全 文 ：!基金项目：福建省科技厅重点项目（#$%&’()*+,’，&&*)*+&-）。
林 毅：男，+&,. 年生，博士，现在华侨大学生物工程与技术系工作。
// 通讯作者。0123#4%5#4%6#44789#:;7:67$<=>?@ABC<<<<<收稿日期CKGGK*+K*-G<<<<接受日期CKGG-*+G*G’
农业生物技术学报 L#14:@B<#5<0M4A61B214@B·研究论文·
快速获得葫芦科核糖体失活蛋白新基因 /
林 毅 陈国强 吴祖建 林奇英 //%%%%谢联辉
（ 福建农林大学植物病毒研究所，福州 -RGGGK%）
摘要C%%根据葫芦科核糖体失活蛋白S4AT#8#?7>A:@62AU@2A:M%94#27A:，VWXY上、下游两段高度保守的氨基酸序列设计简并引物
对 Z[+\Z[K，对基因组 ]0 进行 X^V 扩增，快速获得了 - 种 VWX 新基因，分别是冬瓜SN7:A:6@8@ 3A89A;@S0_OR-,,,Y、南瓜S^1614TA2@ ?#863@2@代表 VWX 对应区段的同源性分别为C<24A63#8@:23A: S.+‘、.&a和 RRaY、# >?#?#463@4A: S.-a、,Ka和 .&aY、# >B155A:%S,Ka、’-a
和 ,KaY、VWX%54#? ^161?A8 5AM@47A%S’Ga、.&a和 ,&aY、8763A1?A:%SO-a、O-a和 OOaY以及 T4F#;A:%+S.Ka、.Ra和 R’aY。葫芦科
VWX 的 Z[+\Z[K 区段存在 O- 个完全一样的氨基酸残基，其中 ’ 个残基在其它科属来源的 ’ 个!型和 - 个型 VWX 中也完全
保守，包括构成活性中心的 ! 个关键残基。
关键词：葫芦科；核糖体失活蛋白新基因；快速筛选
V@9A;%b6477:A:M%5#4%#U7B%c7:78%#5%VAT#8#?7>A:@62AU@2A:M
%X4#27A:%54#?%^1614TA2@67@7
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94#27A:8，VWX） 是一大类具有 4V0<* 糖苷酶结构
域的蛋白质，广泛存在于高等植物中。传统上，根据
结构的不同将其分为!型单链 VWX 和型双链 VWX
两种，其中型双链 VWX 的 0 链在结构和功能上与
!型单链 VWX 相似，其 N 链具有凝集素性质q+PKr。以
VWX 为“弹头”的免疫毒素在肿瘤、骨髓移植、自身
免疫及爱滋病S0W]bY等疾病的治疗方面有着潜在的
应用前景，有些在临床应用实验中取得了令人瞩目
的进展q-QRr。此外，VWX 具有广谱的植物病毒抗性和抵
抗多种植物病原真菌以及农业害虫的活性，在植物
保护方面具有广阔的应用前景q.Q++r。
第 !期 林 毅等：快速获得葫芦科核糖体失活蛋白新基因
葫芦科#$%&%’()*+&,+,-植物大多药、食同源，具
有非常诱人的开发价值。目前从葫芦科植物中分离
到的 ./0 种类最多1表 !-，其中具有抗 2/3 活性的
就有 4种56，78。
本研究在对已知的葫芦科 ./0 氨基酸序列进
行系统比较的基础上，利用简并 0$. 进行葫芦科
./0 新基因的快速筛选，得到了 6 种新基因，并将其
编码区与葫芦科 4 个代表 ./0 对应区段进行了比
较。这一结果为快速获得 ./0 新基因提供了新途
径，并有助于更好地了解 ./0 的结构和功能关系以
及 ./0的分子进化。
!!!!!材料和方法
!9!:材料
!9!9!植 物 冬 瓜 1;,<)<&+=+ >)=?)@+ -、 南 瓜
1$%&%’()*+ AB=&>+*+ -、西瓜1$)*’%CC%= C+<+*%=:-、黄瓜
1$%&%A)= =+*)D%=:-、苦瓜1EBAB’@)&+ &>+’+<*)+:-、丝
瓜1F%GG+ &HC)<@’)&+:-、棱角丝瓜#F%GG+ +&%*+佛 手 瓜 #J,&>)%A ,@%C,: -、 罗 汉 果 #EBAB’@)&+
I’B=D,#K’)&>B=+<*>,= +种葫芦科植物采自福建农林
大学校园。
!9!9L::::引物 根据葫芦科
./0 上、下游两段高度保守的
氨基酸序列 #对应成熟 K$J
的 44MN6 和 !OPMLQL 位置-及
其密码子偏好设计简并引物
对，提交上海生工生物工程技
术服务有限公司合成，用以
./0新基因的快速筛选。序列
如下：
FR!：PSTUK5VWU8V$5UW$WV8VV5$W
K8UK5$WK8KV5KW$8/K/VKUUUT6S；
FRL：PST 5$WUWK8U$ 5VWKW$8V 5VWK8/
5VWK85UWV8/VK5KW$8KU5KW$8KKUT
UV/VUT6S。
!9L方法
!9L9!0$. 扩增 以 $KV;
法提取的绞股蓝总 XYV 为
模 板 ， 在 K6 K>,’AB&H&C,’
1;)BA,*’+.- 基因扩增仪上进
行 KB%&>T@BZ<0$. 扩增，反
应程序为 [ O7!变性 PQ=，
47M7\!退火 PQ= 1每 L 个循环降 L!，7\!时 !N
个循环-，NL!延伸 LA)<。
!9L9L克隆和序列分析 回收纯化后的 0$. 产物
与 ?EX!\TK载体连接（K+]+.+ 产品），转化大肠
杆菌（^=&>,’)&>)+ &BC):）X2P! ，经重组鉴定后的阳
性克隆子由上海生工生物工程技术服务有限公司进
行序列测定。利用 Y$;/ 的 ;FVJK 和 ^;/ 的
$F_JKVF:‘软件进行序列分析。
L 结果和分析
L9!::::葫芦科 ./0 新基因的快速筛选
在对已知的葫芦科 ./0 氨基酸序列进行系统
比 较 的 基 础 上 ， 选 择 设 计 了 一 对 简 并 引 物
FR!WFRL，以基因组 XYV 为模板进行 0$. 扩增，研
究葫芦科中 ./0 基因的分布情况。结果表明，供试
的 !! 种葫芦科植物均出现目的扩增产物 （图 !），
其中 4 种未报道有 ./0 或其基因，暗示葫芦科中蕴
藏着极其丰富的 ./0 新基因。将其中的冬瓜和南瓜
的扩增产物与 ?EX!\TK 载体 （K+]+.+ 产品）连
接，转化大肠杆菌 X2P! ，酶切鉴定后（图 L）进行
表 ! 葫芦科中核糖体失活蛋白及其基因的分布
K+(C,:!:X)=*’)(%*)B<:BG:4:*H?)&+C:+<@:6:+AB属别 种名 ::::::::::::./0 和基因 缩写 登录号或参考文献
U,<,’+ ::::::J?,&),=:::::::::::./0:+<@:./0:I,<,=:::V((’,D)+*)B<=:::V&&,==)B<:<%A(,’=:B’:’,G,’’,<&,=
栝楼属 ::::::栝楼 *’)&>B=+<*>)< K$J ::::::::::::::::::::E67\PK’)&>B=+<*>,= :: K9a)’)CBZ))
苦瓜属 ::::::苦瓜 ! TABAB’&>+’)< EbE! cPN4\L
EBAB’@)&+ E9&>+’+<*)+
丝瓜属 ::::::丝瓜 ! TC%GG)< F_d! ::::::::::::::::::::c4L6N!
F%GG+ :::::: F9&HC)<@’)&+C
黄瓜属 : $9G)I+’,) ./0:G’BA:$9G)I+’,) $_$ ::::::::::::::::::::V;Q7PP4Q
$%&%A)= ::::::
佛手瓜属 佛手瓜 : =,&>)%A)< J^$ ::::::::::::::::::::‘%:,*:+C95!L8:
J,&>)%A : J9,@%C,
泄根属:: :::::异株泄根 : (’HB@)< ! ;X! ::::::::::::::::::::F7LLO;’HB<)+ ;9@)B)&+
冬瓜属 冬瓜 (,<)<&+=)< ;^Y ::::::::::::::::::::Vd7P6NNN
;,<)<&+=+ :: ;9>)=?)@+
南瓜属 :::::南瓜 : AB=&>+*)< EbJ! ::::::::::::::::::::Vd74L67O
$%&%’()*+ $9AB=&>+*+
南瓜属 :::::南瓜 : AB=&>+*)<# EbJL ::::::::::::::::::::VdPQ7Q!!
$%&%’()*+!!: $9AB=&>+*+
O
农 业 生 物 技 术 学 报 !# 年
序列测定。$%&’(分析表明，测定的 ) 个冬瓜来源
的克隆子和 ! 个南瓜来源的克隆子均为新的 *+,
基因片段，长 #-./01，编码 234 个氨基酸，分别命名
为 0567689:76、;<:8=9>76!和 ;<:8=9>76，?56$96@
登录号分别是 &A#B3CCC、&A#4!3#D和 &AB#22。
图 2E/葫芦科 *+, 基因片段的 ,F* 扩增产物凝胶电泳分析
A7GH)H/IJ58>K<1=:PMK<;/FO8OK07>98595/
Q，分子量标准R/)，阴性对照R/!S)!，各种葫芦科植物。
Q，#TU&/8J59V5N/W7>=/X76N$YI87V5/8<6>KFO8OK07>98595/1J96>:!
图 !H//重组质粒的酶切分析
A7GH!H//*5:>K78>7<6/969JL:7://1J9:;7N:
Q，分子量标准；)S3，重组质粒的 ,:>!Y/$9; X!双酶切分析。
Q，#TU&/8J59V5N/W7>=/X76N$ 96N/I8/
1J9:;7N:/8J59V5N/W7>=/,:>! 96N $9;/X!H
!H!////3 个 *+, 新基因片段的编码区与葫芦科 4 个
代表 *+,对应区段的比较
应用 FJO:>9J/Z 软件对 3 个 *+, 新基因片段的
编码区与葫芦科 4 个代表 *+, 对应区段进行了多
序列比较[图 3\，发现 D 个残基完全相同的有 #3 个
[]\，其中有带电荷的极性残基 &KG2!!，243、%L:2! 和
?JO24，24.；有不带电荷的极性残基 (LKC，C#，.2，2C，222、
?J62BB，2D.，!、&:64.，22，2D、’5K2.C，2D3，2D4和 (K12D!；以及非极
性残基 ,=5.!，D4、?JL2!.、%5O22#，2..，2DB、&J9..，D2，22.，23B，2#C，2.#，!!、
+J52!B，234，2BB，24C，2DD/、^ 9J44，4D，2B3和 ,K<2-B，2.2。这 3 种类型的
残基在 *+, 结构与功能的关系中所起的作用是不
同的。 其中 . 个残基在其它科属来源的 . 个!型
和 3 个型 *+, 中也完全保守 _2!‘，包括 # 个构成活
性中心的残基 [&KG2!!、?J62B4、?JO24-、#$%&’和 (K12D!\，
而第 B 个可能参与构成活性中心的酸性残基 ?JO2.D
在 :58=7O;76 中被不带电荷的极性残基 ?J6 所替
代。活性中心序列附近存在着几个保守的非极性氨
基酸，它们对稳定活性中心起了一定的作用。.个残
基相同的有 !D 个[a\，其中唯一不同的残基大多发
生在 :58=7O;76上。
对应成熟 (F’的活性区段“+b’(’I&&*cdA+
Ibb+”[2BBS2C2，阴影部分\，4 个残基完全一样，其
余 22个残基高度同源。结合其它科属来源的 *+,，!
个残基[?JO24和 &KG243\完全保守，另外 # 个非常保
守 _#，2!‘，最显著的变异发生在 0KL疏水的 &J9 变成亲水的 ’5K，这和 ?9WJ9@ 等 _#‘的报
道一致。
序列同源性进一步证实，本研究所获得的 3 个
序列是 *+,新基因[表 !\。0567689:76与葫芦科 4 个
代表 *+, 的同源性为 #3eS.-f，;<:8=9>76 !为
#3fS.3f，;<:8=9>76为 ##fSCDf。同为南瓜来源
的 ;<:8=9>76 !和 ;<:8=9>76/之间的同源性并不
高，仅为 4Df，远低于 ;<:8=9>76 !与 %g!##$% 之间
高达 .3f的同源性，表明葫芦科 *+, 的演化与其来
源植物的亲源关系并不一致。
表 ! 葫芦科 #$ 新基因片段推导的氨基酸与其它 % 个代表
的对应区段的同源性
(90J5/!/(=5/=<;:/W7>=/>=5/
8L1789J/*+,:/MK<;/FO8OK07>98595
基因缩写见表 2。&00K5V79>7<6:/3 讨论
分离一种新型的 *+, 费时费力，而且植物体内
(F’ $IU Qh’! Qh’ QhQ2 %iA2 FiF ’IF $T2
(F’ ///42 /////4D ///////BB C- ///4D ///4! B2 D-
$IU /////C- ///////CD 43 ///C! ///.- #3 4!
Qh’2////////////////////////////////////////4D C! ///.3 ///4D #3 4B
Qh’! 4D ///C! ///CD ## B.
QhQ2 ///C4 ///44 ## C-
%iA2 ///C! ///B- 4D
FiF ///#B 4B
’IF #C
2-
第 !期 林 毅等：快速获得葫芦科核糖体失活蛋白新基因
图 #$%葫芦科 &’( 新基因片段推导的氨基酸与其它 ) 个代表的对应区段的比较
*+,-#-./0123+4/5%/6789:9:;<9:20+5/2<+:49=;95<94/6#5/>9?%&’(%632,09574%@+78%789%63/0%.;<;3B+72<929
*3/0%8771CDD@@@-9B+-2<-;EF%789%49=;95<9%2?+,50957%@24%<233+9:%/;7%@+78%.GHIJKG%L%M!-N!O-P24894:95/79,214+573/:;<9:7//B72+502Q+02?
8/0/?/,A-J89+:957+<2?20+5/2<+:394+:;94239023E9:BA24793+4E4RSTU@8+?9NDVW+:957+<2?023E9:BA1?;4RXT-
&’( 的含量一般偏低，无法满足大规模应用的需要。
&’( 基因是构建抗病毒转基因植物和单链免役毒素
的重要基因资源。因此，直接分离 &’( 新基因具有
重要意义。原先设想设计一对 “植物 &’( 通用引
物”，用于筛选任一植物的 &’( 新基因。因不同科别
的植物 &’( 差异很大，这一设想未能成功。而拥有
众多成员的葫芦科植物 &’( 之间的同源性较高，可
以从中选择设计一对“葫芦科 &’( 保守引物”，开展
&’( 新基因的快速筛选。应用这种方法，本研究成功
地分离了 # 个 &’( 新基因。这一结果为快速获得
&’( 新基因提供了新途径，与以往先分离 &’( 后克
隆其基因的路线正好相反YZ，![\。
由于!型 &’( 与型 &’( 的 K 链具有较高的
同源性，因此尽管葫芦科中的型 &’( 还没有报道
R8771CDD@@@-5T，但本法所获得的基因
序列为型 &’(K 链编码区的可能性仍然存在。
结 合 限 制 性 片 段 长 度 多 态 性 （39473+<7+/5
632,0957?95,781/?A0/318+40，&*G(）和单链构象长
度多态性（4+5,?9]47325:40，II.(）技术，可对本研究建立的快速筛选方法
加以进一步完善。根据同一植物来源的不同 &’( 基
因 G^!DG^[ 区段的 &*G(，建立 (.&]&*G( 鉴定系
统，可鉴别已知的和新的 &’( 基因，快速分析该植
物中的 &’( 基因家族组成。应用 (.&]II.( 技术对
扩增产物进行分析，可以确定植物中 &’( 家族的成
员数，避免重复测序，降低成本。
南瓜中至少存在 [ 个不同的 &’( 基因，这与一
些 &’(为多基因家族所编码现象一致Y!#\。植物采用
!!
农 业 生 物 技 术 学 报 !# 年
多基因家族编码 $%& 可能具有进化上的优势，体现
在：!适应多种生理功能的需要，家族的不同成员具
有各自独特的酶学活性和功能 ’(#)；增强抗病力的
需要，受侵染时，植物细胞可快速产生足够数量的
$%&；#便于宏观调控，有的组成型表达、有的应急
（病原侵染或不良环境）时才表达，有的在特定的器
官组织中表达、有的在整个植物体内表达。
*+(,*+! 区段约占成熟 $%& 的一半，是最为保
守的部分。有报道表明 -! 种不同来源的 $%& 中高
度保守的 !. 个氨基酸残基中有 !/ 个分布在
*+-,*+! 区段内，而且它们的分布具有一定的区域
性’.)。所以对 *+-,*+! 区段进行的比较有助于更好
地了解 $%& 的结构和功能关系以及分子进化。
参 考 文 献
-00 1234560 780 9:4;36430 *80 9:226<<30 =0 >80 620 :3C:D23E:23CF0 54@263CA0 G4@B0 5<:C2A?0 93@,H6DI80 -JJ!8 0 -KL
#MN#-!0
!009:4;36430*80 9:26<<30>0980 12345607?0 $3;@A@B6O3C:D23E:23CF0
54@263CA0G4@B05<:C2A?0 93@DI3B093@5IPA0QD2:80 -JJ.80 --M#L
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#00>:[<:\010*80 ]6^;:^640=80 _<630‘0a80 620:;3@<@F3D:<80:CX0546<3B3C:4P0A24^D2^4:<0:C:;4P@X3C -80 :0 43;@A@B6O3C:D23E:23CF0 54@263C0 G4@B0 2I60 5<:C20
94P@C3: X3@3D:?093@DI6B3A24P80-JJR80.bL.KJMN.-K.
M00c:4<3CF0W0=80=@4:C0&0Q80 ‘:GG:40d80 620:465<3D:23@C0 ;P0 5@\6[66X0 :C23E34:<0 54@263C0 2:4F626X0 2@0Zf#Z0
D6<b00ZI6C0+80&6^B:CA0T0W80E:C0f:BB60a0W?0HI601:B;^D^A C3F4:0
2P56O!0 43;@A@B6O3C:D23E:23CF0 54@263C0 1]QO%g0 6hI3;32A0 3C0
5<:C2:0 :C23E34:<0 :D23E32P0 3C0 24:CAF6C3D0 2@;:DD@?0 7a910 *6228
!KK!80M-bU-N.VL!RN.K
R00‘@CF0+80 1:^CX64A0_80 ‘:42<6P0=0$80 620:F6B3C3E34^A03CG6D23@C0;P0E34^AO3CX^D6X06h546AA3@C0@G0X3:C2I3C0
3C024:CAF6C3D05<:C2A?0e34@<@FP80-JJb80!!KU-VL--JN!R
S00*@XF60W0_80_:C36[A\30T0_8H^B640]0a?094@:XA56D24^B0E34^A0
46A3A2:CD603C024:CAF6C3D05<:C2A06h546AA3CF05@\6[66X0:C23E34:<0
54@263C?0&4@D0]:2<0QD:X01D30i1Q80-JJ.80JKLRKSJNRKJ.
J00‘601OW U何锶洁V8j^0kO7 U徐琼芳V8H:CF0cO1 U唐祚舜V8620:H43DI@A:C2I6A \343<@[3302I3DI@A:C2I3C0D@CG64A02@046A3A2:CD602@0
43D60 A26B0 ;@464A0 :CX0 43D60 5<:C2I@5564A0 3C0 24:CAF6C3D0 43D6?0
‘3FI0H6DIC@<0*622 U高技术通讯V80 !KKK80 (K UMVL0 SN(KU3C0
ZI3C6A60[32I0aCF<3AI0:;A24:D2V
(K0T:CF0&80 c@^;6C\@0d8H^B640]0a?0 $6X^D6X0 2@h3D32P0 :CX0
;4@:XOA56D24^B0 46A3A2:CD60 2@0 E34:<0 :CX0 G^CF:<0 3CG6D23@C0 3C0
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54@263C0B^2:C2A?0]:2^46093@26DIC@<80(JJR8(ML0JJ!NJJb
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