全 文 ：广 西 植 物 Guihaia　Dec．２０１５,３５(６):８４８－８５２　　　　　　　　　　 http://journal．gxzw．gxib．cn　
DOI:１０．１１９３１/guihaia．gxzw２０１４０６０３７
曲畅游,许崇梅．两栖蓼的分子系统学研究[J]．广西植物,２０１５,３５(６):８４８－８５２
QuCY,XuCM．PhylogenyofPolygonumamphibiuminferredfrommolecularsequences[J]．Guihaia,２０１５,３５(６):８４８－８５２
两栖蓼的分子系统学研究
曲畅游１,２,许崇梅１∗
(１．潍坊医学院,山东 潍坊２６１０５３;２．山东药品食品职业学院,山东 威海２６４４００)
摘　要:两栖蓼是一种水陆两栖植物,植株在不同生态环境下外部形态差异较大,同时两栖蓼的系统位置存
在争议,被归入春蓼组(sect．Persicaria)或提升为两栖蓼组(sect．Amphibium).该文选取两栖蓼及春蓼组植
物１２种,以及刺蓼组、头状蓼组、神血宁组、拳参组、萹蓄组和外类群掌叶大黄共２３种植物进行研究.植物总
DNA的提取采用改进的CTAB法,所测序列以及从Genbank数据库下载的序列,以掌叶大黄为外类群,采用
最大简约法和贝叶斯法对核糖体ITS序列和叶绿体trnLＧF序列进行了系统发育分析.ITS序列对位排列的
长度为７３５bp,包括４８９个可变位点,２７２个位点是信息位点.简约法得到９个简约树,步长为１０８４,CI指数
为０．６８０,RI指数为０．６１４.trnLＧF序列对位排列的长度为１１２１bp,包括４２７个可变位点,２３９个位点是信息
位点.简约法寻找到９个简约树,步长为５５１(CI＝０．９１１,RI＝０．９１０).贝叶斯法和简约法得到的树基本一
致.分子序列分析结果显示,trnLＧF序列树类似于ITS序列树.ITS序列构建的发育树上,两栖蓼与刺蓼组
植物、春蓼组其他植物形成３个并列的分支;在trnLＧF序列树上,两栖蓼则与其他春蓼组植物形成两个并列
的分支.由此可见,两栖蓼与春蓼组其他植物的亲缘关系较远,成一独立的分支.两个分子证据支持将两栖
蓼提升为两栖蓼组的处理意见.此外,两栖蓼的花粉具散沟,与典型的春蓼组的具散孔花粉不一致.再加上
两栖蓼水陆两栖的特性,因此支持把两栖蓼提升为两栖蓼组的观点.两栖蓼组的界定为多年生草本,水陆两
栖,根状茎横生,生于水中茎漂浮,叶长圆形或椭圆形,生于陆地茎直立,叶披针形或长圆状披针形,托叶鞘为
筒状、薄膜质,总状花序穗状,瘦果近圆形,花粉具散沟.
关键词:两栖蓼;ITS序列;trnLＧF序列;春蓼组
中图分类号:Q７８９　　文献标识码:A　　文章编号:１０００Ｇ３１４２(２０１５)０６Ｇ０８４８Ｇ０５
PhylogenyofPolygonumamphibium
inferredfrommolecularsequences
QUChangＧYou１,２,XUChongＧMei１∗
(１．WeifangMedicalUniversity,Weifang２６１０５３,China;２．ShandongDrugandFoodVocationalCollege,Weihai２６４４００,China)
Abstract:PolygonumamphibiumisanamphibiousplantwhichexternalmorphologyisdistinctunderdiferentecoＧ
logicalenvironment．Terrestrialplantscanbeconvertedtoaquaticplants,aquaticplantscouldalsobeconvertedto
terrestrialplantsunderappropriateecologicalcondition．Meanwhile,thesystematicpositionofP．amphibiumisin
dispute,andthespecieshadbeenplacedwithinsect．Persicariaortreatedassect．Amphibium．TheribosomalITS
sequencesandchloroplasttrnLＧFsequencesareverywidelyusedinplantsofphylogeneticinvestigations,including
forthegenusPolygonum,andwhichhasprovidedmanynewphylogeneticevidencesforPolygonum．Inthispaper,a
totalof２３kindsofplantsincluding１２representativesofsect．Persicaria (P．amphibium),１０representativesof
othersectionsofPolygoum (sect．Echinocaulon,sect．Bistorta,sect．Cephalophilon,sect．Aconogonon,sect．
收稿日期:２０１４Ｇ０９Ｇ２６　　修回日期:２０１４Ｇ１２Ｇ０４
基金项目:国家自然科学基金(８１２７４０４９);山东省自然科学基金(２０１２CQ０３９).
作者简介:曲畅游(１９６６Ｇ)男,山东文登人,硕士,副教授,从事药用植物学研究,(EＧmail)９８４００２６７９＠qq．com.
∗通讯作者:许崇梅,博士,副教授,主要从事系统与进化植物学研究,(EＧmail)xuchongmei２０１２＠１６３．com.
Avicularia)andoneoutgroupRheumpalmatum wereincludedinthesurvey．ThetotalDNAwasisolatedbyimＧ
provedCTABmethods．TheITSregion(ITS１Ｇ５．８SＧITS２)wasamplifiedwithprimersITS１andITS４describedby
Whiteetal．(１９９０)．TheplastidtrnLＧFsequenceswasachievedusingprimerscandfdescribedbyTaberletetal．
(１９９１)．AlPCRproductswerepurifiedusingaQIAquickgelextractionkitandthensequenceddirectlyonan
ABI３７７０automatedsequencer．ThesequencedsequencesandthesequencedownloadfromGenbankwereanalysized．
TheITSandtrnLＧFsequenceswerealignedseparatelyusingtheprogramCLUSTALX１．８３．Rheumpalmatumwas
designedasoutgroup．BayesianandmaximumparsimonyanalysesweremadeonsequencesofnuclearITSandplastid
trnLＧFdatasetsusingtheprogram MrBayes３．０b４andPAUP∗４．０brespectively．ThesequencednuclearITSenＧ
compassed７３５bpalignednucleotidepositions,ofwhich４８９siteswerevariableand２７２siteswereparsimonyinＧ
formative．Theheuristicsearchyielded９treesthatwere１０８４stepslong(CI＝０．６８０,RI＝０．６１４)．TheplastidtrnLＧ
Fregioncomprised１１２１bpnucleotidepositions．Atotalof４２７positionswerevariable,and２３９siteswerepotentialＧ
lyparsimonyinformative．ParsimonyＧbasedanalysisyielded９equalyparsimonioustreesof５５１stepswithCIof
０．９１１andRIof０．９１０．ThetreesconstructedbyBayesianandMPanalyseswerebasicalycongruent．MolecularanaＧ
lysesdisplayedthattheITStreewassimilartothetrnLＧFtree．IntheITStree,Polygonumamphibiumandother
plantsofsect．Persicariaplussect．Echinocaulonformedthreeparalelclades;InthetrnLＧFtree,P．amphibium
wassistertotheremainderofsect．Persicariawithhighbootstrapvalue．MolecularresultscouldbeachievedasfolＧ
lows:P．amphibiumhadadistantrelationshiptootherplantsofsect．Persicaria．Inaddition,thepolenmorphology
ofP．amphibiumwasscatteredditch,thepolenmorphologyoftheremainingspeciesofsect．PersicariawerescatＧ
teredhole．CombinedwithamphibiouscharacteristicsofP．amphibium,wewereinagreementwithZhang’sview
thatitwasnecessarytoaccordP．amphibiumassectionrank．sect．Amphibiumwasdefinedasherbsperennial,amＧ
phibious,rhizomeshorizontal,aquaticplants:stemsfloating,leavebladeoblongoreliptic,terrestrialplants:stems
erect,leafbladelanceolateoroblongＧlanceolate,ocreatubular,thinlymembranous,inflorescencespicate,achene
suborbicular,polenwithscatteredditch．
Keywords:Polygonumamphibium;ITSsequences;trnLＧFsequences;sect．Persicaria
　　两栖蓼(Polygonumamphibium)是林奈在
１７５３年的植物种志命名的,是一种水陆两栖植物,
其植株在不同生态环境下差异较大.曾宪峰(１９９２)
观察到两栖蓼在一定水条件下,可以在很短的时间
内由陆生直立草本转变成浮水草本或挺水草本;浮
水草本和挺水草本也能转变成陆生直立草本.
Steward(１９３０)根据两栖蓼托叶鞘为筒状、膜质,花
序为 穗 状 等 特 征 将 其 放 入 春 蓼 组 (sect．
Persicaria).Hara(１９６６)、Haraldson(１９７８)、
RonseDecraeneetal．(１９８８)、李安仁等(１９９８)、吴
征镒等(２００３)、Lietal．(２００３)、Freemanetal．
(２００５)都采用他的意见.张小平等(１９９８)则根据两
栖蓼的花粉具散沟,与典型的春蓼组具散孔花粉不
一 致,把 两 栖 蓼 提 升 为 两 栖 蓼 组 (sect．
Amphibium).由此可见,两栖蓼的系统位置存在
分歧,需要进一步地研究.
核糖体ITS序列和叶绿体trnLＧF序列,已被广
泛用于植物属间、组间系统发育关系和遗传多样性
的分析.在探讨蓼科植物系统发育中,ITS序列和
trnLＧF序列也得到广泛应用.许崇梅等(２００９)依
据 trnLＧF 序 列 把 大 铜 钱 叶 蓼 (Polygonum
forrestii)归到冰岛蓼属(Koenigia),依据ITS序列
认为金线草(Antenoronfiliforme)不应独立成属,
应成立金线草组(sect．Tovara)(许崇梅等,２０１１).
赵大鹏等(２０１２)基于叶绿体trnLＧF、rbcL序列和核
糖体ITS序列探讨蓼属(蓼科)头状蓼组的系统发
育.但有关两栖蓼的研究报道较少,两栖蓼的分子
系统学研究更未见报道.本文测定了两栖蓼及相关
类群的ITS序列和trnLＧF序列,以期解决两栖蓼的
归属,为蓼属的系统发育关系提供新的分子证据.
１　材料与方法
１．１材料
所选材料的分类依据“FloraofChina”(Liet
al．,２００３)(表１).凭证标本保存在山东师范大学植
物标本室(SDNU).部分序列来源于 GenBank数
据库.
１．２DNA提取及PCR扩增和测序
所用植物材料均为硅胶干燥的叶片,植物总DNA
９４８６期　　　　　　　　　曲畅游等:两栖蓼的分子系统学研究
表１　实验材料及其来源
Table１　Experimentalmaterialsandtheirsources
类群 Taxa
采集地
Locality
凭证标本
Voucher
GenBank
trnLＧFAccessionNo．
GenBank
ITSAccessionNo．
蓼属春蓼组
Polygonumsect．Persicaria
两栖蓼
P．amphibium
山东章丘
Zhangqiu,Shandong
２００２１０(SDNU) KM４３５２７９ KM４３５２８０
蓼
P．persicaria
山东艾山
Mt．Aishan,Shandong
１１５６(SDNU) EU０２４７８１ JF９２２１０５
辣蓼
P．hydropiper
四川成都
Chengdu,Sichuan
２００３３１(SDNU) FJ６２７２６７ EF６５３７０２
丛枝蓼
P．caespitosum
Genbank JN２３５０４４ JN２３５０８４
酸模叶蓼
P．lapathifolium
Genbank HQ８４３１５７ HM３５７９９１
红蓼
P．orientale
GenBank HQ８４３１３２ DQ４０６６３１
粘蓼
P．viscoferum
GenBank HQ８４３１３８ EU１９６９２１
蚕茧草
P．japonicum
GenBank EU１９７０２４ EU１９６８８５
毛蓼
P．barbata
GenBank EU１９７０１０ EU１９６８７１
光蓼
P．glabrum
GenBank EU１９７０１７ JX１４４６６７
细叶蓼
P．taquetii
GenBank EU１９７０４７ EU１９６９１８
长鬃蓼
P．longiseta
GenBank EU１０９５９７ HQ８４３１３５
蓼属刺参组
Polygonumsect．Echinocaulon
戟叶蓼
P．thunbergii
山东崂山
Mt．Laoshan,Shandong
１８９２(SDNU) FJ６２７２６５ KM４３５２８２
箭头蓼
P．sagittatum
山东崂山
Mt．Laoshan,Shandong
０５０９(SDNU) FJ６２７２６６ KM４３５２８３
蓼属拳参组
Polygonumsect．Bistorta
珠芽蓼
P．viviparum
新疆天山
Mt．Tianshan,Xinjiang
０３００５(SDNU) EU０２４７７６ JF９２２１０１
倒根蓼
P．ochotense
吉林长白山
Mt．Changbaishan,Jilin
００１(SDNU) KM４３５２８１ JF９２２１０９
蓼属头状蓼组
Polygonumsect．Cephalophilon
尼泊尔蓼
P．nepalense
山东泰山
Mt．Taishan,Shandong
０２０３(SDNU) FJ６２７２６９ JF９２２１００
头花蓼
P．capitatum
云南昆明
Kunming,Yunnan
０８７(SDNU) FJ６２７２７０ KM４３５２８４
蓼属神血宁组
Polygonumsect．Aconogonon
准噶尔神血宁
P．songaricum
GenBank EU０２４７８８ JF９２２１０２
白花神血宁
P．coriarium
GenBank EU０２４７７４ JF９２２１０３
蓼属萹蓄组
Polygonumsect．Avicularia
萹蓄
P．aviculare
山东艾山
Mt．Aishan,Shandong
２０１３(SDNU) FJ６２７２７１ EF６５３６８４
岩萹蓄
P．cognatum
新疆
Xinjiang
０３００３(SDNU) FJ６２７２７２ JQ２８８７６６
大黄属Rheum
掌叶大黄
R．palmatum
GenBank AY５６６４５１ AY２０７３７０
０５８ 广　西　植　物　　　 　　　　　　　　　　　　　　３５卷
提取采用改进的 CTAB法(Doyleetal．,１９８７).
trnLＧF序列扩增采用通用引物c(CGAAATCGGＧ
TAGACGCTACG)和f(ATTTGAACTGGTGAＧ
CACGAG)(Taberletetal．１９９１),PCR扩增程序为
９５℃预变性５min,９５℃ 变性１min,５６℃ 退火
３０s,７２℃ 延伸１min,３０个循环,最后７２℃ 延伸
５min.ITS序列扩增采用 Whiteetal．(１９９０)的引
物ITS１(５′ＧAGAAGTCGTAACAAGGTTTCCGＧ
TAGGＧ３′) 和 ITS４ (５′ＧTCCTCCGCTT ATTＧ
GATATGCＧ３′),PCR 扩增程序为９４ ℃ 变性１
min,５０℃退火１min,７２℃延伸１．５min,３０个循
环,最后７２℃延伸４min.trnLＧF序列和ITS序列
的PCR扩增产物纯化后直接用于测序反应(上海英
骏公司的ABI３７７０自动测序仪).为保证序列的准
确性,各样品均采用正向和反向测序.
１．３序列的分析
所测的序列和从GenBank数据库中下载的序
列,用ClustalX１．８３软件进行对位排列,排好的序列
用PAUP∗４．０b软件构建系统发育树(Swofford,
２００３).空位(gap)始终作为缺失状态.在简约法中
采用启发式搜索 (heuristicsearch)方法,１０００次
随机加入,TBR(treebisectionＧreconnection)枝长
交换,进行启发式搜索,寻找最简约树.系统树的可
靠性评价采用自展检验(Bootstrap)来检验,启发式
搜索１０００次重复取样,计算各分支的支持率.
用 MrBayes３．０b４软件(Ronquistetal．,２００３)
构建贝叶斯推论 BayesianinferenceBI分子系统
树,选用 ModelTestver．３．６(Posadaetal．,１９９８)选
用最适合于拟合该数据集的DNA进化模型ITS为
GTR＋I＋G;trnLＧF为GTR＋G;同时建立４个马
尔可夫链,共运行２００万代,每１００代抽样１次,忽
略全部动态抽样２０００次,对剩余的１８０００次静态
抽样计算合意树,以后检验概率(PosteriorprobaＧ
bility)PP作为评估参数.
２　结果与分析
２．１ITS序列
对位排列的长度为７３５bp,包括４８９个可变位
点,２７２个位点是信息位点.采用掌叶大黄作为外
类群,用简约法寻找到９个简约树,步长为１０８４,CI
指数为０．６８０,RI指数为０．６１４.贝叶斯构建的多数
一致树与最大简约法基本一致,最大简约法得到的
严格一致树和贝叶斯多数一致树见图１.分支上的
数字分别代表支持率和后验概率.
图１　ITS树　后验概率和支持率标记在各分支上,下同.
Fig．１　TheITStree　Posteriorprobabilitiesandbootstrap
areindicatedonthecorrespondingbranches,thesamebelow．
在ITS树上,萹蓄组植物首先分支出来,其他
蓼属植物则分成２支(分支Ⅰ和分支Ⅱ).分支Ⅰ由
拳参组和分叉蓼组植物组成;分支Ⅱ由春蓼组、刺蓼
组和头状蓼组植物组成.在分支Ⅱ上,头状蓼组植
物又首先分支出来,另一分支由３个并列的亚支A、
B和C组成.春蓼组植物除了两栖蓼外属于亚支
A,两栖蓼位于亚支B上,刺蓼组植物属于亚支C.
２．２trnLＧF序列
trnLＧF序列的范围根据已发表的蓼科植物确
定.对位排列的长度为１１２１bp,包括４２７个可变
位点,２３９个位点是信息位点.采用掌叶大黄作为
外类群,用简约法寻找到９个简约树,步长为５５１,
CI指数为０．９１１,RI指数为０．９１０.最大简约法得
到的严格一致树和贝叶斯多数一致树见图２.分支
上的数字分别代表支持率和后验概率.
trnLＧF序列树类似于ITS序列树,只是两栖蓼
与其他春蓼组植物形成两个并列的分支,后与刺蓼
组植物聚在一起.
１５８６期　　　　　　　　　曲畅游等:两栖蓼的分子系统学研究
图２　trnLＧF树
Fig．２　ThetrnLＧFtree
３　讨论
在ITS序列树上,两栖蓼与春蓼组其他植物、
刺蓼组植物形成３个并列的分支;在trnLＧF序列树
上,两栖蓼则与其他春蓼组植物形成两个并列的分
支,并得到１００％的支持率.由此可见,两栖蓼与春
蓼组其他植物的亲缘关系较远,已达到单立组的水
平.此外,两栖蓼的花粉具散沟,与典型的春蓼组的
具散孔花粉不一致(张小平等,１９９８).再加上两栖
蓼水陆两栖的特性,因此,我们支持张小平等(１９９８)
把两栖蓼提升为两栖蓼组的观点.两栖蓼组的界定
为多年生草本,水陆两栖,根状茎横生,生于水中茎
漂浮,叶长圆形或椭圆形,生于陆地茎直立,叶披针
形或长圆状披针形,托叶鞘为筒状、薄膜质,总状花
序穗状,瘦果近圆形,花粉具散沟.
参考文献:
DoyleJJ,DoyleJL．１９８７．ArapidDNAisolationprocedurefor
smalquantitiesoffreshleaftissue[J]．PhytBull,１９:１１－１５
FreemanCC,RevealJL．２００５．FloraofNorthAmerica[M]．St．
Louis:MissouriBotanicalGarden．USA
HaraH．１９６６．TheFloraofEasternHimalaya[M]．Japan:UniＧ
versityofTokyo:６７－７６
HaraldsonK．１９７８．AnatomyandtaxonomyinPolygonaceaesubＧ
fam．Polygonoideae Meisn．emend．Jaretzky[J]．SymbBot
Upsal,２２(２):１－９５
LiAJ(李安仁)．１９９８．FloraReipublicaePopularisSinicae(中国植
物志)[M]．Beijing(北京):SciencePress(科学出版社)
LiAR,BaoBJ,GrabovskayaBorodinaAE,etal．２００３．PolygoＧ
naceae[M]//WuZY,RavenPH,HongDY．FloraofChina．
Beijing．SciencesPress;St．Louis:MissouriBotanicalGarden
Press,５:２７７－３５０
PosadaD,Crandal KA．１９９８．Modeltest:testingthemodelof
DNAsubstitution[J]．Bioinfor,１４:８１７－８１８
RonquistF,HuelsenbeckJP．２００３．MrBayes３:BayesianphyＧ
logeneticinferenceundermixedmodels[J]．Bioinformatics,
１９:１７７－１９２
RonseDecraeneLP,AkeroydJR．１９８８．GenericlimitsinPolygoＧ
numandrelatedgenera(Polygonaceae)onthebasisofflora
characters[J]．BotJLinnSoc,９８:３２１－３７１
StewardAN．１９３０．ThePolygoneaeofEasternAsia[J]．Contr
GrayHerbarHarvUniv,５(８８):１－１２９
SwoffordDL．２００３．PAUP∗ PhylogeneticAnalysisUsingParsiＧ
mony(∗andothermethods)version４．０b１０[M]．Sunderland
MA:SinauerAssociates
TaberletP,GielyTJ,PautouG,etal．１９９１．Universalprimers
foramplificationofthreenonＧcodingregionsofchloroplastDNA
[J]．PlantMolBiol,１７:１１０５－１１０９
WhiteTJ,BrunsT,LeeS,etal．１９９０．Amplificationanddirect
sequencingoffungalribosomalRNAgenesforphylogenetics
[M]//Innis MA,Gelfand DH,SninskyJJ(eds)．PCR
Protocols:AGuidetoMethodsandApplications．SanDiego,
California:AcademicPress:３１５－３２２
WuZY(吴征镒),LuAM(路安民),TangYC(汤彦承),etal．
２００３．TheFamiliesandGeneraofAngiospermsinChina,A
ComprehensiveAnalysis(中国被子植物科属综论)[M]．Beijing
(北京):SciencePress(科学出版社)
XuCM(许崇梅),QuCY(曲畅游),LiFZ(李法曾),etal．２００９．
PhylogenyofKoenigiainferredfromplastidtrnLＧFsequences
[J]．ActaBotBorealＧOccidentSin(西北植物学报),２９(４):
６９１－６９４
XuCM(许崇梅),QuCY(曲畅游),LiFZ(李法曾),etal．２０１１．
PhylogeneticoriginofAntenoronfiliformeinferredfromnuclear
ITSsequences[J]．Guihaia(广西植物),３１(３):３００－３０３
ZengXF(曾宪峰)．１９９２．Studyonthebiologicalcharacteristicsof
Polygonumamphibiumunderdifferentwaterconditions[J]．J
HebeiAgrotechTeachColl(河北农业技术师范学院学报),８
(２):３６－３９
ZhangXP(张小平),ZhouZZ(周忠泽)．１９９８．AStudyonPolen
MorphologyandItsPhylogenyofPolygonaceaeinChina(中国蓼
科花粉的系统演化)[M]．Hefei(合肥):PressofUniversityof
ScienceandTechnologyofChina(中国科学技术大学出版社)
ZhaoDP(赵大鹏),WangKM(王康满),HouYT(侯元同)．
２０１２．PhylogenyofPolygonumsect．Cephalophilon(PolygoＧ
naceae)inferredfromthechloroplasttrnLＧF,rbcLandnuclear
ribosomalITSsequences(基于叶绿体trnLＧF,rbcL序列和核核
糖体ITS序列探讨蓼属(蓼科)头状蓼组的系统发育)[J]．
BullBotRes(植物研究),３２(１):７７－８３
２５８ 广　西　植　物　　　 　　　　　　　　　　　　　　３５卷