全 文 ：第 49 卷 第 5 期
2 0 1 3 年 5 月
林 业 科 学
SCIENTIA SILVAE SINICAE
Vol. 49，No. 5
May，2 0 1 3
doi:10．11707 / j．1001-7488．20130507
收稿日期: 2012 － 09 － 04; 修回日期: 2013 － 02 － 12。
基金项目: 国家自然科学基金重点项目(31030018)。
* 卢孟柱为通讯作者。
应用 nanoLC-MS /MS分析毛白杨次生维管
系统的蛋白质表达谱*
蒋淑磊1，2 陈加飞1，3 赵树堂1，2 卢孟柱1，2
(1．林木遗传育种国家重点实验室 北京 100091; 2．中国林业科学研究院林业研究所 北京 100091;
3． 中国林业科学研究院林业新技术研究所 北京 100091)
摘 要: 基于 1DE 的 nanoLC-MS /MS 方法分析毛白杨次生维管系统的蛋白质组，成功鉴定: 14 个蛋白质参与细
胞分裂，7 个转录因子，22 个与细胞骨架相关蛋白质，31 个与细胞信号转导相关蛋白质，14 个与细胞壁相关蛋白
质。显示这些蛋白质相应基因参与形成层活动的调控，为进一步了解木材形成的分子机制奠定基础。
关键词: 液相色谱-串联质谱; 蛋白质表达谱; 次生维管系统; 毛白杨
中图分类号: S718. 46 文献标识码: A 文章编号: 1001 － 7488(2013)05 － 0043 － 11
Proteome Profile in Secondary Vascular System of Populus tomentosa by nanoLC-MS /MS
Jiang Shulei 1，2 Chen Jiafei1，3 Zhao Shutang1，2 Lu Mengzhu1，2
(1 ． State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding Beijing 100091; 2 ． Research Institute of Forestry，Chinese Academy of
Forestry Beijing 100091; 3 ． Research Institute of Forestry New Technology，Chinese Academy of Forestry Beijing 100091)
Abstract: As the uppermost carbon pool and important renewable source，wood has dual functions in both responding to
the global climate change and meeting the resource demands of human society，thereby it is essential to understand the
molecular mechanism of wood formation． In this study，a 1DE-based nanoLC-MS /MS method was introduced to analyze
the proteome in the secondary vascular system of Populus tomentosa，and the identified proteins included:14 proteins
associated cell division; 7 proteins related to transcription factors; 22 proteins associated with cytoskeleton; 31 proteins
associated with signal transduction;and 14 proteins associated with cell wall formation． The corresponding genes of these
proteins participate in regulating cambial activity． The accomplishment of this proteome analysis laid a foundation for
further understanding the molecular mechanism of wood formation．
Key words: LC-MS /MS; proteome profile; secondary vascular system; Populus tomentosa
木材是次生维管系统发育的最终产物，其过程
包括细胞分裂、细胞扩张、细胞壁加厚、细胞程序性
死亡及心材形成等过程(Oh et al．，2003)，而维管形
成层向外分化成次生韧皮部和向内分化成次生木质
部，因此，研究次生维管系统发育的分子机制对了解
木材形成的分子机制具有重要意义(Plomion et al．，
2001)。
有关细胞木质化的分子机制研究存在多个研究
系统。利用细胞离体系统研究了木质素的合成不仅
只在维管植物的形态建成过程中，而且在各种压力
反应中也合成木质素( Sato et al．，2011)，但该系统
不能模拟木材发育过程中的形成层细胞分化。通过
8 h 光照 16 h 暗培养可延长拟南芥 ( Arabidopsis
thaliana) 维管形成层活动的时间 ( Dolan et al．，
1995)，其主根(Zhao et al．，2005)、下胚轴( Sibout et
al．，2008)和花梗(Lev-Yadun et al．，2004; Liu et al．，
2008)中发生维管形成层，由于形成层活动有限，维
管组织生长量少，研究结果不能完全反映木材细胞
分化程序和分子调控过程(Fukuda，2004)。在木本
植物中，研究者通过构建 EST 文库的方法分别从杨
树 ( Populus) ( Sterky et al．，2004 )、刺槐 ( Robinia
pseudoacacia) ( Yang et al．，2004 )、火炬松 ( Pinus
taeda)(Allona et al．，1998)等植物中获得了有关木
材发育的 EST 序列。此外，cDNA 芯片也被广泛用
林 业 科 学 49 卷
于木材形成组织的转录谱研究并据此在火炬松
(Egertsdotter et al．，2004; Whetten et al．，2001)、刺
槐(Yang et al．，2004)、桉树 ( Eucalyptus) ( Paux et
al．，2004 ) 和 毛 白 杨 ( Populus tomentosa ) ( Wang
et al．，2009)中鉴定了大量有关木材形成的基因。
然而，有关木材形成组织蛋白质组分析的报道并不
多。Gion 等 (2005)采用 2D LC-MS /MS 和 MALDI-
MS 的方法鉴定了 25 年生、14 年生和 3 年生海岸松
(Pinus pinaster)基部到顶端形成层形成过程中，其
组织的蛋白质表达情况，所鉴定的蛋白质多具有防
御、碳水化合物和氨基酸代谢、细胞骨架以及细胞壁
合成等功能。Celedon 等 (2007)采用 2-DE 和 LC-
MS /MS 的方法分析了不同树龄的巨桉 ( Eucalyptus
grandis)木材形成组织的蛋白质表达情况，共鉴定了
240 个蛋白质。应用蛋白质组学的方法，分析了杨
树次生维管组织单个氨基酸的多态性(Abraham et
al．，2012)，发现杨树在干旱时期形成层组织的蛋白
质表达模式发生了显著变化(Durand et al．，2011)，
研究了欧洲黑杨(Populus nigra)木质主根在应对机
械应力时蛋白质表达情况，共鉴定到 207 个蛋白质
(Trupiano et al．，2012)。本课题组采用 2DE-PAGE
技术与质谱(MALDI-TOF MS)结合(Du et al．，2006)
和多维色谱与质谱结合 (HPCF /HPRP-MALDI-TOF
MS)(陈军，2006)的方法建立了毛白杨次生维管系
统再生过程的蛋白质表达谱，分别获得 199 个和
724 个特异表达蛋白质，表明了基因表达与次生维
管系统发育过程的关系。
毛白杨的次生维管系统活动程度决定了木材质
量，鉴定该组织区域的蛋白质，有利于了解木材形成
这个复杂的生物学过程，以及所涉及的基因。本研
究采用聚丙烯凝胶电泳( SDS-PAGE)结合钠升级液
相色谱与电喷雾电离串联质谱联用( nanoLC-ESI-
MS /MS)方法分析毛白杨形成层区域的蛋白质组，
初步比较形成层和未成熟木质部的蛋白质组差异，
并分析了部分蛋白质在次生维管系统发育过程中的
作用。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
采用剥皮方法，取材植株为生长于河北省任丘
市的 4 年生毛白杨无性系。于 2007 年 6 月中旬，在
毛白杨树干形成层活动旺盛时期，选取干型通直、生
长健壮和生长环境通风透光性好的植株，在距植株
基部约 1 m 开始，向上环剥 1 m，剥皮后未成熟木质
部标记为 D0S，形成层及韧皮部标记为 D0B。用刀
片分别刮取树皮内侧(D0B)和树干表面(D0S)的材
料，放入冻存管中，投入液氮冻存。
1. 2 试验方法
1. 2. 1 蛋白质的提取 参考本实验室陈军(2006)
的蛋白质提取方法。
1. 2. 2 电泳及酶解 重悬 1. 2. 1 所获蛋白质并采
用 Bradford 方法测定其浓度，采用 12%的聚丙烯酰
胺凝胶对蛋白质样品进行预分离，上样量为 40 μg，
电泳电压为 80 V。经考马斯亮蓝染色和脱色后，将
每个样品(泳道，D0S 和 D0B 切割为约 30 个宽度不
等的胶块，经 DTT 还原和碘乙酰胺烷基化后，用
Trypsin 对蛋白质进行胶内酶切，回收获得同等数量
的不同肽段混合物，肽段经冷冻干燥后于 － 80 ℃
冻存以备进一步的 LC-MS /MS 分析。
1. 2. 3 LC-MS /MS 预柱规格: 300 μm i． d． ×
5 mm，C18，5 μm，100A (Dionex P /N 160454); 反
相柱规格: 75 μm i． d． × 15 cm，C18，3 μm，100A;
流动相组成: 上样缓冲液为 5% ACN /0. 1% FA /
94. 9% H2O，流动相 A 为 5% ACN /0. 1% FA /94. 9%
H2O，流动相 B 为 95% ACN /0. 1% FA /4. 9% H2 O。
上样泵流速 0. 02 mL·min － 1，柱流速 0. 3 μL·min － 1，
上样体积 1. 4 μL，进样方式为 μlPickup; 在 90 min
内，ACN 比例从 0 上升到 50%，而后由 50%一直升
高到 98%，并且在 98%维持 10 min，再由 98%下降
至 5%，并在 5%维持 10 min，平衡反相色谱柱。质
谱参数设置: 1. 8 kV 喷雾电压; XCalibur 软件控制
数据采集; 正离子模式; 120 min 样品采集时间，由
1 个扫描片段构成，扫描事件包括 1 个全扫描和 5
个数据依赖型扫描，扫描范围为 m /z 400 ～ 1 700;
酶解所获的每个肽段混合物进行 2 次 LC-MS /MS 分
析(重复 2 次)，2 个样品(D0B 和 D0S)分别获得约
60 个质谱数据集。
1. 2. 4 数据分析 蛋白质鉴定目标数据库由来自
JGI的毛果杨蛋白质数据库(1. 1 版，ftp:∥ftp． jgi-psf．
org / pub / JGI _ data /Poplar / annotation / v1. 1 / proteins．
Poptr1 _ 1． JamboreeModels． fasta． gz ) 及 由 软 件
RcpaBiosolution 1. 9. 0(RCPA 提供)构建的反向数据
库 2 部分构成。采用 Turbo SEQUEST 软件(Biowork
3. 2)进行目标数据库与质谱数据集间的比对。质
量类 型: 平 均 前 体 /单 一 同 位 素 片 段 ( average
precursor /monoisotopic fragment)，最多 2 个漏切位
点、肽段容错率 0. 8AMU 以及片段离子容错率 0. 8;
肽段所允许的翻译后修饰最多为 3 个。动态修饰:
甲硫氨酸的羟基化作用; 固定修饰: 半胱氨酸的羧
基氨基甲基化。经过搜库所获得的 ． out 文件应用
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第 5 期 蒋淑磊等: 应用 nanoLC-MS /MS 分析毛白杨次生维管系统的蛋白质表达谱
BuildSummary 软件(BPRC 提供)进行蛋白质水平的
鉴定。假阳性发现率控制在 5% 以内; △Cn 设为
0. 1; 当 Charge + 1，Xcorr≥1. 75;当 Charge + 2，Xcorr
≥2. 25;当 Charge + 3，Xcorr≥2. 75。将 LC-MS /MS
所获数据集按样品分为 D0B 和 D0S 两大组分分别
进行蛋白质鉴定，最终蛋白质鉴定标准为含有至少
2 个不同的肽段( uniquePeptide ≥2)。所获得的蛋
白质采用 Phobius(Kll et al．，2007)软件预测转膜结
构和信号肽。通过 BlastX 方法获得与鉴定杨树蛋
白质最佳匹配的拟南芥同源蛋白质。
2 结果与分析
2. 1 毛白杨次生维管系统的蛋白质表达谱
2 个样品 D0B 和 D0S 经一维凝胶电泳分离(图
1)，切胶并胶内还原、烷基化和酶解后，得到 60 个
肽段混合物，每个肽段混合物经过色谱-质谱分析
后，共获得了 140 个数据集。经数据库搜索和筛选，
仅在树皮内侧(D0B)存在的蛋白质为 380 个，仅在
树干表面(D0S)存在的蛋白质为 216 个，而同时出
现在 D0B 和 D0S 的蛋白质为 279 个。这些蛋白质
的功能涉及氨基酸运输和代谢、细胞周期控制、细胞
骨架、翻译后修饰和转录等 22 个功能类别，此外有
近 8%属于功能未知蛋白质(图 2)。在已知功能的
22 个蛋白质类别中，细胞骨架类、细胞内分泌和运
输类、氨基酸运输和代谢类、碳水化合物运输和代谢
类、翻译后修饰类以及翻译相关蛋白质在形成层区
域的表达明显高于未成熟木质部 (图 3)。等电点
(pI)分布显示，所有鉴定蛋白质主要分布于 4 ～ 7 的
酸性区间和 7 ～ 11 的碱性区间(图 4)。所获的蛋白
质经 Phobius 软件预测，分别鉴定出 41 个蛋白质含
转膜结构域、72 个蛋白质含信号肽，其中 9 个蛋白
质同时具有转膜结构域和信号肽。此外，含转膜结
构域的蛋白质主要分布于形成层区域(D0B)，而信
号肽蛋白质则在形成层区域和未成熟木质部平均分
布(表 1)。
表 1 转膜结构域蛋白质和信号肽蛋白质的分布情况
Tab． 1 The distribution of proteins containing
transmembranes and signal peptides
样品
Samples
转膜结构域
Transmembranes
转膜结构域及信号肽
Transmembranes
and signal peptides
信号肽
Signal
peptides
D0B 23 7 21
D0B＆D0S 5 0 23
D0S 4 2 19
总和 Total 32 9 63
图 1 样品 D0S 和 D0B 总蛋白的一维凝胶电泳分离
Fig． 1 Separation of total proteins extracted from D0S and
D0B by 1D SDS-PAGE
D0S: 树干表面 Surface of stem;
D0B: 树皮内侧 Inside of tree bark．
2. 2 细胞分裂相关蛋白质
共发现 14 种与细胞分裂密切相关的蛋白质
(表 2)，其中包括 2 个细胞分裂周期蛋白 CDC48 和
3 个 GTP 结合蛋白 RAN3。
2. 3 转录因子相关蛋白质
发现 7 个转录因子，只在 D0S 表达的 3 个，只在
D0B 表达的 1 个，2 个部位都有表达的 2 个(表 3)。
2. 4 细胞骨架相关蛋白质
细胞骨架在细胞壁形成和细胞形态发生中起到
重要作用，均与次生维管形成相关。本研究中发现
22 个可能与细胞骨架相关的蛋白质(表 4)，其中肌
动蛋白和微管蛋白数较多。
2. 5 信号转导相关蛋白质
细胞信号转导主要研究生物体在受环境刺激时
基因对细胞分化、增殖和发育过程的调节作用，包括
环境刺激的分子途径、细胞感受及其在生物个体发
育过程中如何调节基因表达和代谢生理反应。细胞
信号转导相关蛋白质包括信号分子的合成与释放、
CAMP 受体、钙调素相关蛋白、肌醇磷脂信号通路相
关蛋白、G 蛋白结合蛋白和参与激素信号传递中的
蛋白等。本研究中共发现 31 个与细胞信号转导相
关蛋白质(表 5)，其中钙调素蛋白和 G 蛋白较多。
2. 6 细胞壁形成过程相关蛋白质
作为植物细胞特有的结构，细胞壁性质很大程
度上决定着木材的材性。细胞壁主要成分是纤维和
果胶，由胞间层、初生壁和次生壁 3 部分组成。细胞
壁在发育阶段可能受环境的刺激，其组分的组成比
例呈现动态变化(Chaffey，1999a; 1999b)。本研究
鉴定到 14 个与细胞壁相关蛋白质(表 6)。
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图 2 毛白杨形成层区域蛋白质组的功能分类
Fig． 2 Functional categories of proteome from cambial
zone in P． tomentosa
图 3 不同功能类别蛋白质在 D0B 和 D0S 中的分布
Fig． 3 The distribution of different functional categories in D0B and D0S
图 4 鉴定蛋白质的等电点分布
Fig． 4 The pI distribution of identified proteins
3 结论与讨论
3. 1 细胞分裂相关蛋白质
形成层的活动起自细胞分裂，同时 Schrader 等
认为木质部细胞在成熟之前也具有一定的分裂能
力( Schrader et al．，2004 )，因此 D0B 和 D0S 均含
有具分 裂 能 力 的 细 胞，细 胞 分 裂 蛋 白 质 ( cell
division control protein，CDC)在 2 个样品中均有表
达，可能与该类蛋白质在细胞分裂周期中的保守
功能有关。此外，核内小分子 GTP 结合蛋白质
Ran 是一个基因表达调控子，它在真核生物中高度
保守，参与调控细胞周期中各个时期的许多细胞
生命活动(Clarke et al．，2001; Nicolás et al．，2001;
Wiese et al．，2001 )。Yano 等 ( 2006 ) 在培养烟草
(Nicotiana tabacum)细胞中发现，甲基 CpG 结合
GTPase-Ran 互作，影响细胞中染色体的移动达到
调控细胞周期; 在本研究中，RanGTP ( 712385，
837084，毛果杨蛋白质数据库蛋白质登录号，下
同)蛋白质在 D0B 和 D0S 中均有表达，可能也与
在细胞周期调控中的复杂机制有关。
3. 2 转录因子相关蛋白质
本研究鉴定出较多的转录因子，在 D0S(未成熟
木质部细胞 ) 中鉴定到 3 个含 LIM ( Lin-Isl-Mec
domain)(814181，663729，649691)结构域的转录因
子表达蛋白，推测含 LIM 结构域的类转录因子参与
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第 5 期 蒋淑磊等: 应用 nanoLC-MS /MS 分析毛白杨次生维管系统的蛋白质表达谱
未成熟木质部分化。同时，该部位还存在 1 个 NLI
(NLI include an N-terminal homodimerization domain
and a C-terminal LIM interaction domain)转录复合
子。研究表明，NLI 在真核生物细胞发育的调节作
用中功能保守，它主要促进启动子和增强子的长距
离互作，并介导转录控制相关分子之间的关联，可能
通过决定 LIM 同源结构域蛋白的互作因子来调节
转录活性(Protopopov et al．，2003)。因此，LIM 同源
结构域蛋白和 NLI 蛋白的同时存在进一步表明它们
在未成熟木质部细胞发育的调控中具有重要作用。
还发现 NAC(NAM，ATAF1 /2 和 CUC2)转录因子家
族蛋白，这些具有转录活性调节结构域的蛋白质在
次生维管发育中具有重要作用(Ohtani et al．，2011;
Wang et al．，2011)。
3. 3 细胞骨架相关蛋白质
微管是细胞骨架的主要成分之一，对于细胞分
裂和次生壁合成都有重要作用，同时在木质部形成
过程中也起到重要作用(Chaffey et al．，1997)。本研
究共鉴定了 2 个微管蛋白(173374，263289)。在高
等植物中存在多种微管关联蛋白 (Hussey et al．，
2002)，本研究中鉴定了 2 个微管关联蛋白 MAP70
家族成员(255343 和 416714)，且均存在于未成熟
木质部一侧(D0S)，该结果与拟南芥木质化细胞中
MAP70 调节细胞次生壁模式形成的现象一致
(Pesquet et al．，2010)，说明其与次生维管组织的分
化、发育有关。此外鉴定了 8 个肌动蛋白，这些肌动
蛋白及其调节蛋白均主要在 D0B 一侧存在，可能参
与形成层细胞分裂过程。
3. 4 信号转导相关蛋白质
研究发现的蛋白质 564011，编码一个黄素腺嘌
呤二核苷酸结合蛋白(DIMINUTO)。在拟南芥中，
通过研究 diminuto 基因突变体发现: diminuto 基因
影响微管蛋白基因 TUB1 并影响植物细胞的伸长
(Takahashi et al．，1995)，且其同源基因 dwarf1 负责
在油菜素内酯合成途径前期将 2，4 －亚甲胆甾醇转
化为菜油甾醇。蛋白质 564011 仅在未成熟木质部
表达，表明它可能通过参与油菜素内酯信号途径影
响未 成 熟 木 质 部 细 胞 的 扩 张。此 外，还 存 在
14-3-3(551637 和 818454) 和 TRIP ( 720028 和
833555)等通过参与油菜素内酯信号途径来影响植
物发育的蛋白质。
钙调素结合蛋白通常含有 1 个螺旋 －卷曲 －螺
旋(helix-loop-helix)结构，1 个或多个 EF 手型(EF-
hand)基序，这些感应元件通常在钙离子浓度瞬间
增加时就感受到( Lecourieux et al．，2006)。作者所
在实验室利用定性蛋白质组学和基因芯片的方法发
现 PtCaM 主要在形成层区域表达，表明它的功能可
能与形成层的发生与活动密切相关 ( Du et al．，
2006; Wang et al．，2009)。在鉴定的钙调素作用相
关蛋白中，蛋白质 648236 是谷氨酸脱羧酶，它与钙
调素结合并调节植物发育的机制已经得到大量报道
(Baum et al．，1993; Zik et al．，2006); 此外蛋白质
736748 和 739211 均属于伴侣蛋白 CPN20 家族，
Yang 等(2000)研究表明，CPN20 与钙调素的结合可
能调节 Rubisco 的组装，该蛋白质在形成层区域和
未成熟木质部中均有表达。钙调素依赖蛋白酶
( calcium-dependent protein kinase，CDPK)既可作钙
感应器又可作效应器(Yang et al．，2003; Itoh et al．，
2011)，本研究中，413635 属于 CDPK 类的蛋白，表
达于形成层区域，同时多种与钙调素存在相互作用
的蛋白质也表达于该区域，因此大量与钙调素存在
相互作用的物质可能共同参与形成层区域细胞的分
裂和分化。
3. 5 细胞壁形成相关蛋白质
细胞壁主要是由纤维和果胶蛋白组成，次生壁
主要是纤维素、微纤丝在初生壁纵向排列或随机排
列堆积的结果，主要发生在木质部径向生长结束后
(Plomion et al．，2001)，研究这些组分是如何相互结
合、相互作用并随着细胞分化和发育等植物的生理
生化变化的，有利于揭示木材的形成机制。本研究
中所鉴定的与纤维素合成有关的蛋白包括直接编码
纤维 素 合 酶 类 ( 246818 ) 和 葡 糖 醛 酸 脱 氢 酶
(706198)以及多个纤维素合成基质，而仅获的 2 个
木质素合成相关蛋白 CCOAMT (649581) 和 COMT
(824484)均只在 D0S 中表达; 在 Zhang 等 (2011)
建立的杨树次生维管系统转录组基因表达谱中也发
现了这 2 个基因，研究结果也揭示了木质化作用主
要发生于未成熟木质部一侧细胞。
在所鉴定到的仅在树皮内侧(D0B)存在的蛋白
质 380 个和仅在树干表面(D0S)存在的蛋白质 216
个，与前人应用蛋白质组学的方法鉴定到的 199 个
蛋白质进行了比较(Du et al．，2006)，钙调素相关蛋
白、木质素合成相关蛋白、NAC 转录因子和热激蛋
白都得到鉴定，也充分说明了本研究系统的可靠性。
本研究中还鉴定到几个新蛋白质，例如 564011，
246818，706198，814181，663729，649691 等，这些新
蛋白质需要做相应的具体功能研究。对鉴定的蛋白
质定制抗体，采用蛋白质免疫组化的方法探索蛋白
质的功能定位，对感兴趣的蛋白质做基因克隆和进
一步的基因功能鉴定研究，为揭示木材形成调控机
15
林 业 科 学 49 卷
制提供基础。
本研究的取样方法，可以将形成层(位于 D0B)
与未成熟木质部(主要在 D0S)分开，但其仍含有已
经初步分化的木质部细胞。因此，本研究获得的
D0B 中特异表达的基因可能参与形成层细胞的分
裂和初步分化，而在 2 个组织表达的基因可能主要
参与未成熟木质部细胞的分化。获得的这些基因还
包括大量的未知基因，需要进一步鉴定其在形成层
活动(木材形成过程)中的作用。
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(责任编辑 徐 红)
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