全 文 ： Ｇｕｉｈａｉａ Ｍａｙ ２０１６ꎬ ３６(５):５８９－５９４
ｈｔｔｐ: / / ｊｏｕｒｎａｌ.ｇｘｚｗ.ｇｘｉｂ.ｃｎ
ｈｔｔｐ: / / ｗｗｗ.ｇｕｉｈａｉａ－ｊｏｕｒｎａｌ.ｃｏｍ
ＤＯＩ: １０.１１９３１ / ｇｕｉｈａｉａ.ｇｘｚｗ２０１５０９０２４
段永波ꎬ赵丰兰ꎬ姚磊ꎬ等. 重组人 ＴＮＦＲ－Ｆｃ基因水稻种子特异表达载体构建 [Ｊ]. 广西植物ꎬ ２０１６ꎬ ３６(５):５８９－５９４
ＤＵＡＮ ＹＢꎬ ＺＨＡＯ ＦＬꎬ ＹＡＯ Ｌꎬｅｔ ａｌ. Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｉｃｅ ｓｅｅｄ￣ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｒｉｃｅ￣ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ ｃｏｄｏｎ￣ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ＴＮＦＲ￣Ｆｃ ｇｅｎｅ[ Ｊ].
Ｇｕｉｈａｉａꎬ ２０１６ꎬ ３６(５):５８９－５９４
重组人 ＴＮＦＲ－Ｆｃ基因水稻种子特异表达载体构建
段永波ꎬ 赵丰兰ꎬ 姚 磊ꎬ 滕井通ꎬ 盛 玮ꎬ 张爱民ꎬ 薛建平∗
( 淮北师范大学 生命科学学院 /资源植物生物学安徽省重点实验室ꎬ 安徽 淮北 ２３５０００ )
摘 要: 重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体－抗体融合蛋白(ＴＮＦＲ￣Ｆｃ)在治疗系统性自身免疫疾病中有很好的功
效ꎮ 目前 ＴＮＦＲ￣Ｆｃ主要通过动物细胞系生产ꎬ高昂的成本限制了其大规模应用ꎮ 使用水稻种子作为生物反应
器有望大幅度降低 ＴＮＦＲ￣Ｆｃ的生产成本ꎬ提供优质足量的目标产品ꎮ 为使 ＴＮＦＲ￣Ｆｃ 基因能够在水稻中高效
表达ꎬ该研究拟构建经水稻偏好密码优化的 ＴＮＦＲ￣Ｆｃ基因的种子特异表达载体ꎮ 通过对水稻和人全基因组密
码子使用偏好性进行比较分析并按照水稻最优密码对 ＴＮＦＲ￣Ｆｃ 氨基酸序列进行逐一优化ꎬ命名为 ＲｆＴＮＦＲ￣
Ｆｃꎬ通过全基因合成法制备该基因片段ꎻ同时采用 ＰＣＲ法扩增水稻种子特异表达启动子 Ｇｌｕ￣４ꎬ构建种子特异
表达启动子驱动的 ＲｆＴＮＦＲ￣Ｆｃ基因表达载体ꎮ 结果表明:水稻与人多数氨基酸中密码子使用偏好性较为一
致ꎬ但在 Ｌ、Ｓ、Ｐ、Ｒ这 ４种氨基酸的密码子使用偏好性差异较大ꎬ优化时对这些密码子进行逐一替换ꎬ优化后
３０.８％的氨基酸密码子发生了变化ꎻＰＣＲ 扩增获得种子特异启动子ꎬ并连接至 ｐＣＡＭＢＩＡ１３８１ 载体ꎬ同时将全
基因合成法制备的 ＲｆＴＮＦＲ￣Ｆｃ基因连入该载体ꎬＰＣＲ、双酶切验证及测序分析表明载体成功构建ꎮ 该研究构
建的 ＲｆＴＮＦＲ￣Ｆｃ基因种子特异表达载体ꎬ为在水稻种子中大规模生产 ＴＮＦＲ￣Ｆｃ奠定了基础ꎮ
关键词: 水稻ꎬ 重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体－抗体融合蛋白(ＴＮＦＲ￣Ｆｃ)ꎬ 偏好密码优化ꎬ 种子特异表达ꎬ 载
体构建
中图分类号: Ｑ９４３.２ꎬ Ｑ７８ꎬ Ｓ１８ 文献标识码: Ａ 文章编号: １０００￣３１４２(２０１６)０５￣０５８９￣０６
Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｉｃｅ ｓｅｅｄ￣ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｒｉｃｅ￣ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ ｃｏｄｏｎ￣ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ＴＮＦＲ￣Ｆｃ ｇｅｎｅ
ＤＵＡＮ Ｙｏｎｇ￣Ｂｏꎬ ＺＨＡＯ Ｆｅｎｇ￣Ｌａｎꎬ ＹＡＯ Ｌｅｉꎬ ＴＥＮＧ Ｊｉｎｇ￣Ｔｏｎｇꎬ
ＳＨＥＮＧ Ｗｅｉꎬ ＺＨＡＮＧ Ａｉ￣Ｍｉｎꎬ ＸＵＥ Ｊｉａｎ￣Ｐｉｎｇ∗
( Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ａｎｈｕｉ Ｐｒｏｖｉｎｃｅꎬ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓꎬ Ｈｕａｉｂｅｉ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｈｕａｉｂｅｉ ２３５０００ꎬ Ｃｈｉｎａ )
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ α ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｔｉｂｏｄｙ￣ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｏｒｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ Ｔｙｐｅ ＩＩ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ (ＴＮＦＲ￣Ｆｃ)
ｉｓ ａｎ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｍｅａｎ ｔｏ ｔｒｅａｔ ｔｈｅ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｄｉｓｅａｓｅｓ. Ｔｈｉｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｓ ｃｕｒｒｅｎｔｌｙ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｖｉａ ａｎｉｍａｌ ｃｅｌｌ
ｌｉｎｅｓ. Ｔｈｅ ｈｉｇｈ ｃｏｓｔ ｏｆ ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ ｂｒｉｎｇｓ ａｎ ｅｃｏｎｏｍｉｃ ｂｕｒｄｅｎ ｆｏｒ ｃｏｍｍｏｎ ｐａｔｉｅｎｔｓꎬ ｗｈｉｃｈ ｌａｒｇｅｌｙ ｌｉｍｉｔｓ ｔｈｅ
ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＴＮＦＲ￣Ｆｃ. Ｒｉｃｅ ｓｅｅｄ ｏｆｆｅｒｓ ａ ｇｏｏｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ. Ｔｏ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ
ｅｘｐｒｅｓｓ ＴＮＦＲ￣Ｆｃ ｉｎ ｒｉｃｅ ｓｅｅｄꎬ ｗｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｓｅｅｄ￣ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｏｆ ｒｉｃｅ￣ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ ｃｏｄｏｎ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ＴＮＦＲ￣
收稿日期: ２０１５￣０９￣２６ 修回日期: ２０１５￣１２￣２９
基金项目: 国家自然科学基金(３１５０１３６８ꎬ ８１５７３５１８)ꎻ安徽省自然科学基金(１４０８０８５ＭＣ５８ꎬ １６０８０８５ＭＣ５２)ꎻ安徽省教育厅省级高校自然科学基
金重点项目和重大项目(ＫＪ２０１４Ａ２２６ꎬ ＫＪ２０１５ＺＤ３５)[Ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｈｉｎａ (３１５０１３６８ꎬ ８１５７３５１８)ꎬ Ｎａｔｕｒａｌ
Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｈｕｉ Ｐｒｏｖｉｎｃｅꎬ Ｃｈｉｎａ (１４０８０８５ＭＣ５８ꎬ １６０８０８５ＭＣ５２)ꎻ Ｋｅｙ Ｐｒｏｊｅｃｔ ｏｆ Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｆ Ｃｏｌｌｅｇｅｓ ａｎｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｉｅｓ ｉｎ
Ａｎｈｕｉ Ｐｒｏｖｉｎｃｅꎬ Ｃｈｉｎａ (ＫＪ２０１４Ａ２２６ꎬ ＫＪ２０１５ＺＤ３５)]ꎮ
作者简介: 段永波(１９８１￣)ꎬ男ꎬ贵州贵阳人ꎬ博士ꎬ讲师ꎬ主要从事植物生物技术研究ꎬ(Ｅ￣ｍａｉｌ)ｙｂｏｄｕａｎ＠ １６３.ｃｏｍꎮ
∗通讯作者: 薛建平ꎬ博士ꎬ教授ꎬ主要从事药用植物生物技术研究ꎬ(Ｅ￣ｍａｉｌ)ｘｕｅｊｐ＠ １６３.ｃｏｍꎮ
Ｆｃ (ＲｆＴＮＦＲ￣Ｆｃ)ꎬ ｂｙ ａｎａｌｙｚｉｎｇ ｔｈｅ ｗｈｏｌｅ ｇｅｎｏｍｉｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｉｎ ｃｏｄｏｎ ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ａｎｄ ｒｅｐｌａｃｉｎｇ ｂａｓｅｓ ｗｉｔｈ ｒｉｃｅ￣
ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ ｃｏｄｏｎｓ. Ｒｉｃｅ ｓｅｅｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｍｏｔｅｒ Ｇｌｕ￣４ ｗａｓ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｖｉａ ＰＣＲ ａｎｄ ｌｉｇａｔｅｄ ｉｎｔｏ ｐＣＡＭＢＩＡ １３８１ꎬ ｆｏｌｌｏｗｅｄ ｂｙ
ｔｈｅ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｆｕｌｌ ｌｅｎｇｔｈ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＲｆＴＮＦＲ￣Ｆｃ. Ｔｈｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ｗａｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｂｙ ＰＣＲꎬ ｄｏｕｂｌｅ ｅｎｚｙｍｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｅ￣
ｑｕｅｎｃｉｎｇ. Ｔｈｅ ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ ｃｏｄｏｎｓ ｏｆ Ｌꎬ Ｓꎬ Ｐ ａｎｄ Ｒ ｄｉｆｆｅｒｅｄ ｂｅｔｗｅｅｎ ｒｉｃｅ ａｎｄ ｈｕｍａｎꎬ ｔｈｏｕｇｈ ｍｏｓｔ ｏｆ ｔｈｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ
ｓｈａｒｅｄ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ ｃｏｄｏｎｓ. Ｉｎ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ＲｆＴＮＦＲ￣Ｆｃꎬ ３０.８％ ｏｆ ｔｈｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｃｈａｎｇｅｄ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ
ｏｒｉｇｉｎａｌ ｖｅｒｓｉｏｎ. ＰＣＲꎬ ｄｏｕｂｌｅ ｅｎｚｙｍｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｔｈａｔ ｐＣＡＭＢＩＡ Ｇｌｕ ￣ＲｆＴＮＦＲ￣Ｆｃ ｗａｓ ｓｕｃｃｅｓｓ￣
ｆｕｌｌｙ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ. Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ ｌａｙｓ ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＴＮＦＲ￣Ｆｃ ｉｎ ｒｉｃｅ ｓｅｅｄꎬ ｆｕｒｔｈｅｒ ｆａｃｉｌｉｔａｔｉｎｇ ｉｔｓ ｃｏｍｍｅｒ￣
ｃｉａｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａꎬ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ α ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｔｉｂｏｄｙ￣ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｏｒｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ｔｙｐｅ ＩＩ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ
(ＴＮＦＲ￣Ｆｃ)ꎬ ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ ｃｏｄｏｎ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎꎬ ｓｅｅｄ￣ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎꎬ ｖｅｃｔｏｒ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ
人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体 －抗体融合蛋白
(ＴＮＦＲ￣Ｆｃ)由 ４６７ 个氨基酸组成ꎬ对系统性自身免
疫疾病ꎬ如类风湿关节炎、银屑病、强直性脊柱炎等
都有很好的治疗效果 (Ｒｏｔｈｅ ｅｔ ａｌꎬ１９９２ꎻＳｔüｂｇｅｎꎬ
２０１１)ꎮ 临床上极低剂量的 ＴＮＦＲ￣Ｆｃ 蛋白(推荐成
人使用剂量为每次注射 ２５ ｍｇ)即可发挥功能ꎮ 目
前 ＴＮＦＲ￣Ｆｃ商业化生产主要依靠中国仓鼠卵巢细
胞(ＣＨＯ)表达体系(Ｘｕ ｅｔ ａｌꎬ２０１１)ꎬ高昂的反应器
维持费用及难以迅速扩大的生产规模使得该药用蛋
白价格居高不下ꎬ急需降低 ＴＮＦＲ￣Ｆｃ 生产成本以满
足巨大的市场需求ꎮ 植物表达体系生产成本低、容
易规模化、产品质量高、安全性高(无动物病毒污
染)等优点(Ｈｏｒｎꎬ２０１２ꎻＳｔｏｇｅｒ ｅｔ ａｌꎬ２０１４)ꎬ具有很
好的应用前景ꎮ
在诸多植物表达体系中ꎬ水稻种子是生产药用
蛋白最具潜力的系统之一(Ｏｕ ｅｔ ａｌꎬ２０１４)ꎮ 水稻遗
传转化技术已较为成熟(Ｍｉｓｈｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌꎬ２００７ꎻＤｕａｎ
ｅｔ ａｌꎬ２０１２)ꎬ为药用蛋白生产的“工厂” (转基因植
株)的建立奠定了基础ꎮ 水稻种子已被用于特异表
达白细胞介素( Ｆｕｊｉｗａｒａ ｅｔ ａｌꎬ２０１０)、蜱螨过敏原
(Ｓｕｚｕｋｉ ｅｔ ａｌꎬ２０１１)和人溶酶体酸性 β￣葡萄糖脑苷
脂酶(Ｐａｔｔｉ ｅｔ ａｌꎬ２０１２)等多种外源重组蛋白ꎬ表达
量介于 ７.０~６０.０ ｍｇｇ￣１之间ꎮ 采用水稻种子特异
的强启动子 Ｇｔ１３ａ及其信号肽驱动人血清白蛋白基
因表达ꎬ目标蛋白表达量达到 ２.７５ ｍｇｇ￣１糙米ꎬ且
理化结构及生化特征与人血浆中提取的蛋白基本一
致(Ｈｅ ｅｔ ａｌꎬ２０１１)ꎮ 该体系能大幅度提高人碱性成
纤维细胞生长因子表达水平(Ａｎ ｅｔ ａｌꎬ２０１３)ꎮ 因
此ꎬ使用种子特异表达强启动子ꎬ使蛋白在特定时间
和空间内表达ꎬ减少不必要的能量和原料消耗ꎬ有利
于提高目标蛋白表达水平ꎮ 目前ꎬ尚未发现有关在
植物中表达 ＴＮＦＲ￣Ｆｃ 的报道ꎮ 本研究按照水稻遗
传密码使用偏好性对 ＴＮＦＲ￣Ｆｃ 基因进行设计和优
化ꎬ构建水稻谷蛋白启动子驱动的种子特异表达载
体ꎬ以期为发展水稻种子 ＴＮＦＲ￣Ｆｃ 表达系统及其大
规模生产奠定基础ꎮ
１ 材料与方法
１.１ 材料
供试的水稻材料日本晴种子为安徽省农业科学
院水稻研究所李浩博士惠赠ꎮ 植物表达载体
ｐＣＡＭＢＩＡ１３８１ 及大肠杆菌 ( Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ)菌株
ＤＨ５α为资源植物生物学安徽省重点实验室保存ꎮ
ＰＣＲ扩增试剂为生工生物工程(上海)股份有
限公司产品ꎻ限制性内切酶 ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄⅢ、Ｔ４ ＤＮＡ
连接酶均购自 Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ ( ＮＥＢ)公司ꎻ
ＤＮＡ凝胶回收试剂盒购自 ＡｘｙＧｅｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ 公
司ꎻｐＭＤ１８￣Ｔ ｖｅｃｔｏｒ购自 ＴａＫａＲａ生物工程(大连)有
限公司ꎻ卡那霉素和氨苄青霉素钠盐等购自生工生
物工程(上海)股份有限公司ꎮ 引物和基因合成以
及测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成ꎮ
１.２ 方法
１.２.１ 水稻与人遗传密码使用偏好性分析 水稻
(Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ)和人(Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ)的密码子信息从
密码子使用数据库 ｗｗｗ. ｋａｚｕｓａ. ｏｒ. ｊｐ / ｃｏｄｏｎ 获得ꎮ
水稻包括 ３４、１３２、２８３ 个密码子ꎬ编码 ９２１８８ ＣＤＳ
(ｃｏｄｉｎｇ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ)ꎻ而人类使用４０ ６６２ ５８２个
密码子ꎬ编码 ９３４８７ ＣＤＳꎮ 对水稻和人的编码各氨
基酸的同义密码子使用频率进行调查比较ꎬ使用频
率最高的密码子认定为偏好密码子ꎮ
１.２. ２ ＲｆＴＮＦＲ￣Ｆｃ 基因设计与合成 重组蛋白
ＴＮＦＲ￣Ｆｃ由人肿瘤坏死因子可溶性受体的细胞外配
体结合部分(ＴＮＦＲꎬ２３５ ＡＡ)与人类 ＩｇＧ１ Ｆｃ段(２３２
０９５ 广 西 植 物 ３６卷
ＡＡ)融合而成ꎮ 基于水稻密码子使用偏好性ꎬ根据
ＴＮＦＲ￣Ｆｃ氨基酸序列设计重组 ＴＮＦＲ￣Ｆｃ 基因(ＲｆＴ￣
ＮＦＲ￣Ｆｃ)ꎬ长度１ ４０７ ｂｐꎮ 同时在其 ５′端添加醇溶蛋
白信号肽序列(Ｏｓ０７ｇ０２０６４００)ꎬ人工合成后克隆至
ｐＵＣ５７载体ꎬ酶切位点为 ＢａｍＨＩ / ＮｈｅＩꎬ获得 ＢａｍＨＩ￣
ｓｐ￣ＳｐｅＩ￣ ＴＮＦＲ￣Ｆｃ￣ＮｈｅＩꎮ
１.２.３ 水稻种子特异表达启动子克隆 采用谷蛋白
ＧｌｕＢ４基因(ＡＫ１０７２３８)启动子特异引物( Ｐａｔｔｉ ｅｔ
ａｌꎬ２０１２)ꎬ以日本晴基因组 ＤＮＡ 为模板进行 ＰＣＲ
扩增ꎮ 引物序列为 ＧｌｕＢ４Ｆ￣ａａｇｃｔｔｃｇｇａａｔｔｃｔａｃａｇｇｇｔｔｃｃｔｔ
ｇｃｇｔｇａａｇａ (下 划 线 表 示 ＨｉｎｄＩＩＩ 酶 切 位 点 ) 和
ＧｌｕＢ４Ｒ￣ｇｇａｔｃｃｃｇｇｇａｔｃｃａｇｃｔａｔｔｔｇａｇｇａｔｇｔｔａｔｔｇｇ (下划线
表示 ＢａｍＨＩ酶切位点)ꎮ ＰＣＲ 扩增体系如下:５ μＬ
１０ × ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒꎬ４ μＬ ２５ ｍｍｏｌＬ￣１ ＭｇＣｌ２ꎬ４ μＬ ２.０
ｍｍｏｌＬ￣１ｄＮＴＰｓꎬ２ μＬ １０ μｍｏｌＬ￣１引物(上、下游
引物各 １ μＬ)ꎬ０.４ μＬ ５ ＵμＬ￣１ Ｔａｑ ＤＮＡ 聚合酶ꎬ
１００ ｎｇ ＤＮＡ 模板ꎬｄｄＨ２Ｏ至 ５０ μＬꎮ ＰＣＲ 扩增条件
为 ９４ ℃预变性 ５ ｍｉｎꎻ９４ ℃ ３０ ｓꎬ６０ ℃ ３０ ｓꎬ７２ ℃
９０ ｓ进行 ３０个循环ꎻ７２ ℃延伸 ７ ｍｉｎꎮ ＰＣＲ产物连
接至 ｐＭＤ１８￣Ｔ ｖｅｃｔｏｒꎬ挑取 ＰＣＲ 阳性克隆送生工生
物工程(上海)股份有限公司测序ꎮ
１.２.４ ＲｆＴＮＦＲ￣Ｆｃ种子特异表达载体构建 提取含
有 ＢａｍＨＩ￣ｓｐ￣ＳｐｅＩ￣ＴＮＦＲ￣Ｆｃ￣ＮｈｅＩ 片段的 ｐＵＣ５７ 质
粒进行 ＢａｍＨＩ / ＮｈｅＩ双酶切ꎬ回收１ ４８２ ｂｐ 片段ꎻ同
时采用 ＢａｍＨＩ / ＮｈｅＩ 对 ｐＣＡＭＢＩＡ１３９１ 质粒进行线
性化处理ꎮ 用 ＴａＫａＲａ Ｔ４ＤＮＡ连接酶将目标片段与
线性化载体进行连接重组ꎬ提取阳性菌落质粒进行
ＰＣＲ扩增和 ＢａｍＨＩ / ＮｈｅＩ 双酶切鉴定ꎬ鉴定正确的
克隆送生工生物工程(上海)股份有限公司测序ꎮ
２ 结果与分析
２.１ 水稻与人密码子使用偏好性比较
对水稻与人全基因组密码子使用偏好性分析表
明(图 １)ꎬ水稻 ＣＤＳｓ 中 ＧＣ 含量为 ５５.３％ꎬ比人使
用 ＧＣ的频率(５２.３％)高出 ３.０％ꎮ 这 ２个物种在密
码子 １、２、３位使用 ＧＣ的频率也有差异ꎮ 水稻在 １、
２、３位使用 ＧＣ频率为 ５８.２％、４６.０％和 ６１.６ꎬ分别比
人类高 ２.５％、３.５％和 ３.０％ꎮ
这 ２个物种全基因组范围内的密码子使用频率
统计情况见表 １ꎮ 对各氨基酸的简并密码进行分
析ꎬ各氨基酸使用频率最高的密码子作为偏好密码
子ꎮ 水稻偏好密码子:ＴＴＣ (Ｆ)、ＣＴＣ(Ｌ)、ＴＣＣ(Ｓ)、
图 １ 水稻与人全基因组编码区及各
密码子位 ＧＣ含量比较
Ｆｉｇ. １ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ＧＣ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｉｎ ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｏｎｓ
ａｎｄ ｖａｒｉｏｕｓ ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｒｉｃｅ ａｎｄ ｈｕｍａｎ
ＴＡＣ(Ｙ)、ＴＧＣ(Ｃ)、ＴＧＧ(Ｗ)、ＣＣＧ(Ｐ)、ＣＡＣ(Ｈ)、
ＣＡＧ(Ｑ)、ＣＧＣ(Ｒ)、ＡＴＣ( Ｉ)、ＡＴＧ(Ｍ)、ＡＣＣ(Ｔ)、
ＡＡＣ(Ｎ)、ＡＡＧ(Ｋ)、ＧＴＧ(Ｖ)、ＧＣＣ(Ａ)、ＧＡＣ(Ｄ)、
ＧＡＧ(Ｅ)、ＧＧＣ(Ｇ)、ＴＧＡ(ｓｔｏｐ)ꎻ人类偏好密码子:
ＴＴＣ (Ｆ)、ＣＴＧ(Ｌ)、ＡＧＣ( Ｓ)、ＴＡＣ(Ｙ)、ＴＧＣ(Ｃ)、
ＴＧＧ(Ｗ)、ＣＣＣ(Ｐ)、ＣＡＣ(Ｈ)、ＣＡＧ(Ｑ)、ＡＧＡ(Ｒ)、
ＡＴＣ( Ｉ)、ＡＴＧ(Ｍ)、ＡＣＣ(Ｔ)、ＡＡＣ(Ｎ)、ＡＡＧ(Ｋ)、
ＧＴＧ(Ｖ)、ＧＣＣ(Ａ)、ＧＡＣ(Ｄ)、ＧＡＧ(Ｅ)、ＧＧＣ(Ｇ)、
ＴＧＡ(ｓｔｏｐ)ꎮ 分析表明ꎬ水稻及人类编码 Ｆ、Ｙ、Ｃ、
Ｗ、Ｈ、Ｑ、Ｉ、Ｍ、Ｔ、Ｎ、Ｋ、Ｖ、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ及终止密码的偏
好密码子相同ꎮ Ｌ 在水稻的偏好密码为 ＣＴＧ(使用
频率 ２５.８‰)ꎬ而人类偏好密码为 ＣＴＣ(３９.６‰)ꎬ比
水稻(２１.０‰)中高出 １８.６‰ꎻＳ 在水稻的偏好密码
为 ＴＣＣ(使用频率 １６.３‰)而人类偏好密码为 ＡＧＣ
(１９.５‰)ꎻＰ 在水稻的偏好密码为 ＣＣＧ(使用频率
１８.０‰)ꎬ该密码子在人类中使用频率仅为 ６.９‰ꎬ而
人类偏好密码为 ＣＣＣ(１９.８‰)ꎻＲ 在水稻的偏好密
码为 ＣＧＣ(使用频率 １６.１‰)ꎬ而人类偏好密码为
ＡＧＡ(１２.２‰)ꎮ 如直接以人源的原始核苷酸序列在
水稻中进行基因表达ꎬ可能导致表达量极低ꎮ 而因
此有必要按照水稻密码子偏好性对 ＴＮＦＲ￣Ｆｃ 进行
逐一优化ꎬ以提高其在水稻中的表达水平ꎮ
２.２ ＲｆＴＮＦＲ￣Ｆｃ设计与合成
ＴＮＦＲ￣Ｆｃ氨基酸序列包括 ２３５ ａａ 的 ＴＮＦＲ 和
２３２ ａａ的 Ｉｇ ｇａｍｍａ￣１ ｃｈａｉｎ Ｃ 片段ꎬ采用水稻偏好密
码子对整个氨基酸序列进行逐一编码ꎬ获得１ ４０７
ｂｐ长的基因片段 ＲｆＴＮＦＲ￣Ｆｃ(图 ２)ꎮ 共有 １４４个氨
基酸的密码子发生改变ꎬ占全氨基酸序列的 ３０.８％ꎮ
１９５５期 段永波等: 重组人 ＴＮＦＲ－Ｆｃ基因水稻种子特异表达载体构建
表 １ 水稻与人全基因组各密码子使用频率比较
Ｔａｂｌｅ １ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｖａｒｉｏｕｓ ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｏｎｓ ｉｎ ｒｉｃｅ ａｎｄ ｈｕｍａｎ
密码子
Ｃｏｄｏｎ
氨基酸
Ａｍｉｎｏ
ａｃｉｄ
水稻 Ｒｉｃｅ
密码子
数目
Ｃｏｄｏｎ
Ｎｏ.
使用频率
Ｕｓｅ
ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ
(‰)
人 Ｈｕｍａｎ
密码子
数目
Ｃｏｄｏｎ
Ｎｏ.
使用频率
Ｕｓｅ
ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ
(‰)
密码子
Ｃｏｄｏｎ
氨基酸
Ａｍｉｎｏ
ａｃｉｄ
水稻 Ｒｉｃｅ
密码子
数目
Ｃｏｄｏｎ
Ｎｏ.
使用频率
Ｕｓｅ
ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ
(‰)
人 Ｈｕｍａｎ
密码子
数目
Ｃｏｄｏｎ
Ｎｏ.
使用频率
Ｕｓｅ
ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ
(‰)
ＴＴＴ Ｆ ４４６０６３ １３.１ ７１４２９８ １７.６ ＡＧＧ ５４４５１５ １６.０ ４８６４６３ １２.０
ＴＴＣ ７６３３８６ ２２.４ ８２４６９２ ２０.３ ＡＴＴ Ｉ ４８３９４１ １４.２ ６５０４７３ １６.０
ＴＴＡ Ｌ ２０９９１１ ６.１ ３１１８８１ ７.７ ＡＴＣ ６６２２０７ １９.４ ８４６４６６ ２０.８
ＴＴＧ ５００９１３ １４.７ ５２５６８８ １２.９ ＡＴＡ ３０００８５ ８.８ ３０４５６５ ７.５
ＣＴＴ ５１７９１９ １５.２ ５３６５１５ １３.２ ＡＴＧ Ｍ ８１２４３２ ２３.８ ８９６００５ ２２.０
ＣＴＣ ８８０９５９ ２５.８ ７９６６３８ １９.６ ＡＣＴ Ｔ ３６３４５１ １０.６ ５３３６０９ １３.１
ＣＴＡ ２６３８７１ ７.７ ２９０７５１ ７.２ ＡＣＣ ５０８１５６ １４.９ ７６８１４７ １８.９
ＣＴＧ ７１６５２５ ２１.０ １６１１８０１ ３９.６ ＡＣＡ ３９４８０３ １１.６ ６１４５２３ １５.１
ＴＣＴ Ｓ ４３３６８４ １２.７ ６１８７１１ １５.２ ＡＣＧ ３８８０３６ １１.４ ２４６１０５ ６.１
ＴＣＣ ５５７２５８ １６.３ ７１８８９２ １７.７ ＡＡＴ Ｎ ５１５７６１ １５.１ ６８９７０１ １７.０
ＴＣＡ ４２４４２６ １２.４ ４９６４４８ １２.２ ＡＡＣ ６３３０１７ １８.５ ７７６６０３ １９.１
ＴＣＧ ４２０８２５ １２.３ １７９４１９ ４.４ ＡＡＡ Ｋ ５４４４７６ １６.０ ９９３６２１ ２４.４
ＡＧＴ ３００８７９ ８.８ ４９３４２９ １２.１ ＡＡＧ １１０１３４２ ３２.３ １２９５５６８ ３１.９
ＡＧＣ ５４５５２９ １６.０ ７９１３８３ １９.５ ＧＴＴ Ｖ ５２９５０９ １５.５ ４４８６０７ １１.０
ＴＡＴ Ｙ ３３９６３８ １０.０ ４９５６９９ １２.２ ＧＴＣ ６８５９７１ ２０.１ ５８８１３８ １４.５
ＴＡＣ ５１７０４２ １５.１ ６２２４０７ １５.３ ＧＴＡ ２３１７６１ ６.８ ２８７７１２ ７.１
ＴＧＴ Ｃ ２１１６０９ ６.２ ４３０３１１ １０.６ ＧＴＧ ８２８６８１ ２４.３ １１４３５３４ ２８.１
ＴＧＣ ４２２８５１ １２.４ ５１３０２８ １２.６ ＧＣＴ Ａ ６６７８５４ １９.６ ７５００９６ １８.４
ＴＧＧ Ｗ ４７２５４３ １３.８ ５３５５９５ １３.２ ＧＣＣ １０５０７２３ ３０.８ １１２７６７９ ２７.７
ＣＣＴ Ｐ ４６３４５９ １３.６ ７１３２３３ １７.５ ＧＣＡ ５９１２６７ １７.３ ６４３４７１ １５.８
ＣＣＣ ４１１８４８ １２.１ ８０４６２０ １９.８ ＧＣＧ ９０８６３４ ２６.６ ２９９４９５ ７.４
ＣＣＡ ４８６２８３ １４.２ ６８８０３８ １６.９ ＧＡＴ Ｄ ８６３９８３ ２５.３ ８８５４２９ ２１.８
ＣＣＧ ６１３１５９ １８.０ ２８１５７０ ６.９ ＧＡＣ ９５９４９８ ２８.１ １０２０５９５ ２５.１
ＣＡＴ Ｈ ３８５１７４ １１.３ ４４１７１１ １０.９ ＧＡＡ Ｅ ７３８８９１ ２１.６ １１７７６３２ ２９.０
ＣＡＣ ４７０９６０ １３.８ ６１３７１３ １５.１ ＧＡＧ １３１５８２６ ３８.６ １６０９９７５ ３９.６
ＣＡＡ Ｑ ４６０２３４ １３.５ ５０１９１１ １２.３ ＧＧＴ Ｇ ５０５６０９ １４.８ ４３７１２６ １０.８
ＣＡＧ ７０９４６９ ２０.８ １３９１９７３ ３４.２ ＧＧＣ １００５７０１ ２９.５ ９０３５６５ ２２.２
ＣＧＴ Ｒ ２４４８２１ ７.２ １８４６０９ ４.５ ＧＧＡ ５４２２６４ １５.９ ６６９８７３ １６.５
ＣＧＣ ５５０５７５ １６.１ ４２３５１６ １０.４ ＧＧＧ ５８３３５７ １７.１ ６６９７６８ １６.５
ＣＧＡ ２１９６６２ ６.４ ２５０７６０ ６.２ ＴＡＡ ＳＴＯＰ ２２３６０ ０.７ ４０２８５ １.０
ＣＧＧ ４５８６０２ １３.４ ４６４４８５ １１.４ ＴＡＧ ２８５０８ ０.８ ３２１０９ ０.８
ＡＧＡ ３５８２２６ １０.５ ４９４６８２ １２.２ ＴＧＡ ４１３６１ １.２ ６３２３７ １.６
注: 使用频率指每 １ ０００碱基对中该密码子出现的频率ꎬ下划线黑体表示最优密码子ꎮ
Ｎｏｔｅ: Ｕｓｅ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｉｓ ｄｅｆｉｎｅｄ ａｓ ｔｈｅ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｏｄｏｎｓ ｉｎ ｅｖｅｒｙ １ ０００ ｂａｓｅ ｐａｉｒｓꎬ ａｎｄ ｔｈｅ ｕｎｄｅｒｌｉｎｅｄ ｂｏｌｄ ｄａｔａ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ ｃｏｄｏｎｓ.
２９５ 广 西 植 物 ３６卷
图 ２ ＲｆＴＮＦＲ￣Ｆｃ基因序列 小写字母表示醇溶蛋白信号肽序列ꎻ 下划线部分表示酶切位点ꎮ
Ｆｉｇ. ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＲｆＴＮＦＲ￣Ｆｃ Ｌｏｗｅｒｃａｓｅ ｌｅｔｔｅｒｓ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ
ｏｆ ｐｒｏｌａｍｉｎꎬ ａｎｄ ｔｈｅ ｕｎｄｅｒｌｉｎｅｄ ｏｎｅｓ ａｒｅ ｔｈｅ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｓｉｔｅｓ.
在 ＲｆＴＮＦＲ￣Ｆｃ ５′端前加上醇溶蛋白信号肽序列和相
应酶切位点ꎬ获 １ ４８２ ｂｐ 片段ꎮ 全基因人工合成后
导入克隆载体 ｐＴＣ５７ꎬ获得 ｐＵＣ５７￣ＲｆＴＮＦＲ￣Ｆｃꎮ
２.３ 种子特异启动子 ＧｌｕＢ￣４克隆
以 ＧｌｕＢ￣４特异引物进行 ＰＣＲ 扩增ꎬ获得１ ４４７
ｂｐ片段(图 ３:ａ)ꎮ 回收该片段进行 ＨｉｎｄＩＩＩ / ＢａｍＨＩ
双酶切ꎬ将酶切产物与线性化处理的 ｐＣＡＭＢＩＡ１３８１
载体进行重组ꎮ 提取阳性菌落质粒进行酶切验证ꎬ
获得约１ ５００ ｂｐ特异条带(图 ３:ｂ)ꎬ说明 ＧｌｕＢ￣４启
动子片段成功连入表达载体ꎬ获得种子特异表达载
体 ｐＣＡＭＢＩＡ￣Ｇｌｕꎮ
２.４ ＲｆＴＮＦＲ￣Ｆｃ种子特异表达载体构建与验证
用 ＢａｍＨＩ / ＮｈｅＩ同时双酶切处理 ｐＵＣ５７￣ ＲｆＴＮ￣
ＦＲ￣Ｆｃ和载体 ｐＣＡＭＢＩＡ１３８１ꎬ分别回收小片段和大
片段进行重组(用 ＲｆＴＮＦＲ￣Ｆｃ 替换 Ｇｕｓ)ꎮ 对重组
质粒进行 ＢａｍＨＩ / ＮｈｅＩ 双酶切验证表明ꎬＲｆＴＮＦＲ￣Ｆｃ
已成功连接至 ｐＣＡＭＢＩＡ Ｇｌｕ 载体 (图 ４)ꎬ获得
ｐＣＡＭＢＩＡ Ｇｌｕ ￣ＲｆＴＮＦＲ￣Ｆｃꎮ 测序结果验证表明种
子特异启动子驱动的水稻偏好密码子优化的 ＴＮＦＲ￣
Ｆｃ植物表达载体 ｐＣＡＭＢＩＡ Ｇｌｕ ￣ＲｆＴＮＦＲ￣Ｆｃ 已成功
构建ꎮ
３ 讨论与结论
采用异源表达方式生产药用重组蛋白已成为药
物生产从化学合成到生物合成转变的必要途径ꎬ对
于免疫自缺陷类疾病更是如此ꎮ 在异源表达过程
中ꎬ宿主、分泌途径、启动子特性和密码子使用偏好
性等因素都可能导致目标蛋白表达水平降低(蔡海
莺等ꎬ２０１３)ꎮ 相关研究中必须考虑上述因素ꎬ进而
提高目标蛋白表达量ꎮ 目前有关基因密码子优化的
研究多集中在抗病虫害基因工程领域ꎬ如将苏云金
芽孢杆菌毒蛋白基因 Ｃｒｙ１ 进行作物偏好密码子优
化(周宗梁等ꎬ２０１２ꎻＳｏｎｇ ｅｔ ａｌꎬ２０１４)ꎬ以提高植物
中的表达水平ꎮ 此类研究通常将微生物来源的基因
优化后在高等生物中表达ꎬ常需根据密码子偏好性
３９５５期 段永波等: 重组人 ＴＮＦＲ－Ｆｃ基因水稻种子特异表达载体构建
图 ３ ＧｌｕＢ￣４启动子克隆与表达载体 ｐＣＡＭＢＩＡ １３８１
构建 ａ. ＧｌｕＢ￣４启动子 ＰＣＲ扩增结果ꎻ ｂ. ｐＣＡＭＢＩＡ￣Ｇｌｕ载体
双酶切检测结果ꎻ Ｍ. 标准分子量 ＤＬ２０００ꎻ １. 产物ꎮ
Ｆｉｇ. ３ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ＧｌｕＢ￣４ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ａｎｄ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｉｎｔｏ ｅｘ￣
ｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｐＣＡＭＢＩＡ １３８１ ａ. ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔ ｏｆ ＧｌｕＢ￣４
ｐｒｏｍｏｔｅｒꎻ ｂ. Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐＣＡＭＢＩＡ￣Ｇｌｕ ｂｙ ｄｏｕｂｌｅ ｅｎｚｙｍｅ ｄｉｇｅｓ￣
ｔｉｏｎꎻ Ｍ. ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ ＤＬ２ ０００ꎻ １. Ｐｒｏｄｕｃｔ.
图 ４ ｐＣＡＭＢＩＡ Ｇｌｕ ￣ＲｆＴＮＦＲ￣Ｆｃ酶切验证 Ｍ. λ Ｈｉｎｄ
Ⅲꎻ １ꎬ ２. 不同重组子克隆ꎮ
Ｆｉｇ. ４ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐＣＡＭＢＩＡ Ｇｌｕ ￣ＲｆＴＮＦＲ￣Ｆｃ ｖｉａ
ｄｏｕｂｌｅ ｅｎｚｙｍｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ. Ｍ. λ Ｈｉｎｄ Ⅲꎻ １ꎬ ２. Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ ｄｉｆ￣
ｆｅｒｅｎｔ ｃｌｏｎｅｓ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｓ.
提高 Ｇ＋Ｃ含量ꎬ消除 ａｔｔｔａ(Ｎｉｃｏｌａｉ ｅｔ ａｌꎬ２０００)、Ａ＋Ｔ
富含区(Ｇｏｏｄａｌｌ ＆ Ｆｉｌｉｐｏｗｉｃｚꎬ１９８９)及 ｐｏｌｙＡ(Ｄｅａｎ
ｅｔ ａｌꎬ１９８６)等易导致表达量低的因素ꎮ
通过对水稻与人全基因组密码子使用偏好性分
析ꎬ发现水稻 ＣＤＳｓ 中 ＧＣ 含量为 ５５.３％ꎬ而人使用
ＧＣ的频率为 ５２.３％ꎻ２ 个物种多数氨基酸密码子使
用情况较为一致ꎬ但 Ｌ、Ｓ、Ｐ、Ｒ这 ４ 种氨基酸差异极
大ꎮ 推测高等生物间异源表达时基因优化的关键不
在于消除 Ａ＋Ｔ造成的序列不稳定ꎬ极可能是少数氨
基酸差异密码子的优化ꎮ 本研究以人Ⅱ型肿瘤坏死
因子受体￣抗体融合蛋白(ＴＮＦＲ￣Ｆｃ)为对象ꎬ选择水
稻种子特异表达系统ꎬ按照水稻密码子使用偏好进
行优化ꎬ构建植物表达载体ꎮ ＰＣＲ 法获得种子特异
启动子并克隆至植物表达载体 ｐＣＡＭＢＩＡ１３８１ꎮ 全
基因组范围分析水稻与人密码子使用偏好性并进行
优化ꎬ全基因合成时在 ＲｆＴＮＦＲ￣Ｆｃ ５′端加入醇溶蛋
白信号肽序列指导目标蛋白的分泌ꎮ 将人工合成的
ＲｆＴＮＦＲ￣Ｆｃ连入 ｐＣＡＭＢＩＡ￣Ｇｌｕꎬ酶切及测序验证表
达载体成功构建ꎬ获得水稻种子特异表达载体
ｐＣＡＭＢＩＡ￣Ｇｌｕ￣ ＲｆＴＮＦＲ￣Ｆｃꎮ 本研究为以水稻种子
为“工厂”生产 ＴＮＦＲ￣Ｆｃ 及其理化结构和生物活性
评价奠定了基础ꎮ
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４９５ 广 西 植 物 ３６卷