基上培 养的细胞 , 其 生
《中草药》1 99 6 年第 2 7 卷第 7 期
长速率为不补充 N H 4N O 。 的 B S 的 2 一 3 倍 。
而 以 N H 才作为唯一氮源 , 却抑制组织 的生
长 , 如在含 N H才较多 (2 6 5 0 . o o m g / L )的 M s
培养基上培养的细胞就符合这一规律 。
植物细胞培养中生长调节剂的添加是一
个重要环节 。 一般而言 , 培养基中含有 1 . 0 一
2
.
om g / L 的 2 , 4 一D 或 sm g / L 左右的 N A A ,
或含有上述浓度的 2 , 4 一D 或 N A A 的激素组
合 , 对愈伤组织的正常生长是必需的 。
生长素 (2 , 4 一D 等 )和分裂素 (K T )的不
同比例 , 显著影响愈伤组织的生长 。对东北红
豆杉细胞生长的研究表明 , 高浓度的 K T 对
细胞生长不利而相对高浓度的 2 , 4 一D 对细
胞生长则有促进作用 。 所观察到的这两种激
素的交互作用非常明显 , 在一定程度上 , 2 , 4 -
D 能够克服 K T 对生长的不利影响 。
另外 , 赤霉素 (G A 3) 的添加对细胞的生
长亦能产生很大影响 。 Fet 卜N et o 等 〔‘。〕指出 ,
向 BS 中补充 0 . sm g / L 的 G A 3 时 , 可使东北
红豆杉的生长量提高近 1 倍左右 , 但更浓的
G A 3 则对生长基本不产生影响 。 更全面地研
究激素添加对细胞生长的影响 , 将是有效提
高细胞生长量的重要途径 。
红豆杉属细胞培养的生理碳源一般选用
蔗糖 〔川 , 此外 , 也可选用果糖 、葡萄糖 、麦芽
糖等 。 糖类的浓度对细胞生长的影响很大 。
在通常情况下 , 光照抑制愈伤组织的生
长 。 但不同的细胞系对光的敏感程度有很大
差异 。 大量文献报道 , 介于 20 一 25 ℃之 间的
温度条件适于红豆杉愈伤组织的培养 。 也有
报道 20 ℃下培养的愈伤组织有时比在 25 ℃
下培养的生长得快 。培养基在高压灭菌前 pH
一般调至 5 . 8 左右 。
3
.
4 组织褐化的影响 : 红豆杉属细胞在生长
过程中会分泌一些不利生长 的酚类物质 , 这
种酚类渗出物 的积累会导致组织褐化 , 细胞
死亡 。 这也是红豆杉细胞生长缓慢的主要原
因之一 。 即使通过频繁的继代也无法根除这
一现象 。 在培养基中添加一些还原剂或酚类
吸收剂等可以部分地解决这一问题 。 Fet t-
·
4 3 5
·
N et 。 等 〔5〕在 B S 中加入一种可使酚类 吸收的
物质一聚乙烯毗咯烷酮 (P V P ) , 在不降低组织
生产 的同时又有效地 吸收了酚类化合物 , 获
得了满意的结果 。
4 细胞的悬浮培养和紫杉醉的生产
已有许多文献报道成功地建立了红豆杉
属植物的悬浮培养细胞系 , 在培养过程中它
们均可 向培养基中不断分泌紫杉醇等次生代
谢物 。如 L an gs in g 等建立起一些短叶红豆杉
悬浮细胞系 , 同时获得能耐受 20 m g / L 紫杉
醇的培养物 。 此外 , 据 E d g in g t o n 〔‘, 〕报道 , 用
短叶红豆杉的树皮或形成层组织诱导的愈伤
组织在锥形瓶中进行悬浮培养时 , 能分泌紫
杉醇及其它一些化合物到培养基中 , 其产量
可达 1 . 0 一 3 . om g / L , 相 当于 2 0 9 干树皮的
含量 。 以下将逐项讨论悬浮细胞的生长及生
产紫杉醇的影响因素 :
4
.
1 外植体的影响 : 采用不同红豆杉属植物
的外植体诱导 出的细胞进行悬浮培养时 , 各
细胞系间生长及生产状况有所不同 。 前 已述
及 , 有人认为应采用紫杉醇 含量高的外植体
以获得高产的细胞系 。 主张外植体应该选用
针叶和分生组织 , 其中以仅有 1 个月的新生
针叶为最合适的材料 。另外 , 雌性配子体特别
适合于诱导愈伤组织 。值得一提的是 , 并非所
有含紫杉醇的植物组织诱导出的细胞都可以
生产出紫杉醇 。 G ibs o n 〔7〕的研究指出树皮适
合建立愈伤组织 。
4
.
2 培养基组成及培养条件的影响 : 一般用
于愈伤组织及继代培养的基础培养基亦可用
于悬浮培养 。 其中各组成成分对悬浮细胞生
长的影响与继代培养的情形相似 。 值得注意
的是 , 对东北红 豆杉的幼茎 所得的细胞系 ,
MS 培养基抑制愈伤组织生长的 同时 , 显著
地利于紫杉醇的合成 。 红 豆杉细胞的悬浮培
养一般仍以蔗糖为碳源 。 Fe t 一N et o 等〔‘, , 在
研究了东北红豆杉幼茎愈伤组织的悬浮培养
的营养摄取动力学后指 出 , 干生物量的积累
与糖的浓度密切相关 , 糖的补充可明显缩短
悬浮细胞生物量增加的时间 。此外还可看出 ,
.
4 3 6
·
当以葡萄糖的果糖为碳源时 , 前者的作用要
优于后者 。
植物生长调节剂对悬浮细胞的营养也有
影响 。C h r ie s te n 〔6 ,指出 , 不同浓度的 2 , 4 一D 和
N A A 对短叶红豆杉悬浮培养细胞生长的作
用不同 。 当有 2 , 4 一D 和 N A A 存在时 , K T 或
B A P 并不促进细胞的生长 。 Sa ito 〔“〕在研究
短叶红豆杉雌性配子体悬浮细胞的生长时发
现 , 只有在补 充以 sm g / L N A A 培养基上培
养时 , 生物量才能增长 。
多数培养基 (包括继代培养基 )都补充了
酪蛋白水解物 (C A ) , 可是 CA 在细胞培养中
的作用还有争议 。
与愈伤组织继代培养相似 , 黑暗无光有
利于细胞的生长 。 在有光 、无光两种条件下 ,
紫杉醉的分布存在着明显差异 , 如在光照条
件下培养的细胞生成的紫杉醇是在黑暗中的
2
.
8 倍 , 且胞外紫杉醇的分泌量也比黑暗 中
的明显提高 , 分别为 76 %和 56 % 。 至于培养
温度及 pH 值则基本同于继代培养的要求 :
温度范围 2 0 一 2 5 oC , p H 优选 5 . 8 。
4
.
3 气态组分的影响 : 氧气 、二氧化碳 、乙烯
等气态组分对悬浮细胞的生长和紫杉醇的生
产有显著的影响 。 已有文献报道 , 当向培养基
中补充二氧化碳气体时可以使细胞维持较高
的生长速率 。 S m it h 〔2〕的研究结果表明 , 对于
浆果红豆杉 T . ba “at a 的悬浮细胞 , 在培养
基中维持低浓度的二氧化碳并移走乙烯可以
促进紫杉醇 的生产 , 但同时必须提供充足 的
氧气以促进细胞的生长 。
5 提高细胞中紫杉醉含量的方法
紫杉醇的产率太低 , 致使工业化生产成
本十分 昂贵 , 这是采用细胞培养技术实现工
业化生产的最大障碍 。为了攻克这一难题 , 各
国学者提出了一些新技术 、新方法并取得了
很大进展 。
5
.
1 前体饲喂 : z a m ir 等 〔, 5〕用放射性同位素
标记的前体进行饲喂 , 结果表明 , 紫杉醇的三
环二菇骨架来自轻 甲基戊酸 , C l。位的乙酞基
来自乙酸 , C 1 3位酞基侧链中的 C oH 3CH C H -
(O H )CO O
一来 自 p he 。 向培养基中添加这些
前体物可望提高紫杉醇的产鱿 。
Fe t
一
N e to 等〔‘。〕在研 究中发现 , 向培养
基中补充 0 . lm m ol /I 矛 的 phe 时 , 在不影响愈
伤组织生长的同时使紫杉醇的产量翻番 。 他
们〔‘6〕还比较了不同浓度的 p he 、丝氨酸 、甘氨
酸等对东北红豆杉率伤组织曳长及紫杉醇产
量的影响 , 发现其中某些潜在的前体明显地
影响紫杉醇的产量 。此外 , 针对不同的组织来
源 , 各种前体物对提高紫杉醇产量的影响有
所不同 。 St ier le 〔‘’】在研究短叶红豆杉树皮产
生的愈伤组织时指出 , 异亮氨酸是最佳前体 ,
乙酸盐也可作为前体物质加入 。 但随后的研
究表明 , 从美 国西北 部太平洋沿岸采来的短
叶红豆杉和 8 个其他红豆杉植株的细胞不能
利用乙酸盐作前体 。
5
.
2 诱导子的使用 : 在植物细胞的培养中引
入诱导子一般可以提高次生物的产量 , 形成
更有利的产物分布 , 同时可促进 产物分泌到
培养基中。针对红豆杉属的细胞培养 , 适用的
诱导子 主要分为 以下两 种〔l8] : l) 生物诱 导
子 : 主要指以高压灭活的真菌 、细菌和酵母的
细胞壁萃取物 、滤液或抱子 中得到的物质 , 其
有效成分一般认为是葡聚糖 。 2 )非生物诱导
子 : 包括化学协通物质 (如重金属 、钒酸盐 、
铅 、水银等 )和一些原先来源于生物 , 但后来
由人工合成的化合物 (如阿魏酸 、苯 甲酸等 ) ,
总体而言 , 诱导子的作用随诱导子的种类及
植物种属的不同而异 。 诱导子的加入时间及
使用剂量也是一个影响因素 。大体说来 , 在细
胞生长的指数期间引入诱导子最为有利 。 它
不仅使次生物质定量地合成而且还影响产物
的分布 , 另一方面 , L e e 〔‘g 〕的研究表明 , 在低
浓度时 , 诱导子浓度改变可以显著影 响次生
物质的积累速率 , 但随着浓度的增加 , 这一影
响逐渐减少 , 且当诱导子的浓度过量时 , 将对
培养物产生毒副作用 。
5
.
3 产物的原位提取 (I S P R ) : 产物的原位
提取技术由于可以快速地从培养基中移走产
物 , 清除产物与细胞间的相互干扰 , 提高产量
而倍受青睐 。针对红豆杉属细胞培养 , 人们着
手从以下几方面进行研究 : 1) 在培养过程中
更换培养基 。 2) 两相培养技术〔的 , 即在培养基
中引入第二相 , 目的产物在原培养系统合成
后 , 向第二相富集 , 从而减轻了产物的反馈抑
制 , 不仅提高了产量 , 而且简化了后续处理 。
6 结束语
紫杉醇以其独特的抗癌机制而引人注
目 , 然而有限的资源和 日益增长的需求量 , 使
寻找生产紫杉醉的新方法成为期待解决的问
题 。随着研究的深入 , 我们深信采用细胞培养
技术大规模生产紫杉醇不久将成为现实 。
参 考 文 献
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《中草药 》1 9 9 6 年第 27 卷第 7 期 · 4 3 7 .