全 文 ：　 Ｇｕｉｈａｉａ　 Ａｕｇ. ２０１６ꎬ ３６(８):９６３－９６８
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ＤＯＩ: １０.１１９３１ / ｇｕｉｈａｉａ.ｇｘｚｗ２０１５０４０４０
周健ꎬ 马丹炜ꎬ 陈永甜ꎬ 等. 土荆芥挥发性化感物质对蚕豆叶表皮保卫细胞的影响 [Ｊ]. 广西植物ꎬ ２０１６ꎬ ３６(８):９６３－９６８
ＺＨＯＵ Ｊꎬ ＭＡ ＤＷꎬ ＣＨＥＮ ＹＴꎬ ｅｔ ａｌ. Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｖｏｌａｔｉｌｅ ａｌｌｅｌｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ ｆｒｏｍ Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍ ａｍｂｒｏｓｉｏｉｄｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｓｔｏｍａ ｇｕａｒｄ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｌｅａｆ ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ ｏｆ Ｖｉｃｉａ ｆａ￣
ｂａ [Ｊ]. Ｇｕｉｈａｉａꎬ ２０１６ꎬ ３６(８):９６３－９６８
土荆芥挥发性化感物质对蚕豆叶表皮保卫细胞的影响
周　 健ꎬ 马丹炜∗ꎬ 陈永甜ꎬ 袁立娜ꎬ 黄雪婷ꎬ 瞿欢欢
( 四川师范大学 生命科学学院ꎬ 成都 ６１０１０１ )
摘　 要: 化感作用是外来植物土荆芥(Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍ ａｍｂｒｏｓｉｏｉｄｅｓ)成功入侵的机制之一ꎮ 为了探讨土荆芥挥发
油的化感作用机制ꎬ该文以蚕豆(Ｖｉｃｉａ ｆａｂａ)叶的下表皮为材料ꎬ将表皮条孵育在分别含土荆芥挥发油、α￣萜品
烯和对伞花素的 ＭＥＳ [２￣(Ｎ￣ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ)ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ]缓冲液中ꎬ２５ ℃下光照培养 ３０ ｍｉｎꎬ采用吖啶橙 /
溴乙锭(ＡＯ / ＥＢ)双荧光染色法和 Ｆｅｕｌｇｅｎ染色法ꎬ研究土荆芥挥发油、α￣萜品烯和对伞花素对保卫细胞活性
和细胞核形态的影响ꎮ 结果表明:在土荆芥挥发油、α￣萜品烯和对伞花素的作用下ꎬ蚕豆气孔保卫细胞活性降
低ꎬ细胞核出现固缩、畸形或降解等细胞凋亡特征ꎮ 随着处理剂量增加ꎬ保卫细胞活性显著下降ꎬ核异常率显
著增加ꎬ表明土荆芥挥发油、α￣萜品烯和对伞花素均对蚕豆保卫细胞具有细胞毒性ꎬ其中ꎬ挥发油毒性最大ꎬα￣
萜品烯的毒性次之ꎬ对伞花素的毒性最小ꎻＣａｓｐａｓｅ抑制剂 Ｚ￣ＶＡＤ￣ＦＭＫ可缓解挥发油、α￣萜品烯和对伞花素对
保卫细胞的毒性ꎬ提高细胞活性ꎬ这种缓解效应随着抑制剂浓度的增加而增大ꎮ 由此可见ꎬ土荆芥挥发油、α￣
萜品烯和对伞花素诱导蚕豆保卫细胞发生了 Ｃａｓｐａｓｅ依赖性的细胞凋亡ꎮ
关键词: 土荆芥ꎬ 化感胁迫ꎬ 挥发油ꎬ 保卫细胞ꎬ 细胞凋亡
中图分类号: Ｑ９４６　 　 文献标识码: Ａ　 　 文章编号: １０００￣３１４２(２０１６)０８￣０９６３￣０６
Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｖｏｌａｔｉｌｅ ａｌｌｅｌｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ ｆｒｏｍ Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍ
ａｍｂｒｏｓｉｏｉｄｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｓｔｏｍａ ｇｕａｒｄ ｃｅｌｌｓ
ｉｎ ｌｅａｆ ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ ｏｆ Ｖｉｃｉａ ｆａｂａ
ＺＨＯＵ Ｊｉａｎꎬ ＭＡ Ｄａｎ￣Ｗｅｉ∗ꎬ ＣＨＥＮ Ｙｏｎｇ￣Ｔｉａｎꎬ ＹＵＡＮ Ｌｉ￣Ｎａꎬ
ＨＵＡＮＧ Ｘｕｅ￣Ｔｉｎｇꎬ ＱＵ Ｈｕａｎ￣Ｈｕａｎ
( Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓꎬ Ｓｉｃｈｕａｎ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｃｈｅｎｇｄｕ ６１０１０１ꎬ Ｃｈｉｎａ )
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍ ａｍｂｒｏｓｉｏｉｄｅｓꎬ ａｎ ａｒｏｍａｔｉｃ ｈｅｒｂｎａｔｉｖｅ ｔｏ ｔｒｏｐｉｃａｌ Ｃｅｎｔｒａｌ ａｎｄ Ｓｏｕｔｈ Ａｍｅｒｉｃａꎬ ｈａｓ ｂｅｃｏｍｅ ａ
ｍａｊｏｒ ｉｎｖａｓｉｖｅ ｐｌａｎｔ ｉｎ Ｃｈｉｎａ. Ａｌｌｅｌｏｐａｔｈｙ ｐｌａｙｓ ａ ｃｒｉｃｔｉｃａｌ ｒｏｌｅ ｉｎ ｔｈｅ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ ｉｎｖａｓｉｏｎ ｏｆ Ｃ. ａｍｂｒｏｓｉｏｉｄｅｓꎬ ａｎｄ ｈａｓ
ａｎ ａｌｌｅｌｏｐａｔｈｉｃ ｓｔｒｅｓｓ ｏｎ ｎｅｉｇｈｂｏｒ ｐｌａｎｔｓ. Ｔｏ ｅｘｐｌｏｒｅ ｔｈｅ ａｌｌｅｌｏｐａｔｈｙ ｍｅｃｈａｎｉｓｍꎬ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｖｏｌａｔｉｌｅ ｏｉｌ ｆｒｏｍ Ｃ. ａｍ￣
ｂｒｏｓｉｏｉｄｅｓꎬ α￣ｔｅｒｐｉｎｅｎｅ ａｎｄ ｃｙｍｅｎｅ ｏｎ ｇｕａｒｄ ｃｅｌｌ ｖｉａｂｉｌｉｔｉｅｓ ａｎｄ ｎｕｃｌｅｕｓ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ｉｎ Ｖｉｃｉａ ｆａｂａ ｌｅａｖｅｓ ｗｅｒｅ ｉｎｖｅｓｔｉ￣
ｇａｔｅｄ ｕｓｉｎｇ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｓｔｒｉｐｓ ｂｉｏａｓｓａｙꎬ ＡＯ / ＥＢ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｓｔａｉｎｉｎｇ ａｎｄ ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ Ｆｅｕｌｇｅｎ ｓｔａｉｎｉｎｇ. Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｓｔｒｉｐｓ
ｏｆ ｌｅａｖｅｓ ｗｅｒｅ ｉｎｃｕｂａｔｅｄ ｉｎ ２￣(Ｎ￣ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ) ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ (ＭＥＳ) ｂｕｆｆｅｒ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｖｏｌａｔｉｌｅ ｏｉｌꎬ α￣ｔｅｒｐｉｎｅｎｅ
ａｎｄ ｃｙｍｅｎｅ ｆｏｒ ３０ ｍｉｎ ａｔ ２５ ℃ ｉｎ ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ ｉｎｃｕｂａｔｏｒ. Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｖｏｌａｔｉｌｅ ｏｉｌꎬ α￣ｔｅｒｐｉｎｅｎｅ ａｎｄ ｃｙｍｅｎｅ
收稿日期: ２０１５￣０４￣２７　 　 修回日期: ２０１５￣０９￣０１
基金项目: 国家自然科学基金(３１３７０５４９)ꎻ 四川省教育厅项目(１６ＺＡ００５６ꎬ １６ＺＢ００５８) [Ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｏｆ
Ｃｈｉｎａ (３１３７０５４９)ꎻ Ｄｅｄｕｃａｔｉｏｎ Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｓｉｃｈｕａｎ Ｐｒｏｖｉｎｃｅꎬ Ｃｈｉｎａ (１６ＺＡ００５６ꎬ １６ＺＢ００５８)]ꎮ
作者简介: 周健(１９９０￣)ꎬ男ꎬ甘肃陇南人ꎬ硕士ꎬ主要从事细胞生物学的研究ꎬ(Ｅ￣ｍａｉｌ)１０７６３８７０２９＠ ｑｑ.ｃｏｍꎮ
∗通讯作者: 马丹炜ꎬ博士ꎬ教授ꎬ主要从事植物化感作用等研究ꎬ(Ｅ￣ｍａｉｌ)ｄａｎｗｅｉ１０ｍａ＠ １６３.ｃｏｍꎮ
ｒｅｓｕｌｔｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｃｒｅａｓｅ ｏｆ ｖｉａｂｉｌｉｔｉｅｓ ａｎｄ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｏｆ ａｂｎｏｒｍａｌ ｎｕｃｌｅｉ ｒａｔｅｓ ｉｎ ｇｕａｒｄ ｃｅｌｌ ｏｆ Ｖ. ｆａｂａ ｌｅａｖｅｓ. Ｔｈｅ ｃｙｔｏｔｏｘ￣
ｉｃｉｔｙ ｏｎ ｇｕａｒｄ ｃｅｌｌｓ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｓｕｃｃｅｓｓｉｖｅｌｙ ｆｒｏｍ ｖｏｌａｔｉｌｅ ｏｉｌ ｔｏ α￣ ｔｅｒｐｉｎｅｎｅ ｔｏ ｃｙｍｅｎｅ. Ｔｈｅ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｆｅａｔｕｒｅｓ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ
ｎｕｃｌｅａｒ ｐｙｋｎｏｔｉｃꎬ ｍａｌｐｏｓｉｔｉｏｎꎬ ｓｔｒｅｔｃｈ ａｎｄ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｗｅｒｅ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｉｎ ｇｕａｒｄ ｃｅｌｌ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ ｏｆ ｖｏｌａｔｉｌｅ ｏｉｌꎬ
α￣ｔｅｒｐｉｎｅｎｅ ａｎｄ ｃｙｍｅｎｅ. Ｈｏｗｅｖｅｒꎬ ｔｈｅ ｇｕａｒｄ ｃｅｌｌ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｒａｔｅｓ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｗｈｅｎ ｓｔｒｉｐｓ ｗｅｒｅ ｅｘｐｏｓｅｄ ｔｏ ｖｏｌａｔｉｌｅ ｏｉｌꎬ α￣
ｔｅｒｐｉｎｅｎｅ ａｎｄ ｃｙｍｅｎｅ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ａ ｃａｓｐａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｚ￣ＶＡＤ￣ＦＭＫ. Ｔｈｅｓｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｕｇｇｅｓ￣
ｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｖｏｌａｔｉｌｅ ａｌｌｅｌｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ ｆｒｏｍ Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍ ａｍｂｒｏｓｉｏｉｄｅｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｇｕａｒｄ ｃｅｌｌ ｃａｓｐａｓｅ￣ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ
Ｖｉｃｉａ ｆａｂａ ｌｅａｖｅｓ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍ ａｍｂｒｏｓｉｏｉｄｅｓꎬ ａｌｌｅｌｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｔｒｅｓｓꎬ ｖｏｌａｔｉｌｅ ｏｉｌꎬ ｇｕａｒｄ ｃｅｌｌｓꎬ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ
　 　 气孔对光合作用 ＣＯ２ 的吸收和蒸腾作用水分
的丧失具有调节功能ꎬ因此ꎬ任何改变气孔功能的因
素均会影响光合作用和水分之间的关系ꎬ进而影响
植物的产量(ＭｃＡｉｎｓｈ ｅｔ ａｌꎬ１９９６)ꎮ 气孔保卫细胞
也是植物对外界刺激作出响应的最直接门户ꎬ可对
多种刺激做出反应(魏爱丽等ꎬ２０１４)ꎬ如 ＳＯ２(魏爱
丽等ꎬ２０１４ꎻＷｅｉ ｅｔ ａｌꎬ２０１３)、铝(王毅等ꎬ２０１３)、砷
(薛美昭等ꎬ２０１４)等外界环境胁迫均会诱导气孔保
卫细胞发生死亡ꎬ气体甲醛胁迫增加了蚕豆(Ｖｉｃｉａ
ｆａｂａ)保卫细胞中 Ｈ２Ｏ２ 的积累ꎬ显著降低蚕豆的气
孔导度和开度(孙慧群等ꎬ２０１５)ꎮ 这些研究表明ꎬ
气孔保卫细胞对环境变化反应灵敏是研究环境胁迫
机制的良好材料ꎮ
土荆芥(Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍ ａｍｂｒｏｓｉｏｉｄｅｓ)为藜科藜属
一年或多年生芳香性草本植物ꎬ原产热带美洲ꎬ是我
国危害极严重的外来入侵植物之一 (徐海根等ꎬ
２００４)ꎮ 外来植物在入侵过程中ꎬ向外界释放化感
物质抑制周围植物生长ꎬ是其成功入侵的机制之一
(Ｃｉｐｏｌｌｉｎｉ ｅｔ ａｌꎬ２０１２)ꎬ而细胞毒性是许多化感物质
的一个重要特性(Ｃｉｐｏｌｌｉｎｉ ｅｔ ａｌꎬ２０１２)ꎮ 土荆芥具
有较强的化感作用( Ｊｉｍｅｎｅｚ ｅｔ ａｌꎬ１９９６)ꎬ在其化感
胁迫下ꎬ受体植物的根边缘细胞数量减少ꎬ存活率下
降(李安奇等ꎬ２０１２)ꎻ根尖分生区细胞有丝分裂指
数下降ꎬ微核率和畸变率增加(胡琬君等ꎬ２０１１)ꎬ膜
脂过氧化程度加剧ꎬ抗氧化酶活性受到抑制ꎬ细胞出
现氧化损伤和细胞凋亡现象(胡琬君等ꎬ２０１２)ꎮ 这
些研究结果表明ꎬ土荆芥通过挥发途径释放的化感
物质对周围植物的影响很大ꎮ 植物释放的挥发性化
感物质除了一部分通过淋溶进入土壤影响受体植物
根系外(王朋等ꎬ２００８)ꎬ大部分会释放到空气中作
用于受体植物的地上器官ꎬ尤其是叶片ꎮ 大气中的
物质主要通过叶片上的气孔进入植物体ꎬ而目前有
关土荆芥对气孔的影响报道较少ꎮ 本研究以在土荆
芥入侵地广泛种植ꎬ并且用于观察保卫细胞气孔活
动的模式植物蚕豆(Ｖｉｃｉａ ｆａｂａ)(孙慧群等ꎬ２０１５)为
材料ꎬ采用表皮分析法研究土荆芥挥发油及其两种
主要成分 α￣萜品烯和对伞花素对保卫细胞的影响ꎬ
为揭示土荆芥挥发性物质化感作用机制提供理论
依据ꎮ
１　 材料与方法
１.１ 材料
供体植物土荆芥于 ２０１４ 年 ９ 月下旬采于四川
省成都市锦江区包江桥附近的荒地ꎮ 采用改进后的
水蒸气蒸馏法(Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌꎬ２００９)提取土荆芥挥发
油ꎬ用无水 Ｎａ２ＳＯ４ 除去水分ꎬ得到淡黄色具有强烈
芳香味的挥发油ꎬ测得密度为 ８４３ ｍｇ􀅰ｍＬ￣１ꎮ ４ ℃
保存备用ꎮ
根据文献(魏辉等ꎬ２０１０ꎻ熊秀芳等ꎬ１９９９)报
道ꎬα￣萜品烯和对伞花素为土荆芥挥发油的主要成
分ꎮ 经四川大学测试中心分析鉴定ꎬ供试土荆芥挥
发油中ꎬα￣萜品烯和对伞花素的含量分别为 １５１ 和
１５６ ｍｇ􀅰ｍＬ￣１ꎮ α￣萜品烯和对伞花素的标准品及
Ｃａｓｐａｓｅ抑制剂 Ｚ￣ＶＡＤ￣ＦＭＫ 均购自成都市锐可思
生化试剂公司ꎮ
受体植物蚕豆种子(成胡 １４＃)购于成都市五块
石种子市场ꎮ
１.２ 方法
１.２.１ 材料培养　 挑选大小均一、饱满的蚕豆种子ꎬ
用 ０.５％ ＫＭｎＯ４ 浸泡 １５ ｍｉｎꎬ蒸馏水浸种 ２４ ｈꎬ无光
照 ２５ ℃催芽 ２~３ ｄꎬ待露白后播种于盛有石英砂的
小花盆(直径 １０ ｃｍꎬ高度 ６ ｃｍ)中ꎮ 置于 ２５ ℃、光
暗周期 １４ ｈ / １０ ｈ 的条件下培养ꎮ 幼苗生长期花盆
内 Ｈｏａｇｌａｎｄ营养液(ＣａＮＯ３􀅰４Ｈ２Ｏ ９４５ ｍｇ􀅰ｍＬ￣１ꎬ
ＫＮＯ３ ５０６ ｍｇ􀅰ｍＬ￣１ꎬＮＨ４ＮＯ３ ８０ ｍｇ􀅰ｍＬ￣１ꎬＫＨ２ＰＯ４
１３６ ｍｇ􀅰ｍＬ￣１ꎬＭｇＳＯ４􀅰７Ｈ２Ｏ ４９３ ｍｇ􀅰ｍＬ￣１ꎬ铁盐溶
液 ２.５ ｍＬꎬ微量元素液 ５ ｍＬꎬｐＨ ６.０)保持在 ０.２％ꎮ
４６９ 广　 西　 植　 物　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 ３６卷
图 １　 土荆芥挥发油、α￣萜品烯和对伞花素处理后蚕豆保卫细胞活性变化　 ａ. 对照组ꎻ
ｂ. 气孔单保卫细胞活性丧失ꎻ ｃ. 双保卫细胞活性丧失ꎻ ｄ. 核裂解ꎮ
Ｆｉｇ. １　 Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｇｕａｒｄ ｃｅｌｌｓ ｏｆ Ｖｉｃｉａ ｆａｂａ ｅｘｐｏｓｅｄ ｔｏ ｖｏｌａｔｉｌｅ ｏｉｌ ｆｒｏｍ Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍ ａｍｂｒｏｓｉｏｉｄｅｓꎬ α￣ｔｅｒｐｉｎｅｎｅ ａｎｄ
ｃｙｍｅｎｅ　 ａ. Ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐꎻ ｂ. Ｌｏｓｓｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｓｔｏｍａ ｓｉｎｇｌｅ ｇｕａｒｄ ｃｅｌｌ ｖｉａｂｉｌｉｔｙꎻ ｃ. Ｌｏｓｓｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｓｔｏｍａ ｄｏｕｂｌｅ ｇｕａｒｄ ｃｅｌｌ ｖｉａｂｉｌｉｔｙꎻ ｄ. Ｎｕｃｌｅａｒ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ.
图 ２　 土荆芥挥发油、α￣萜品烯和对伞花素对
蚕豆保卫细胞活性的影响　
Ｆｉｇ. ２　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｖｏｌａｔｉｌｅ ｏｉｌ ｆｒｏｍ Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍ
ａｍｂｒｏｓｉｏｉｄｅｓꎬ ｃｙｍｅｎｅ ａｎｄ α￣ ｔｅｒｐｉｎｅｎｅ ｏｎ
ｇｕａｒｄ ｃｅｌｌ ｖｉａｂｉｌｉｔｉｅｓ ｉｎ Ｖｉｃｉａ ｆａｂａ
待蚕豆长至 ４周左右时取顶端完全展开的叶片ꎬ用
镊子撕取 １ ｃｍ × ０.５ ｃｍ 的下表皮用于胁迫处理
试验ꎮ
１.２.２ 胁迫处理 　 用二甲基亚砜(ＤＭＳＯ)配制挥发
油、α￣萜品烯和对伞花素处理母液ꎮ 将 １０ μＬ 挥发
油用 ＤＭＳＯ稀释至 １００ μＬ 得到 ０.１ μＬ􀅰μＬ￣１的挥
发油处理母液ꎮ 根据 １０ μＬ 挥发油中 α￣萜品烯和
对伞花素的含量ꎬ配制二者的处理母液ꎬ其终浓度分
别为 ０.０１６ ９和 ０.０１８ ６ μＬ􀅰μＬ￣１ꎮ
取 １０ ｍＬ的 ＥＰ 管若干ꎬ分别加入 ５ ｍＬ表皮缓
冲液[５０ ｍｍｏｌ􀅰Ｌ￣１ ＫＣｌꎬ０. １ ｍｍｏｌ􀅰Ｌ￣１ ＣａＣｌ２ꎬ０. １
ｍｏｌ􀅰Ｌ￣１ Ｔｒｉｓꎬ１０ ｍｍｏｌ􀅰Ｌ￣１ ２￣(Ｎ￣ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ)ｅｔｈａｎｅ￣
ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ (ＭＥＳ)ꎬｐＨ７.０]ꎮ 试验共设置三个处理
组ꎬ即挥发油处理组、α￣萜品烯处理组和对伞花素处
理组ꎬ每组再分为甲、乙两组:甲组为处理组ꎮ 取配
置好的处理母液 ２ꎬ４ꎬ６ꎬ８ꎬ１０ μＬ(分别记为梯度 １、
梯度 ２、梯度 ３、梯度 ４、梯度 ５)ꎬ用 ＤＭＳＯ 补充处理
液至 １０ μＬ后ꎬ再分别加入盛有 ＭＥＳ 缓冲液的 ＥＰ
管中ꎮ 每个 ＥＰ 管放入 ６ 个表皮条ꎬ盖上盖子ꎻ乙组
为缓解组ꎮ 分别取 １０ μｍｏｌ􀅰Ｌ￣１和 ４０ μｍｏｌ􀅰Ｌ￣１的
１０ μＬ Ｃａｓｐａｓｅ 抑制剂 Ｚ￣ＶＡＤ￣ＦＭＫ 加入盛有 ＭＥＳ
缓冲液的 ＥＰ 管中ꎬ每个 ＥＰ 管放入 ６ 个表皮条ꎮ ５
ｍｉｎ后分别加入 ８ μＬ 处理液ꎻ甲、乙均设置 ２ 个对
照ꎬ甲组以缓冲液和 ＤＭＳＯ 溶剂为对照ꎬ乙组以缓
冲液和 ８ μＬ 处理母液为对照ꎬ甲、乙两组的 ＥＰ 管
均置于 ２５ ℃下光照培养 ３０ ｍｉｎꎮ 每处理重复 ３次ꎮ
１.２.３ 指标检测　 细胞活性检测:胁迫处理结束后ꎬ
采用马丹炜等(２０１１)的方法略有改进ꎮ 将表皮条
用 ＭＥＳ缓冲液清洗 ３次后ꎬ取出表皮条平铺在载玻
片上ꎬ吸干缓冲液后滴加少许 ＡＯ / ＥＢ 染液ꎬ避光染
色 ５ ｍｉｎꎬ用 ＬＥＩＣＡ ＤＭ３００ 荧光显微镜观察保卫细
胞并拍照ꎮ 具有绿色荧光的为活细胞ꎬ具有橘红色
荧光的为死细胞ꎮ 每个处理观察 １ ０００ 个细胞ꎬ统
计保卫细胞的存活率ꎮ
细胞核异常率检测:胁迫处理结束后ꎬ采用
Ｆｅｕｌｇｅｎ染色法染色(王金发等ꎬ２００４)ꎮ ＭＥＳ 缓冲
液清洗 １次后ꎬ用卡诺氏固定液(冰醋酸 ∶ 无水乙
醇 ＝ １ ∶ ３)固定 ２ ｈꎬ然后放入稀盐酸中 ６０ ℃下解
离 ８ ｍｉｎꎬ蒸馏水清洗 ３ 次ꎬ每次 １０ ｍｉｎꎮ 吸干水分ꎬ
Ｓｃｈｉｆｆ 试剂避光染色 ３０ ｍｉｎꎬ洗掉染液ꎬ ＬＥＩＣＡ
ＤＦＣ４５０Ｃ光学显微镜观察并拍照ꎮ 每个处理组观
察 １ ０００ 个细胞ꎬ统计保卫细胞的核异常率ꎮ
１.３ 数据统计与分析
采用ＳＰＳＳ１７ .０对数据进行处理ꎬＤｕｎｃａｎ法对
５６９８期　 　 　 　 　 　 　 周健等: 土荆芥挥发性化感物质对蚕豆叶表皮保卫细胞的影响
图 ３　 土荆芥挥发油、α￣萜品烯和对伞花素作用下蚕豆保卫细胞核形态的变化
ａ. 对照组ꎻ ｂ. 核固缩和错位ꎻ ｃ. 核拉长和固缩ꎻ ｄ. 核畸形ꎻ ｅ. 核降解ꎻ ｆ. 核消失ꎮ
Ｆｉｇ. ３　 Ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｎｕｃｌｅｕｓ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ｏｆ ｇｕａｒｄ ｃｅｌｌｓ ｉｎ Ｖｉｃｉａ ｆａｂａ ｅｘｐｏｓｅｄ ｔｏ ｖｏｌａｔｉｌｅ ｏｉｌ ｆｒｏｍ Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍ
ａｍｂｒｏｓｉｏｉｄｅｓꎬ ｃｙｍｅｎｅ ａｎｄ α￣ｔｅｒｐｉｎｅｎｅ　 ａ. Ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐꎻ ｂ. Ｎｕｃｌｅａｒ ｐｙｋｎｏｓｉｓ ａｎｄ ｍａｌｐｏｓｉｔｉｏｎꎻ ｃ. Ｎｕｃｌｅａｒ
ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｙｋｎｏｓｉｓꎻ ｄ. Ｎｕｃｌｅａｒ ｍａｌｆｏｒｍａｔｉｏｎꎻ ｆ. Ｎｕｃｌｅａｒ ｄｉｓａｐｐｅａｒａｎｃｅ.
各处理组细胞存活率和细胞核形态异常率进行比较
分析ꎬＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ ２００７ 作图ꎮ
２　 结果与分析
２.１ 土荆芥挥发油及其两种主要成分对保卫细胞活
性的影响
经 ＡＯ / ＥＢ 染色后在荧光显微镜下观察表皮条
发现ꎬ对照组中大部分保卫细胞的细胞核发亮绿色
荧光(图 １:ａ)ꎬ具有较高的活性ꎬ而处理组则随着处
理剂量增加ꎬ发出橘红色荧光(图 １:ｂ￣ｃ)细胞核的
数目随之增加ꎬ即丧失活性的细胞数目在增加ꎬ并且
出现细胞核降解红色荧光消失(图 １:ｄ)的情况ꎬ说
明土荆芥挥发油、α￣萜品烯和对伞花素均可以诱导
保卫细胞死亡ꎮ
从图 ２ 可以看出ꎬ与对照相比ꎬ溶剂 ＤＭＳＯ对保
卫细胞活性没有显著影响ꎮ 土荆芥挥发油、α￣萜品
烯和对伞花素均导致保卫细胞活性降低ꎮ 在挥发油
处理组中ꎬ细胞活性随着挥发油处理剂量增加而显
著下降(Ｐ<０.０５)ꎻα￣萜品烯处理组中ꎬ处理梯度 １ ~
３ꎬ随处理剂量的增加保卫细胞活性显著下降趋势
(Ｐ<０.０５)ꎬ但随着处理剂量进一步增加细胞ꎬ存活
率趋于稳定ꎻ对伞花素处理组中ꎬ除了处理梯度 １ 的
细胞存活率与对照组无显著差异ꎬ其余处理均随着
处理剂量增加细胞活性逐渐下降(Ｐ<０.０５)ꎻ比较 ３
个处理组发现ꎬ处理梯度 ５ 的细胞存活率为挥发油
(５.０％)<α￣萜品烯(１８.０％) <对伞花素(３４.８％)ꎬ由
此可见ꎬ土荆芥挥发油对蚕豆保卫细胞的毒性最大ꎬ
α￣萜品烯次之ꎬ对伞花素的毒性最小ꎮ
２.２ 土荆芥挥发油及其两种主要成分对保卫细胞核
形态的影响
土荆芥挥发油及其两种主要成分 α￣萜品烯和
对伞花素对保卫细胞核形态具有显著的影响ꎮ 经
Ｓｃｈｉｆｆ试剂染色后ꎬ光学显微镜镜检发现ꎬ对照组保
卫细胞的核位于细胞中间ꎬ形态规则(图 ３:ａ)ꎻ而经
挥发油、α￣萜品烯和对伞花素处理后ꎬ保卫细胞的核
形态不规则ꎬ并出现明显的细胞程序性死亡特征如
核错位、固缩、拉长或降解(图 ３:ｂ￣ｆ)ꎮ
在土荆芥挥发油及其主要成分作用下ꎬ保卫细
胞核异常率的变化如图 ４ 所示ꎮ 从图 ４ 可见ꎬ较低
６６９ 广　 西　 植　 物　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 ３６卷
图 ４　 土荆芥挥发油、α￣萜品烯和对伞花素对蚕豆
保卫细胞核形态的影响
Ｆｉｇ. ４　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｖｏｌａｔｉｌｅ ｏｉｌ ｆｒｏｍ Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍ
ａｍｂｒｏｓｉｏｉｄｅｓꎬ ｃｙｍｅｎｅ ａｎｄ α￣ｔｅｒｐｉｎｅｎｅ ｏｎ
ｎｕｃｌｅｕｓ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｖｉｃｉａ ｆａｂａ ｇｕａｒｄ ｃｅｌｌｓ
图 ５　 Ｃａｓｐａｓｅ抑制剂对土荆芥挥发油、α￣萜品烯和
对伞花素细胞毒性的缓解效应
Ｆｉｇ. ５　 Ａｌｌｅｖｉａｔｅｄ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｃａｓｐａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｎ ｔｈｅ
ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ ｖｏｌａｔｉｌｅ ｏｉｌ ｆｒｏｍ Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍ
ａｍｂｒｏｓｉｏｉｄｅｓꎬ α￣ｔｅｒｐｉｎｅｎｅ ａｎｄ ｃｙｍｅｎｅ
处理剂量(梯度 １ 和梯度 ２)ꎬ各处理组细胞核的形
态异常率与对照组、溶剂对照组均没有显著差异ꎮ
但随着处理剂量进一步增加(>梯度 ３)ꎬ细胞核异常
率随之增加ꎬ并与对照呈现显著性差异(Ｐ<０.０５)ꎮ
比较三个处理组的保卫细胞异常率可见ꎬ挥发油处
理过的保卫细胞异常率最大ꎬα￣萜品烯次之ꎬ对伞花
素最小ꎮ
综上所述ꎬ土荆芥及其主要成分均诱导了保卫
细胞核出现异常现象ꎬ可能导致了保卫细胞发生程
序性细胞死亡ꎮ
２.３ Ｃａｓｐａｓｅ抑制剂对土荆芥化感胁迫的缓解效应
图 ５显示ꎬ当处理液中加入 Ｃａｓｐａｓｅ 抑制剂后ꎬ
保卫细胞存活率增加ꎬ且抑制剂浓度越大ꎬ细胞活性
越高ꎮ Ｃａｓｐａｓｅ是与程序性细胞死亡密切相关的蛋
白水解酶ꎬ加入 Ｃａｓｐａｓｅ 抑制剂后ꎬ由土荆芥挥发
油、α￣萜品烯和对伞花素诱导的保卫细胞死亡现象
明显减弱ꎬ由此可以证明ꎬ土荆芥及其主要成分诱导
的保卫细胞死亡属于细胞凋亡ꎮ
３　 讨论
３.１ 土荆芥挥发性化感物质诱导保卫细胞凋亡
细胞毒性是某些化感物质的重要特性(Ｂａｂｕｌａ
ｅｔ ａｌꎬ２０１０)ꎬ如许多入侵植物会释放胡桃醌、白花丹
素等萘醌类化感物质ꎬ这些物质导致烟草(Ｎｉｃｏｔｉａｎａ
ｔａｂａｃｕｍ)ＢＹ￣２ 细胞发生结构、功能以及酶的变化ꎬ
细胞出现类凋亡特征(Ｂａｂｕｌａ ｅｔ ａｌꎬ２００９)ꎮ 土荆芥
挥发油导致蚕豆根尖细胞 ＤＮＡ发生特异性降解ꎬ形
成 ＤＮＡ￣Ｌａｄｄｅｒꎬ随着挥发油剂量增大和作用时间延
长ꎬ细胞凋亡过程加剧(胡琬君等ꎬ２０１１)ꎮ 此外ꎬ化
感物质还具有明显的遗传毒性ꎬ导致受体细胞发生
ＤＮＡ损伤、基因突变、染色体畸变、有丝分裂受阻等
(马丹炜等ꎬ２０１５)ꎮ 本研究结果表明ꎬ土荆芥挥发
油及其两种主要成分 α￣萜品烯和对伞花素对均具
有明显的细胞毒性ꎬ随着三者处理剂量增加ꎬ蚕豆叶
下表皮保卫细胞活性下降甚至死亡ꎬ细胞核均出现
了核畸形、固缩和降解等细胞凋亡的典型特征(Ｖａｎ
Ｄｏｏｒｎ ｅｔ ａｌꎬ２０１１)ꎬ 保卫细胞的核异常率随着处理
剂量增加而增大ꎮ Ｃａｓｐａｓｅ 对底物的切割使细胞呈
现出凋亡的一系列形态学和分子生物学特征(翟中
和等ꎬ２０１１)ꎬ而 Ｚ￣ＶＡＤ￣ＦＭＫ 是一种可以穿透细胞
膜的泛 Ｃａｓｐａｓｅ抑制剂ꎬ能明显抑制 Ｃａｓｐａｓｅ 活性而
减少细胞凋亡ꎮ 本研究结果表明ꎬ当在处理液中加
入 １０和 ４０ μｍｏｌ􀅰Ｌ￣１的 Ｚ￣ＶＡＤ￣ＦＭＫ 溶液后ꎬ细胞
存活率显著提高ꎬ由此可见ꎬ土荆芥挥发油、α￣萜品
烯和对伞花素诱导蚕豆保卫细胞发生了 Ｃａｓｐａｓｅ 依
赖性的细胞凋亡ꎮ
３.２ 土荆芥挥发油及其两种主要成分的化感胁迫
土荆芥释放到周围环境中的挥发性化感物质除
了少部分随淋溶或土壤吸附进入土壤外ꎬ大部分会
挥发到大气中ꎬ作用于植物体的地上部分ꎬ尤其是叶
片ꎮ 根据上述分析可知ꎬ在土荆芥挥发油及其主要
成分 α￣萜品烯和对伞花素作用下ꎬ蚕豆叶保卫细胞
７６９８期　 　 　 　 　 　 　 周健等: 土荆芥挥发性化感物质对蚕豆叶表皮保卫细胞的影响
发生了凋亡ꎮ 从进化角度来看ꎬ细胞凋亡是植物在
长期的逆境中获得的一种适应性机制ꎮ 受胁迫组织
通过局部细胞死亡而主动形成一道死亡细胞屏障ꎬ
避免对其他组织的进一步侵害ꎬ此外ꎬ死细胞的
ＤＮＡ可主动降解为核苷酸ꎬ以便植物重新利用或者
用来修复逆境胁迫所带来的伤害(肖军等ꎬ２００８)ꎮ
气孔保卫细胞也是植物对外界刺激做出响应的最直
接的门户(魏爱丽等ꎬ２０１４)ꎬ当受到土荆芥挥发性
化感物质胁迫时ꎬ保卫细胞通过凋亡以阻止这些化
感物质进一步伤害叶肉组织ꎮ 最大处理剂量作用
下ꎬ挥发油处理组、α￣萜品烯处理组和对伞花素处理
组的细胞存活率分别为 ５.０％、１８.０％和 ３４.８％ꎬ而核
异常率分别为 ８０.２％、５１.４％和 ３７.４％ꎬ三者的化感
效应强度依次为挥发油>α￣萜品烯>对伞花素ꎮ 植
物释放的化感物质不是单一的ꎬ化感物质之间也存
在着协同、拮抗或简单的加合作用 (孔垂华等ꎬ
１９９８)ꎮ 土荆芥挥发油是由多种物质组成的混合
物ꎬ本研究结果表明ꎬ与土荆芥挥发油主要成分 α￣
萜品烯和对伞花素相比ꎬ挥发油的化感效应强度明
显较大ꎬ表明土荆芥通过挥发途径释放的包括 α￣萜
品烯、对伞花素在内的多种化感物质之间可能存在
着协同或加合作用ꎮ
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(下转第 ９９２页 Ｃｏｎｔｉｎｕｅ ｏｎ ｐａｇｅ ９９２ )
８６９ 广　 西　 植　 物　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 ３６卷