全 文 ：中国油料作物学报
Chinese Journal of Oil Crop Sciences
2014，36( 1) : 092 － 097
doi: 10． 7505 / j． issn． 1007 － 9084． 2014． 01． 014
防治十字花科作物根肿病的油菜内生细菌分离与鉴定
王会军1，陈卓君1 §，吴毅歆1，2，何鹏飞3，何月秋1，2*
(1．云南农业大学农学与生物技术学院，云南 昆明，650201;2．微生物菌种筛选与应用国家地方联合工程研究中心，
云南 昆明，650207;3．华中农业大学植物科技学院，湖北 武汉，430070)
摘要:为探寻对十字花科根肿病有生防作用的菌株，从油菜根内组织分离内生细菌，通过根肿菌孢子裂解、盆
栽防病试验证明其功能，并经形态学、生理生化和 16S ＲNA基因序列鉴定其分类地位。研究结果表明，从油菜品种
KT1004 和 Y05 － 84 － 5 － 1 根部分离出 51 株内生菌，其中 YN201305 和 YN201310 对十字花科根肿病菌有明显裂解
和抑制作用。盆栽试验表明，应用浓度 107 CFU /mL的菌液，在播种时和播种后每间隔 5d 浇灌 1 次，共浇灌 4 次。
45d苗龄调查结果，二者对大白菜品种鸿源 83 的根肿病防治效果分别达 65． 12%和 77． 92%。经鉴定，YN201305
为短小芽孢杆菌，YN201310 为枯草芽孢杆菌。
关键词:根肿病;油菜;内生细菌;短小芽孢杆菌;枯草芽孢杆菌
中图分类号:S476，S182 文献标识码:A 文章编号:1007 － 9084(2014)01 － 0092 － 06
Isolation and identification of endophytic bacteria from canola
with control effect on clubroot disease of cruciferous crops
WANG Hui － jun1，CHEN Zhuo － jun1 §，WU Yi － xin1，2，HE Peng － fei3，HE Yue － qiu1，2*
(1． College of Agronomy and Biotechnology，Yunnan Agricultural University，Kunming 650201，China;
2． National and Local Joint Engineering Ｒesearch Center for
Screening and Application of Microbial Strains，Kunming 650207，China;
3． College of Plant Sciences and Technologies，Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070，China)
Abstract:To lyze Plasmodiophora brassicae spores and control clubroot disease of cruciferous crops，endo-
phytic bacterial strains were isolated from canola root tissue． The strains were identified by morphological，physio-
logical，biochemical characteristics and 16S ＲNA gene sequencing． The biocontrol function of the strains was
proved through spores lysis and pot experiment． Fifty － one strains were obtained from roots of two canola varieties，
KT1004 and Y05 － 84 － 5 － 1． Among the strains，YN201305 and YN201310 had outstanding effects on lysing P．
brassicae spores and clubroot － control． In pot experiments，YN201305 and YN201310 were used to drench Chi-
nese cabbage (B． rapa cv Hongyuan 83)after seeding and emergency for 4 times every 6d． At 45 － day seedling
stage，the bio － control efficiencies of YN201305 and YN201310 were 65． 12% and 77． 92% respectively． Identifi-
cation results showed that YN201305 was Bacillus pumilus and YN201310 was B． subtilis respectively．
Key words:Clubroot disease;Canola;Endophytic bacterium;Bacillus pumilus;Bacillus subtilis
收稿日期:2013-08-26
基金项目:农业部公益性行业(农业)科研专项(201003029);国家 863 计划(2011AA10A205)
作者简介:王会军(1985 －)，男，黑龙江绥化人，硕士研究生，主要从事分子植物病理学研究，E － mail:772301885@ qq． com;
§陈卓君(1984 －)，女，浙江杭州人，硕士研究生，主要从事植物病理学研究，E － mail:chenzj2ni@ 126． com
* 通讯作者:何月秋(1956 －) ，男，湖北武穴市人，教授，博士生导师，主要从事植物病理学研究，E － mail:ynfh2007@ 163． com
十字花科植物根肿病是由原生生物界菌物芸薹
根肿菌(Plasmodiophora brassiae Woron)侵染引起的
一种土传病害，对十字花科作物为害非常严重。根
肿病在中国大部分省、市、自治区都有分布，特别是
近年来，在我国东北地区，西南地区，长江中上游地
区以及山东青岛等地迅速扩展，危害加剧，严重制约
着我国十字花科蔬菜产业的发展。生产上化学防治
因药效不太稳定或存在负作用，应用面积一直较小。
由于生物防治对环境友好，不易产生抗药性而受到
广泛重视。Narisawa等从大白菜的根中分离并试用
2 株真菌(Heteroconium chaetospira 和 Phialocephala
fortinii )防治根肿病［1，2］;Arie 等 发 现 Phoma
glomerata JWM9972 能够抑制根肿病休眠孢子的萌
发和有效控制根肿病［3］;Cheah 分离链霉菌和木霉
菌亦用于抑制根肿病菌［4］;作者曾从大白菜根际土
壤分离到枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis )XF － 1，
对根肿病的室内防效达 85%，田间防效达 68． 6% ～
84． 8%［5］。虽然已有一些根肿病生物防治的研究
见于报道，但大多处于实验室阶段。同时植物病害
生防细菌绝大多数是从土壤或植物根际土壤微生物
中分离筛选，而由于这些土壤微生物易受外界条件
影响，实际防病效果并不稳定［6］。为了更好地防治
根肿病，作者从十字花科作物油菜中分离内生细菌
并进行鉴定和防病试验，以期从自然界中获得更多
的微生物资源。
1 材料与方法
1． 1 油菜品种及对照菌株
用于内生菌分离的甘蓝型油菜品种为 KT1004
和 Y05 － 84 － 5 － 1;盆栽实验的大白菜品种为鸿源
83;对照生防菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
XF －1(下称 XF －1)。
1． 2 内生细菌的分离
参考 Barzanti 等［7］的方法稍作修改:无菌水洗
净油菜品种根部表面泥土;分别称取 1g根，2%次氯
酸钠溶液表面消毒 30min;无菌水清洗 3 次后，移至
无菌研钵中磨碎;移入装有 10mL的 LB 液体培养基
三角瓶中，37℃、180r /min 摇床培养 2 ～ 3h，使细菌
充分悬浮于培养基中;取 100μL 培养液涂布于 LB
平板上，并取最后一次的清洗水 100μL 涂布于 LB
平板上作对照，37℃恒温培养 24h;选取平板上菌落
形态不同的单个菌落，用灭菌牙签将单个菌落点接
于预先以 105CFU /mL三七根腐病菌(Fusarium sola-
ni)涂布的 PSA平板上，置于 30℃温箱中培养 48h;
挑取有抑菌圈的菌落，分别编号保存。
1． 3 抑制根肿病内生细菌的筛选
1． 3． 1 根肿菌休眠孢子提取 参照杨佩文［8］的方
法。将罹患根肿病的大白菜鸿源 83 的根切碎，加蒸
馏水于组织搅碎机内搅成匀浆，4 层纱布过滤，滤液
移入干净的 50mL 离心管，3 100r /min 离心 15min;
弃上清液，沉淀重溶于 50mL 灭菌水，3 100r /min 离
心 10min，此步操作重复 3 次;弃上清液，沉淀中加
5mL 50%蔗糖溶液，混匀后 3 100r /min 离心 10min，
用移液器把上清液小心移入干净的离心管，加 30mL
灭菌水，3 100r /min离心 10min;弃上清液，沉淀重溶
于 30mL灭菌水，3 100r /min离心 10min，重复操作 2
次;最后用无菌水制成 109 个孢子 /mL 的悬液，4℃
冰箱保存备用。
1． 3． 2 内生细菌菌悬液的制备 挑取平板上的单
菌落细菌于装有 10mL LB 培养基的 100mL 三角瓶
中，置于 37℃摇床上振荡培养 24h 后，取 2mL 菌液
8 000r /min 离心 5min，收集菌体沉淀，用磷酸盐缓
冲液重悬后，再次离心清洗菌体 2 次，最终用 1mL
的磷酸缓冲液将菌体重悬后，放置于 4℃冰箱保存
备用。
1． 3． 3 内生细菌对根肿病菌孢子的裂解作用观察
将预先制备的根肿病菌孢子悬浮液同预处理的菌
悬液等体积混合，立即制片在显微镜下观察，以后每
隔一定时间制片观察，用 XF － 1 及空白磷酸缓冲液
与根肿病菌孢子等体积混合后制片，分别作为阳性
和阴性对照，观察根肿菌孢子的裂解状况。
1． 4 盆栽防病试验
选取田间不含根肿菌的深层土壤，按 20 份土样
加 1 份根肿病根充分混匀，装入上口直径 80． 0cm、
下口直径 75． 0cm、高 20． 0cm的大盆中;播种大白菜
鸿源 83，每盆播种 20 粒，出苗后每盆定苗 15 株。
设 4 个处理，分别为具有裂解根肿休眠孢子功能的
内生细菌 YN201305 和 YN201310 菌株，XF －1 对照
菌株及接种根肿病菌，不加生防菌株的对照(CK)。
每处理 2 盆。
将内生菌分别接种于 250mL的 LB 液体培养基
中，37℃、180r /min下振荡培养 24h。检测菌体浓度
为 108CFU /mL，稀释 10 倍后直接浇灌。在播种时
和播种后每间隔 5d 浇灌 1 次，共浇灌 4 次，不接种
的 LB液体培养基稀释 10 倍后作为对照(CK)处理。
分别在种植后 15d、30d 随机抽取 1 株大白菜，调查
其病害的发生情况。45d拔起剩余的全部大白菜植
株，调查病情。
病情调查分 6 个等级［9］:
0 级:根部无肿瘤;
1 级:侧根有小肿瘤;
3 级:主根肿大，其直径小于 2 倍茎基部;
5 级:主根肿大，其直径是茎基部的 2 ～ 3 倍;
7 级:主根肿大，其直径是茎基部的 3 ～ 4 倍;
9 级:主根肿大，其直径是茎基部的 4 倍以上或
肿大的根部龟裂变黑。
病情及防治效果计算公式:
39王会军等:防治十字花科作物根肿病的油菜内生细菌分离与鉴定
病情指数 =∑(各级病株数 ×相应病级数)
调查总株数 × 9
× 100%
防治效果 =对照病情指数 －处理病情指数
对照病情指数
× 100%
1． 5 形态特征及生理生化测定
参照东秀珠等［10］《常见细菌系统鉴定手册》，对
固氮活性高且稳定的内生细菌 YN201305 和
YN201310 菌株进行形态和生理生化鉴定，以确定其
分类地位。
1． 6 16S rDNA序列测定
细菌 DNA 提取参考 Cheng 等［11］的方法进行。
利用细菌通用引物 P0 (5 － GAGAGTTTGATCCT-
GG CTCAG － 3)和 P6 (5 － CTACGGCTACCTTGT-
TACGA － 3)扩增 16SrDNA 基因片段，预计扩增产
物大小为 1 500bp 左右。20μL PCＲ 反应体系中含
有模板 DNA (10 ～ 50ng /μL)0． 5μL，TaqDNA 聚合
酶 (5U /μL，Transgene)0． 2μL，10mmol /μL dNTP
1． 6μL，10 × Buffer(含 Mg2 +)2． 0μL，10mmol /μL 的
P0 和 P6 各 1． 0μL，补充 ddH2O至总体积为 20μL。
PCＲ 反应程序:94℃ 预变性 5min;94℃ 变性
1min，60℃退火 50s，72℃延伸 90s，30 个循环;72℃
延伸 10min，4℃保存［12］。PCＲ 产物由华大基因公
司完成测序。
1． 7 DNA序列处理
将测序结果用 DNAMAN 软件拼接成完整的序
列，利用 NCBI(http:/ /www． ncbi． nlm． nih． gov)网站
上提供的核酸比对软件 Blastn 对测得的序列进行
Blast。找出其同源序列，进行相似性分析。然后利
用软件 MAGE构建系统进化树，进一步明确该菌株
的分类地位。
2 结果与分析
2． 1 内生拮抗菌筛选
2． 1． 1 抑制根肿病内生细菌筛选 从油菜根部分
离获得 51 株内生菌，从中筛选出具有裂解根肿休眠
孢子功能的 2 株内生细菌，即从 KT1004 分离的菌
株 YN201305 和从 Y05 － 84 － 5 － 1 分离的菌株
YN201310。将 2 个菌株和 XF － 1 菌株悬液分别与
根肿菌孢子悬浮液混合，在立即制片时，3 个生防菌
株处理的根肿菌孢子被凝聚在一起，而空白对照
(缓冲液，CK)的根肿菌孢子在载玻片上较为分散，
至 24h后制片，显微镜下观察到孢子膨胀，细胞壁裂
解，继而消融，内容物外泄，而 CK 中孢子均未发生
变化，仍为近球形(图 1)。证明 YN201305 和
YN201310 两个菌株对根肿菌孢子具有抑制作用。
注:CK指完好的孢子，箭头所指为裂解的孢子 Note:CK:Intact spores;Arrows point to lyzed spores
图 1 内生细菌对根肿病菌孢子的裂解作用
Fig． 1 Lysis of Plasmodiophora brassicae spores by endophytic bacteria
2． 1． 2 内生生防菌对根肿病防治效果 在种植
45d后收起全部 33 株大白菜，统计各处理发病情
况。结果表明，菌株 XF －1、YN201305 和 YN201310
对根肿病均有很好的控制作用，以 YN201310 防效
最佳(表 1 和图 2)。
表 1 不同菌株对大白菜鸿源 83 根肿病的控制效果
Table 1 Control effect of bacterial strains on clubroot
disease of Chinese cabbage Hongyuan 83
效果
Effect
空白对照
CK
生防菌株 Strain
XF － 1 YN201305 YN201310
病情指数
Disease index 37． 23 11． 26 12． 99 8． 23
防治效果
Control effect /% 0 69． 77 65． 12 77． 92
49 中国油料作物学报 2014，36(1)
注:左上:根肿孢子接种(CK) ;右上:根肿孢子接种 + XF － 1;左下:根肿孢子接种 + YN201310;右下:根肿孢子接种 + YN201305
Note:Top left:Inoculated Plasmodiophora brassicae spores;Top right:P． brassicae spores with B． subtilis strain XF － 1;
Bottom left:P． brassicae spores with YN201310;Bottom right:P． brassicae with YN201305
图 2 不同菌株防治大白菜鸿源 83 根肿病效果
Fig． 2 Clubroot disease of B． rapa cv Hongyuan 83 treated with different bacterial strains
表 2 YN201305 和 YN201310 生理生化特性
Table 2 Physiological and biochemical characteristics of YN201305 and YN201310
注:+指 90%菌株为阳性;－指 90%菌株为阴性;d指 11% ～89%为阳性;ND指未测定
Note:+ indicates 90% strain was positive;－ indicates 90% strain was negative;d indicates 11% －89% was positive;ND indicates non － detected
59王会军等:防治十字花科作物根肿病的油菜内生细菌分离与鉴定
2． 2 内生菌的鉴定
2． 2． 1 形态特征及生理生化结果 经菌落形态、菌
体特征以及生理生化结果(表 2)综合分析表明，
YN201305 与 YN201310 均为革兰氏阳性菌;菌株
YN201305 初 步 鉴 定 为 短 小 芽 孢 杆 菌，菌 株
YN201310 初步鉴定为枯草芽孢杆菌。
2． 2． 2 16S rDNA 基因序列测定 从菌株
YN201305 和菌株 YN2013010 PCＲ 扩增的 16S rD-
NA基因片段长度为 1 451bp 和 1 448bp，测序后的
数据提交到 GenBank，并用 DNAMAN 软件分析，前
者登录号为 KF564276，与短小芽孢杆菌的相似度为
99%;后者登录号为 KF564277，与枯草芽孢杆菌相
似度为 99%(图 3)。
图 3 YN201305 和 YN201310 菌株 16S rDNA基因序列系统树
Fig． 3 Dendrogram of YN201305 and YN201310 based on their 16S rDNA sequences
3 讨论
在人们日益重视人与自然和谐相处的今天，研
究和利用植物内生细菌替代或减少农药和化肥的使
用，对改善农业生态系统、保持植物微生态系统的生
物多样性及维护农田生态平衡、实现农业可持续发
展都有重要意义［13］。田间试验表明，大白菜类
(Brassica rapa)比甘蓝类(B． oleracea)更易感根肿
病［14］，国内多数品种均不抗根肿病［15］，甘蓝型油菜
的抗性优于白菜型油菜及大白菜等一类的蔬菜。因
此从甘蓝型油菜中分离内生细菌有望获得控制白菜
根肿病的生防菌株。
本实验从甘蓝型油菜品种 KT1004 和 Y05 － 84
－5 － 1 根部分离获得 51 株内生菌，其中 YN201305
和 YN201310 具有裂解根肿病菌孢子和控制病害作
用;通过形态学、生理生化性状及 16S rDNA 序列鉴
定，将 2 个菌株分别鉴定为短小芽孢杆菌和枯草芽
孢杆菌;YN201310 对大白菜(品种鸿源 83)根肿病
的防治效果达 77． 92%，略高于专利菌株枯草芽孢
杆菌 XF －1。由于内生菌是植物内部生态系的一部
分，上述 2 株内生细菌除具有体外裂解孢子作用外，
是否在植株体内仍然发挥作用尚不明确，它们在施
入土壤后在植株体内定殖动态和能力亦不清楚，待
于进一步研究。
目前在各种农作物及果树等经济作物中发现
54 属的 120 个种内生细菌，大多为土壤微生物种
类，其中假单胞杆菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属
(Bacillus)、肠杆菌属(Enterobacter)以及农杆菌属
(Agrobacterium)最为常见。自 20 世纪中叶起，国外
即已在多种植物中分离到不同种属的内生细菌。国
内相关研究起步较晚，已从水稻、棉花、油菜、番茄、
辣椒、哈密瓜、烟草、富贵竹、甘草、马尾松等不同种
类的植物中分离得到多种内生细菌［16］。然而，大部
分菌株还未用于抑制根肿病菌试验，也未见采用油
菜内生菌控制根肿病的报道。本文从油菜植株体内
分离到的短小芽孢杆菌 YN201305 和枯草芽孢杆菌
YN201310，对于根肿病均有较好的防治效果，且与
笔者所在实验室正在商品化的根围枯草芽孢杆菌
(B． subtilis)XF － 1 防效相当，也与生产上常用的化
学药剂防治效果［17］相当，拓宽了防治根肿病的生防
菌资源，增加了防病选择空间。两种菌具有很好的
内生效果，可能具有更好的定殖能力，在不同生态条
件下起到控制根肿病的效果。XF －1 是一个基因组
完全测序且防治根肿病机制已基本清楚的枯草芽孢
69 中国油料作物学报 2014，36(1)
杆菌［18 ～ 20］，短小芽孢杆菌 YN201305 和枯草芽孢杆
菌 YN201310 是否与 XF －1 有类似的防治根肿病机
制有待进一步研究。
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(责任编辑:郭学兰)
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