全 文 ：农业生物技术科学
中国农学通报 第23卷 第 9期 2007年 9月
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所谓单倍体，指的是具有配子染色体组成的孢子
体。在品种间杂交育种程序中，通过杂交一代大小孢子
培养得到单倍体植株后，经染色体加倍立即成为纯合
二倍体，从杂交获得不分离的杂种后代单株只需要2
个世代，和常规育种相比，显著缩短了育种年限。另外，
在单倍体细胞中只有1个染色体组，表现型和基因型
一致，一旦发生突变，无论是显性还是隐性，在当代就
可以表现出来，因此单倍体是体细胞遗传研究和突变
育种的理想材料[1]。
1葫芦科植物单倍体离体诱导研究概况
葫芦科（ Cucurbitaceae）植物在中国分布约有130
多个种，其中许多瓜类蔬菜，如西瓜、甜瓜、黄瓜和南瓜
等，具有很高的经济价值，在品种改良上有巨大潜
力[2]，但由于葫芦科植物的常规遗传育种方法育种周
期长、难度大和遗传性状不稳定，因此，在葫芦科植物
中开展以离体培养为基础的生物技术育种研究显得尤
为重要[3]。
葫芦科作物单倍体诱导有离体雄核发育和雌核发
育两种途径。总的来讲，瓜类蔬菜作物通过离体雄核发
育途径生产单倍体难度较大，只有西瓜的花药培养较
为成功[4]。薛光荣等于1981年利用琼酥西瓜品种，通
过培养单核靠边期的花药在国际上首次获得了西瓜单
倍体植株，并从其加倍后代中直接选育出了优良的新
品种[5]。1988年他们又在周至红这一品种上获得了成
葫芦科植物单倍体离体诱导研究进展
王丽莉,秦智伟
（ 东北农业大学园艺学院，哈尔滨 150030）
摘 要:重点对葫芦科植物离体诱导单倍体的研究进行综述,包括花药培养、离体雌核培养、辐射花粉诱
导单倍体培养等在育种中的应用,以及供体基因型、培养基、预处理方式、胚囊发育时期等因素对离体诱
导再生频率的影响。关于离体培养发育机制的生理生化研究主要集中在离体雌核发育的形态及细胞学
过程以及培养早期生理、生化的变化研究。同时总结了葫芦科植物DH育种研究进展,指出葫芦科植物
离体诱导单倍体研究中存在的问题并提出思路和建议。
关键词:葫芦科;单倍体;离体诱导
中图分类号:S603.6;S642.2 文献标识码:A
ProgressinStudiesoninvitroInducementofHaploidsinCucurbitaceaeVegetableCrops
WangLili,QinZhiwei
(ColegeofHorticulture,NortheastAgricultureUniversity,Harbin150030)
Abstract:Thepapersummarizesstudiesofinvitroinducementofhaploidsincucurbitaceae,including
antherculture,invitrogynogenesiscultureandinductionofhaploidobtainedbyiradiatedpolen.The
factorsafectinginvitroinducementsuchasmaterialgenetype,medium,pretreatment,megaspores
developmentstageandothershadsignificantefectsontheembryoidsinductivities.Themovementof
histological,earlyphysiologicalandbiochemicalindexesofgrowthmechanism werestudied.The
developmentofDHbreedingweresummarized.Theproblemsofstudiesinthisfieldarediscussedand
proposedmethodsofstudiesaresuggested.
Keywords:Cucurbitaceae,Haploid,Invitroinducement
基金项目：国家863计划项目“ 番茄黄瓜商品性状与抗病多基因聚合技术研究”（ 2006AA10Z1B9）。
第一作者简介：王丽莉，女，1980年出生，硕士，研究方向：蔬菜分子遗传育种。E-mail：wanglili_0424@126.com，Tel：13945094559。
通讯作者:秦智伟，男，1957年出生，农学博士，教授，博士生导师，主要从事蔬菜作物遗传育种与生物技术研究。通信地址：150030哈尔滨市香坊区
木材街59号东北农业大学。E-mail：qzw303@126.com，Tel：0451-55190058。
收稿日期:2007-07-13，修回日期：2007-07-26。
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功[6]。与此同时，研究者也对雌核发育途径进行尝试和
探索。目前，葫芦科未授粉子房或胚珠培养已获单倍体
植株的物种有以下几种：南瓜属植物的未授粉子房或
胚珠培养（ Chambonnetetal，1985；DumasdeVaulxet
al，1986；陈学军等，2000；谢冰等，2006）[7~10]、南瓜变种
的未授粉子房培养（ Gémesnéetal，1997）[11]、黄瓜的
未授粉子房培养（ Gémesnéetal，1997，2002；杜胜
利，2001）[12~14]以及甜瓜未授粉子房培养（ Gémesnéet
al，1997[12]；Ficcadentietal，1999）[15]等。辐射花粉诱导雌
核发育获得单倍体技术也已培育出西瓜（ 薛光荣等，
1983，1988；袁万良等，1995；魏英，1999）[5,6,16,17]、黄瓜
（ TruongAndre，1988）[18]和甜瓜（ Sautonetal，1987）[19]
等多种葫芦科植物单倍体植株，这对于葫芦科植物的
快速繁殖、种质资源的保存以及优良性状的培育等都
具有十分重要的理论意义和应用价值。
2影响葫芦科单倍体离体诱导的因素
影响单倍体离体诱导的因素很多，涉及供体植株
的基因型、培养基、外植体预处理方式、外植体发育时
期、培养条件等方面，并且这些因素之间还存在着一定
的相互作用。
2.1基因型
国内外许多学者研究发现，基因型是影响大小孢
子离体培养反应的重要因子之一。Ficcadenti等对甜瓜
进行研究发现不同的正反交组合对单倍体的诱导有显
著影响[20]，但也有相反结论，Faris等用 8种不同基因
型的黄瓜以及Caglar等对27种不同的黄瓜母本进行
试验发现，相同诱导条件下单倍体发生频率同基因型
无关[21,22]。其具体原因还有待进一步研究。
2.2预处理
为了提高培养效率，通常对实验材料进行预处理。
包括低温、高温等预处理或预培养方式，其目的是从生
理生化上改变细胞的生理状态、改变其分裂方式和发
育途径。Metwaly等对南瓜子房培养过程中4℃低温
预处理效果进行了研究，发现植株再生频率在不进行
低温处理时最好 [23]。但是认为甜瓜离体雌核培养在
4℃下处理36h效果较好。Gémesné等对黄瓜离体
雌核发育热激处理进行了研究，结果表明在诱导培养
时 35℃热激处理 2~4d获得的胚状体诱导频率
（ 18.4%）和植株再生率最高（ 7.1%）[13]。陈小鹏等提出
35℃处理是黄瓜未授粉子房胚状体诱导的最佳温度，
这一结果与Gémesné等的研究结果相同[24]。
2.3培养基
2.3.1基本培养基 基本培养基对大小孢子培养的成
败影响很大。在黄瓜花药培养上，一般使用B5作为基
本培养基，黄瓜未授粉子房的胚状体诱导试验中使用
CBM作为基本培养基。西瓜、甜瓜和南瓜的花药培养
则使用MS为基本培养基[17]，均已成功获得单倍体植
株。陈学军等、谢冰等对西葫芦未受精胚珠进行离体培
养结果表明培养基对胚状体诱导频率影响显著，其中
诱导频率高的培养基，有较大的利用价值[9,10]。
2.3.2 外源激素 培养基中的激素成分对于诱导单倍
体细胞的增殖和发育起着重要作用。Ashok等通过花
药培养方法获得了黄瓜单倍体植株，其中对生长因子
的研究结果表明，生长素中2,4-D比其它生长素效果
更佳，最佳浓度为 2.0mg/L；细胞分裂素 BAP优于
KN、TDZ，同时ABA可促进子叶型胚的正常生长并发
育成完整植株，对细胞胚性的保持具有较好的作用[25]。
陈小鹏等对黄瓜未授粉子房的胚状体诱导试验得出
TDZ浓度为 0.06mg/L、0.08mg/L时胚状体诱导率
（ 66.7%，64.9%）都极显著高于其它浓度处理，并且两
者没有显著差异[24]。陈学军等、谢冰等认为在西葫芦未
受精胚珠培养过程中使用的理想外源激素为 NAA、
BA和2,4-D[9,26]。
2.3.3 碳源 一般来说，蔗糖是最常用的碳源。除
此之外，也有些研究人员使用其他糖类，如葡萄糖，也
取得了良好的培养效果。谢冰等研究结果表明，西葫芦
离体雌核培养胚状体成苗阶段培养基碳源浓度对健全
胚状体成苗有较大影响，以20g/L蔗糖或葡萄糖做为
胚状体诱导培养基的碳源时胚状体成苗率最高，再生
植株生长健壮，驯化、移栽成活率也高[26]。Ashok等对
黄瓜花药培养的研究表明花药诱导培养的最佳碳源为
蔗糖，诱导胚胎形成时蔗糖浓度为85g/L，在分化时则
为30g/L[27]。陈小鹏等对黄瓜未授粉子房的胚状体诱导
试验表明在蔗糖浓度为 40g/L时胚状体诱导效果最
好[24]。在南瓜的花药培养中当诱导培养基中的蔗糖浓
度是150g/L时产生的小植株最多[28]。
2.3.4因素之间相互作用 谢冰等通过西葫芦离体雌核
培 养 研 究 结果表明添加4.00mg/L2,4-D+0.25mg/
LNAA+1.00mg/L6-BA或 4.00mg/L2,4-D+0.5mg/
LNAA+1.00mg/L6-BA，并以20g/L或30g/L蔗糖或葡
萄糖做为胚状体诱导培养基的碳源时，西葫芦离体雌
核胚状体成苗率达95.0%以上。而如果不配以以上激
素，用30g/L的蔗糖或葡萄糖做碳源时，易产生无根
苗，难以驯化移栽[26]。
Ashok等对黄瓜花药培养研究过程中发现混合氨
基酸（ 谷胱氨酸，甘氨酸，精氨酸，天冬氨酸，半胱氨酸）
在一定浓度范围内的效果比单一氨基酸的效果更
好[27]。
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2.4外植体发育时期
在诱导单倍体材料进行发育的过程中，外植体在
接种时所处的发育时期可能比培养基成分更为重要。
Gémesné 等对 6种不同基因型的黄瓜进行了取材
时期和预处理方式的研究，发现雌花开放前6h时胚囊
刚好形成，胚的诱导频率最高[13]。谢冰等对西葫芦未受
精胚珠离体培养诱导结果表明，西葫芦成熟以及接近
成熟的胚囊对人工诱导条件比较敏感，而成熟后的胚
囊成员细胞在离体条件下较难启动分裂[10]。陈学军等
也提出开花当日西葫芦未受精胚珠活力较高，其愈伤
组织诱导率也最高[9]。
2.5辐射剂量对辐射花粉授粉诱导单倍体的影响
近年来，通过辐射花粉诱导雌核发育获得单倍体
技术已培育出多种葫芦科植物单倍体植株，如黄
瓜[18,29,30]、西瓜[31,32]、甜瓜[33~35]，并且已应用于育种中。
60Co产生的γ射线是辐射花粉授粉技术诱导葫
芦科蔬菜作物单倍体的有效辐射源。辐射剂量同植物
的花粉粒大小有关，花粉粒越小越耐辐射[36]。此外，辐
射剂量也与植物的种类、辐射的器官和植株的生长状
态等有关。许多研究表明，黄瓜和西瓜的常用剂量为
200~300Gy[32~37]，雷春等也指出辐射剂量为200Gy或
300Gy处理过的花粉授粉诱导产生黄瓜单倍体植株的
剂量效应非常显著[38]，而谢淼等认为黄瓜单倍体诱导
率150Gy总体上效果好于300Gy[39]，Nikolova等则提
出黄瓜单倍体诱导最适宜的射线剂量为300~500Gy，
这可能是由于黄瓜品种不同的原因[40]。甜瓜较常用的
辐射剂量是500~2500Gy[41]，南瓜的有效辐射剂量通常
为25~50Gy[42]，是葫芦科植物中较低的。
另外，Sauton等认为，甜瓜辐射授粉后3周做胚珠
离体抢救，可以提高单倍体胚的诱导效率[19]；而孙玉宏
等研究表明授粉后12d左右的甜瓜果实中可抢救的胚
的数量较高[43]。Sari和Abak认为西瓜离体胚抢救的最
佳时间为授粉后3~4周[44]。
2.6其他因素
谢冰等对西葫芦离体雌核培养进行研究结果表明
取自子房中部的胚珠比取自子房上部和下部胚珠产生
健全胚状体的比例大。西葫芦离体雌核培养胚状体形
成后应在1周内及时转移至植株再生培养基上使之顺
利成苗。否则根端发育受阻，即使可以成苗，植株也十
分弱小，移栽成活率极低[26]。
陈学军等在做西葫芦未授粉胚珠离体培养诱根试
验时发现，诱根培养基中添加高浓度的NO3ˉ 有利于
不定根的形成，但其作用机理尚不清楚[9]。
袁万良在西瓜花药培养时，加入了三十烷醇进行
处理，发现愈伤组织全部变为绿色，并形成深绿色点状
组织，这提高了再生植株的诱导率，为西瓜单倍体育种
工作解决了关键技术问题[16]。
3有关离体培养发育机制的生理生化变化研究
有关离体培养发育的研究主要集中在雌核胚胎发
生的形态学过程，有关发育过程中生理生化方面的研
究以及发育过程均少见报道。
在大小孢子发育的过程中，细胞内部发生了一系
列的生理和生化变化，从而影响到发育过程中物质和
能量代谢。细胞内外物质、生理条件的变化是大小孢子
发育的物质基础，所以筛选具有较高胚胎发生频率的
生化指标，研究细胞全能性及胚状体等，可从分子水平
上研究蔬菜作物大小孢子胚状体发生的机制[45]。
王晓云等以离体培养的黄瓜未受精子房为试材，
测定了黄瓜离体雌核发育早期过氧化物酶及其同工酶
的活性，结果表明，在培养的1~5d是雌核发育的启动
和决定时期，尤其在培养的前3d，过氧化物同工酶活
性特别是NADHPOD和GSH-Px活性的急剧升高，是
雌核发育的重要标志。研究也发现，在培养的0~9d，
NADH氧化酶（ NADHPOD）和生长素氧化酶（ IAAO）
活性均呈上升趋势；细胞色素氧化酶（ COX）、抗坏血
酸氧化酶（ ASP）活性均呈下降趋势；总的过氧化物酶
（ POD）升至第6天后开始下降；谷胱甘肽过氧化物酶
（ GSH-Px）则先升后降[46]。
杜胜利等首次研究了黄瓜离体雌核发育的形态及
细胞学过程，以及培养早期生理、生化的变化。结果表
明：雌核发育在培养的前6d即已开始，24d时形成胚
状体，40d时形成成熟的胚状体。雌核发育的前6d外
植体POD酶活性急剧上升，SOD先上升后下降，Q酶
活性明显上升但低于非雌核发育，Ca2+-ATP酶和
Mg2+-ATP酶活性变化较小且均低于非雌核发育。在非
雌核发育的外植体W5中，促进细胞代谢的IAA、iPA
和Zr含量急剧上升，GA4也有一定上升。而在雌核发
育的外植体M99中上述激素含量均较低，尤其是IAA
含量的明显下降。研究中的激素和各种酶活性的变化
主要反映了胚囊外体细胞的直接变化，这些变化和雌
核发育有着直接和间接的关系[47]。
雷春等对不同倍性黄瓜的形态和一些生理生化指
标进行了比较。相同基因型从单倍体到四倍体，黄瓜植
株的生长量从微型化向巨大性发展，单位面
积叶绿素含量和苹果酸脱氢酶（ MDH）表达量等生理
生化指标随染色体倍性的增加而增加，过氧化物酶
（ POD）活性则随倍性的增加而降低，剂量效应明显；其
他形态指标和可溶性蛋白含量等与染色体倍性无明显
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相关性[48]。
韩毅科等通过改进的IEF-SDS-PAGE技术研究了
黄瓜雌核发育早期的特异蛋白质表达，首次发现黄瓜
离体雌核发育过程中不仅有蛋白质含量的变化，而且
有特异蛋白质的形成。这些蛋白质很可能是细胞胚胎
发生特定时期基因特异性表达的产物，并可能与该时
期细胞的功能或组织的形态建成有密切关系，从而对
黄瓜雌核发育早期的启动起着重要作用[49]。
目前为止，学者们从细胞及形态学方面初步研究
了黄瓜雌核发育的过程以及雌核发育早期的生理生化
变化，为进一步提高雌核发生的再生频率，探索雌核发
育调控分子机理奠定了理论基础。
4DH育种研究进展
单倍体植株经自然加倍或人工加倍处理可产生基
因位点纯合的加倍单倍体系（ DH，DoubledHaploid），
并由这些DH系构建成永久性分离群体。DH群体间
存在着遗传多样性，是不分离群体，它可以直接用于育
种实践，也广泛用于分子标记等遗传学研究，日渐成为
现代遗传形态发生学和分子生物学等基础研究的有用
工具[50]。
Sauton（ 1990）用 0.5%秋水仙碱浸泡甜瓜单倍体
幼苗生长点 2h得到了纯合的双单倍体植株 [51]。K.
Abak等（ 1997）对黄瓜单倍体无菌苗植株在无菌状态
下用秋水仙碱浸泡后，转入E20A培养基上，驯化后的
小苗转入蛭石中，成功获得DH植株[52]。杜胜利等在国
内首次建立了一整套通过未受精子房离体培养产生黄
瓜单（ 双单）倍体植株的技术体系，再生频率达25%[14]。
N.Sari用200或300Gy的γ射线辐射花粉授粉进行
西瓜孤雌生殖单倍体胚诱导，单倍体胚经离体培养获
得单倍体植株，再经染色体加倍获得了双单倍体株
系[32]。K.Abak等用0.5%秋水仙碱浸泡单倍体幼苗生
长点也成功地使西瓜单倍体加倍得到双单倍体植
株[53]。葫芦科其他植物成功获得双单倍体的研究少见
报道。
5存在问题及思路
目前离体诱导植物单倍体的工作取得了很大的进
展，在大小孢子的胚胎学研究中，也已做了许多工作，
但单倍体离体诱导还不能在葫芦科植物的所有重要基
因型中普遍应用，仍需作进一步研究。同时，对于如何
改进实验技术，提高诱导效率以及加强建立稳定且可
重复的培养流程依然是今后研究的重要内容。
对于如何能使一个本来正在进行配子体发育的孢
子，转而进行一种方式完全不同的孢子体发育的机制，
目前所知甚少。在这方面作进一步的探索也是必要的。
葫芦科种质资源由于长期的定向遗传改良，目前
生产上推广的品种资源日益狭窄。如果将葫芦科单倍
体离体诱导与常规育种有机结合，就可使葫芦科育种
发生革命性的变化。而单倍体尤其是双单倍体（ DH）与
分子生物学，基因工程的密切结合，将为葫芦科植物的
遗传育种开辟一条崭新的途径。随着中国葫芦科植物
单倍体离体诱导研究的进一步深入，必将使单倍体离
体诱导在遗传育种中的应用得到更快的发展，从而更
好地改良葫芦科遗传变异，培育出更多优良品种。
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(责任编辑：陶冶之)
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