全 文 ：葫芦科作物属种间 RAPD多态性分析
崔辉梅　辛建华　乐锦华
(石河子大学农学院园艺园林工程系 , 石河子 , 832003)
提要　选用了 14个随机引物 , 对葫芦科 3个属的 12 种材料作 RAPD多态性分析 , 并对各
材料的指纹图谱进行了聚类和相似性分析。结果表明 , 12 种材料基因组的分析结果与传统
分类学的结果基本相符 ,同时 3 属内各种间都具有其特殊的扩增带 , 这些带可作为分子标记
应用于植物的分类和鉴定。
关键词　葫芦科　属种　遗传多样性　RAPD
中图分类号　S642.6
葫芦科中的西瓜属 、甜瓜属 、南瓜属的大部分种 ,是我国夏季食用 、加工和出口的主要
蔬菜作物 ,由于长期的栽培进化又形成了若干种 、亚种和生态型[ 1 ～ 3] 。利用分子标记技
术 ,研究葫芦科作物的系统发育和亲缘关系 ,进而从分子水平阐明葫芦科作物间基因型的
差异 ,不仅对研究葫芦科作物的分类和进化有促进作用 ,而且可以为葫芦科作物的高产 、
优质 、抗病育种提供理论指导 。
1　材料与方法
1.1　试验材料
试验用葫芦科 3个属的 12份材料 ,由石河子大学农学院园林系蔬菜教研室提供 ,其
基本情况见表 1。RAPD由Operon公司生产 , dNTP 、Taq DNA 聚合酶购自上海 Promerge公
司。
1.2　方法
1.2.1　DNA的提取及纯化
种子萌发后 ,取完全展开的子叶1 ～ 2 g ,采用酚-氯仿提取法(由中国农科院品资所提
供提取方案 ,并稍加改进。)提取缓冲液中含 0.1 mol/L Tris-HCl ,pH8.5;0.01 mol/L NaCl;
0.05 mol/L EDTA ,pH8.0;2%SDS 及 6%的 PVP ,使用前加 1%的巯基乙醇 ,用等体积的酚 ,
氯仿抽提 2次 ,异丙醇沉淀 DNA ,最后提取的 DNA视量的多少溶于适量的 TE缓冲液中 。
用7530G分光光度计测定 DNA浓度。取少量样品电泳 ,其中琼脂糖的浓度为 0.8%,以观
察DNA分子量大小及降解情况 。
1.2.2　RAPD分析
扩增反应在 Idaho1818型气浴式毛细管 PCR仪上进行 ,反应体积为 10 μL ,分别含:引
第 3 卷　第 1期
1999 年 3 月 　　　　　 石河子大学学报(自然科学版)Journal of Shihezi University(Natural Science)　　　　　　Vol.3　No.1Mar.1999
收稿日期:1998-07-07
DOI :10.13880/j.cnki.65-1174/n.1999.01.001
物0.5μmol/L ,Tris-HCl(pH8.3)50 mmol/L , BSA 500 μg/mL ,MgCl2 2.5 mmol/L , Taq DNA聚
合酶 0.6 U/10μL ,dNTPs 200μmoL/L ,Ficoll 1%和酒石黄 1 mmol/L.引物序列及代号见表
2。
表 1　试验材料名称
名称及编号　　　　　 材　料　 染色体
南瓜属(Cucurbita moschata L.) 2n=2x=40
　1.黑子南瓜(C.ficifolia Bouche.L) 黑子南瓜
　2.美洲南瓜(C.Pepo L.) 南 17
　3.印度南瓜(C.maxima Duch.exLam.) 日本南瓜
甜瓜属(Cucumis melo.L.) 2n=2x=24
　4.厚皮甜瓜亚种(ssp.mele Pang) 黄旦子
　5.野甜瓜亚种(ssp.agrestis(Naud)Greb.) 野甜瓜
　6.香瓜亚种(ssp.dudaim (L)Gireb.) 要瓜
　7.薄皮甜瓜亚种(ssp.conomon (Thunb)Geb) 黄金瓜
西瓜属(Citrullus Lanatus Schrad) 2n=2x=22
　8.籽瓜变种(convar.megalaspermus Linet chao.) 新籽瓜 2号
　9.毛西瓜亚种(ssp.Lanatus) 野西瓜
　10.普通西瓜变种(var.vulgaris) 苏联 3号
卡拉夏帕克
久比利
表 2　RAPD引物序列
编　号 引物名称 序列(5′～ 3′)
1 OPG-07 GAACCTGCGG
2 OPG-08 TCACGTCCAC
3 OPG-09 CTGACGTCAC
4 OPG-10 AGGGCCGTCT
5 OPG-11 TGCCCGTCGT
6 OPG-12 CAGCTCACGA
7 OPG-13 CTCTCCGCCA
8 OPG-14 GGATGAGACC
9 OPG-15 ACTGGGACTC
10 OPG-16 ACGACCGACA
11 OPG-17 GGCTCATATG
12 OPG-18 GGCTCATGTG
13 OPG-19 GTCAGGGCAA
14 OPG-20 TCTCCCTCAG
　　扩增程序为:94 ℃变性 ,15 s;42 ℃复性 ,7 s;72 ℃延伸 , 70 s;2个循环。随后 94 ℃变
性 ,0 s;42 ℃复性 ,7 s;72 ℃延伸 ,70 s;38个循环 。最后 72 ℃,保温 1 min。程序运行完
毕 ,置样品于4 ℃冰箱中片刻 ,然后在2%的琼脂糖凝胶中电泳 ,电极缓冲液为1×TBE ,水
平电泳(5 V/cm)。电泳后在 EB(0.5 mg/mL)中染色 0.5 h ,在紫外检测仪上检测 ,照相 ,并
记录电泳结果。
2　　　　　　　　　　　　　　石河子大学学报(自然科学版)　　　　　　　　　　　　第 3 卷
1.2.3　数据分析
对12个材料的RAPD特征带进行聚类分析 ,每个材料的 RAPD指纹图谱中 ,有带的量
化为 1 ,无带的量化为 0。应用计算机软件对原始数据极差标准化 ,通过类平均法 ,进行欧
氏距离聚类。按 Nei和 Li[ 4]的方法计算品种间相似系数(Gs)。
GS =2Nij/(N i +Nj)
N ij表示 i和 j两品种共有的片段数总和 , Ni和Nj分别表示 i 、j品种具有的片段总数 。
遗传差异(GD)=1 -GS ,利用 GS 值按不加权成对群算术平均法(UPGMA)进行聚类分
析。
2　结果与讨论
2.1　12个材料的基因组 DNA指纹图谱分析
本试验共选用 14个随机引物进行 PCR扩增 ,这 14个引物均属Operon成套引物中的
G组 ,它们分别是OPG-07 ～ OPG-20。扩增的结果发现 ,11个引物能有效扩增 ,扩增产物经
琼脂糖凝胶电泳分离具有多态性 ,图 1 ～ 图 4为引物 OPG-08 、09 、10 、12四种引物对葫芦科
3个属中 12个材料基因型的扩增结果。11种引物通过 PCR扩增共得到 129种扩增产物
(平均每个引物可扩增出 11条带),不同引物在同一供试材料中产生不同的扩增带 ,同一
引物在不同属的供试材料上具有不同的指纹图谱 。在 3个属之间没有共同的谱带出现 。
但在西瓜属 、甜瓜属的各属内不同材料间具有较多的共同谱带 ,说明同属不同材料亲缘关
系较不同属间材料的亲缘关系较近 ,相比之下南瓜属 3个种具有的共同带较少 ,不同带较
多。另外 ,在不同引物的扩增产物中 ,个别材料在某一片段长度处有其它材料所不具备的
条带出现 ,可作为该材料的特异性标记 。西瓜属的 5个材料 、甜瓜属的 4个材料和南瓜属
的3个材料在引物OPG-08 、09 、10 、12中都有特异扩增产物(图 1 ～ 图 4),因此这些特异条
带可作为它们的特异性标记。除特异性产物外 ,还可以看到特异性缺失条带。这些缺失
带与特异性条带一样 ,也可作为品种鉴定的特异性标记 。
图 1　OPG-08引物检测 12种材料产生的多态性
3　第 1 期　　　　　　　　　崔辉梅等:葫芦科作物属种间 RAPD多态性分析
图 2　OPG-09引物检测 12种材料产生的多态性
图 3　OPG-10引物检测 12种材料产生的多态性
图 4　OPG-12引物检测 12种材料产生的多态性
2.2　供试材料间的聚类分析
经过计算在遗传距离 0.66处做结合线 L1 ,在 0.44处做结合线 L2 。在结合线 L1 处将
12个材料划分为 Ⅰ ～ Ⅵ组 。第 Ⅰ组包括 4 、7 、5 、6 ,即甜瓜属中不同亚种的 4种材料:野甜
瓜(野甜瓜亚种)、要瓜(香瓜亚种)、黄金瓜(薄皮甜瓜亚种)、黄旦子(厚皮甜瓜亚种);第
Ⅱ、Ⅲ 、Ⅳ组分别为 2 、1 、3 ,即南瓜属中 3个种的材料:日本南瓜(印度南瓜)、南 17(美洲南
瓜)、黑子南瓜(黑子南瓜),它们被各自分成为一族 。第Ⅴ组为 9即西瓜属中毛西瓜亚种
的野西瓜;第Ⅵ 组为 8 、12 、10 、11 ,即西瓜属的普通西瓜亚种中的其余 4种材料 ,新籽瓜 2
号 、久比利 、苏联 3号和卡拉夏帕克。从聚类分析图上可以看到甜瓜属中不同亚种间亲缘
4　　　　　　　　　　　　　　石河子大学学报(自然科学版)　　　　　　　　　　　　第 3 卷
关系比西瓜属中不同亚种间的亲缘关系要近。甜瓜属的 4个亚种的材料被分为 1组 ,而
西瓜属中 2个亚种的材料则被独立分为 2组。南瓜属中 3个种的亲缘关系比起西瓜属 、
甜瓜属中的亚种间的关系要更远 ,被单独分为 3组 。这与我们植物学中种与亚种的分类
相吻合 。在结合线 L2 处 ,可将 12种材料分为 4类 ,第 1类包含了第 Ⅰ组甜瓜属中的 4种
材料 ,第 2类为Ⅱ组 ,即南 17(美洲南瓜);第三类包含 Ⅲ 、Ⅳ组即黑子南瓜(黑子南瓜)和
日本南瓜(印度南瓜);第 4类包含了第Ⅴ 、Ⅵ组 ,即西瓜属中的 5种材料 。由此说明甜瓜
属和西瓜属内的各材料间亲缘关系较近 ,被各自分为一类。
4　黄旦子
7　黄金瓜
5　野甜瓜
6　要　瓜
2　南 17
1　黑子南瓜
3　日本南瓜
9　野西瓜
8　新籽瓜 2号
12　久比利
10　苏联 3号
11　卡拉夏帕克　　
　　相似系数
图 5　12 个葫芦科材料按 RAPD标记的亲缘关系树系图(UPGMA法 , 相似系数)
2.3　材料间的成对相似系数
根据前面相似系数公式 ,计算出各材料间的相似系数(表3)。
表 3　葫芦科各供试材料间的成对相似系数
品种 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
1 1.000
2 0.457 1.000
3 0.542 0.374 1.000
4 0.283 0.322 0.385 1.000
5 0.271 0.286 0.456 0.786 1.000
6 0.351 0.304 0.458 0.810 0.933 1.000
7 0.304 0.276 0.359 0.757 0.842 0.810 1.000
8 0.188 0.330 0.293 0.179 0.203 0.193 0.282 1.000
9 0.326 0.345 0.256 0.189 0.214 0.253 0.351 0.538 1.000
10 0.268 0.348 0.289 0.253 0.241 0.286 0.354 0.843 0.582 1.000
11 0.275 0.329 0.310 0.203 0.241 0.247 0.257 0.838 0.559 0.933 1.000
12 0.203 0.359 0.29 0.149 0.182 0.167 0.176 0.849 0.455 0.849 0.857 1.000
　　注:1 黑子南瓜　2 南 17　3 日本南瓜　4 黄旦子　5 野甜瓜　6 要瓜　7 黄金瓜　8 新籽瓜 2号
9 野西瓜　10 苏联 3 号　11 卡拉夏帕克　12 久比利
甜瓜属的 4种材料中 ,可以从表中看出野甜瓜与要瓜亲缘关系最近 ,相似系数达
0.93 ,黄金瓜与二者的亲缘关系稍次 ,黄旦子则与这三者关系最远 。在西瓜属的 5个材料
中卡拉夏帕克属于新疆生态型 ,苏联 3号属于俄罗斯生态型 ,两者地域相近 ,气候均为大
5　第 1 期　　　　　　　　　崔辉梅等:葫芦科作物属种间 RAPD多态性分析
陆性气候 ,相近的地理生存环境 ,造就 2个品种间具有相似的环境适应性 ,使两者的亲缘
关系相近 ,相似系数高达 0.93。久比利属于美国生态型 ,原产地生态条件为阳光充足 、干
热少雨的亚热带干旱荒漠或干旱草原 ,地域上离新疆 、俄罗斯较远 ,所以与前二者亲缘关
系稍远 。新籽瓜 2号与苏联 3号 、卡拉夏帕克 、久比利是变种间关系 ,新籽瓜 2号属籽瓜
变种 ,后者都属于普通西瓜变种。相比它与后者的相似系数为 0.84 ,关系较远 。野西瓜
与其它材料虽为同属 ,但分属于不同的亚种 ,野西瓜属于毛西瓜亚种 ,后者为普通西瓜亚
种 ,这两个亚种间相似系数为 0.53 ,所以野西瓜和其它材料的亲缘关系较远。
南瓜属中 3个种间亲缘关系较远 ,黑子南瓜和日本南瓜相似系数为 0.54 ,而南 17与
两者的相似系数为 0.41 ,说明黑子南瓜和印度南瓜亲缘关系较近 ,两者与美洲南瓜的亲
缘关系较远。这与漆小泉等[ 5]对南瓜属 3个主要栽培种中国南瓜 、印度南瓜 、美洲南瓜过
氧化物酶和酯酶同工酶分析结果相一致 。他们认为印度南瓜与美洲南瓜关系较远 ,而两
者与中国南瓜关系较近。另外 ,从表中还可以看出甜瓜属与南瓜属间亲缘关系较近 ,相似
系数为 0.337 ,而它们与西瓜属在亲缘关系上相对较远 ,相似系数为 0.262。由于三者之
间的亲缘关系均低于 0.50 ,故在育种中进行属间杂交难度较大。
参考文献
1　中国农业百科全书总编委员会蔬菜卷编辑委员会.中国农业百科全书.北京:农业出版社 , 1990
2　新疆甜瓜西瓜资源调查组编著.新疆甜瓜西瓜志.乌鲁木齐:新疆人民出版社出版
3　林德佩.西瓜的生态型和杂种优势利用.中国果树 , 1980 ,(1):32～ 37
4　Nei M ,WHLi.Mathematical Model for Studying Genetic Variation in Terms of Restriction Endonucleases.Proc Natl
Acad Sci , U.S.A., 1979 , 76:5269～ 5273
5　漆小泉 ,东惠茹 , 胡是林.南瓜属三个种酯酶同工酶分析.园艺学报 , 1989 , 16(4):299～ 305
Analysis of Genomic DNA Polymorphism in the Species
and Genuses of Cucurbitaceae by RAPD Technique
Cui Huimei　Xin Jianhua　Le Jinhua
(Dept.of Horticulture &Forestry Engineering , Agri Col , Shihezi Univ , Shihezi , 832003)
Abstract　The cucurbitceae plants were tested with polymorphic RAPD markers using the
rapidcycler.RAPD technique was used to detect genetic DNA polymorphic 12 materials(including 3
genses:3 species ,5 subspecies and 2 varieties.)among species and geneses of cucurbitaceae.They
were examined with 14 random 10-mer primers and 129 polymorphic RAPD bands were got.Based on
the data obtained ,dendrogramwas constructed using Nei s genetic similarity coefficient and UPGMA
program.The result showed that RAPD technique could show the plentiful DNA polymorphic among
various gentic DNA and the relationships getting from the systematic analysis of the polymorphic
DNA were similar to morphological classification.The Citrullus Lanatus , Cucumis melo.and among
the species of cucurbita moschata own their specific bands , respectively.RAPD technique provides a
new methods for cultivator identification and classification in the cucurbitaceae plants as well.
Key words　 cucurbitaceae ;genus &species;genetic diversity ;RAPD
6　　　　　　　　　　　　　　石河子大学学报(自然科学版)　　　　　　　　　　　　第 3 卷