全 文 ：Guihaia Feb. 2016，36 (2): 236-239
DOI: 10.11931/guihaia.gxzw201507009
陈志勇，曲彩红，卢静，等. 木榄胚轴中一个新生物碱及其抗乙肝病毒活性研究［J］. 广西植物，2016，36(2)：236-239
CHEN ZY，QU CH， LU J，et al. A new antiviral alkaloid from the hypocotyl of Bruguiera gymnorrhiza［J］. Guihaia，2016，36(2)：236-239
木榄胚轴中一个新生物碱及其抗乙肝病毒活性研究
陈志勇1，曲彩红 1，卢 静 1，程 刚 1，高程海 2*
（1. 空军大连通信士官学校，辽宁 大连 116600；2. 广西科学院 广西近海海洋科学重点实验室，南宁 530007）
摘 要：木榄为红树科木榄属植物，其在广西沿海地区有用作食物的传统，同时有消炎、治疟疾和清热
解毒等功效。该研究以采自广西北仑河口国家级自然保护区的红树木榄（Bruguiera gymnorrhiza）胚轴
为对象，应用现代色谱方法（硅胶柱色谱、制备液相及制备薄层色谱等），从中分离获得 1个生物碱类
单体化合物。运用光谱分析技术(HRMS、1H NMR、13C NMR、DEPT、1H-1H COSY、HSQC、HMBC)
鉴定其化学结构，发现为新化合物，命名为 Gymnorrhizin A。运用 MTT 法，发现该化合物在对乙肝病
毒表面抗原（HbsAg）和乙型肝炎 e抗原（HbeAg）的 50%抑制浓度（IC50）分别为 4.37 mmol·L-1和
4.89 mmol·L-1，治疗指数（TI）分别为 2.68和 2.40。通过对红树木榄胚轴化学成分进行深入研究，阐
明其中抗乙肝病毒活性物质基础，为相关新药研发提供了科学依据。
关键词：天然产物研究，生物碱，乙肝病毒表面抗原，乙型肝炎 e抗原，治疗指数
中图分类号: Q946.88，R914.4 文献标识码: A 文章编号: 10000-3142（2016）02-0236-04
Anew antiviral alkaloid from the hypocotyl of
Bruguiera gymnorrhiza
CHENZhi-Yong1，QUCai-Hong1，LU Jing1，CHENGGang1，GAOCheng-Hai2*
（1. Dalian Air Force Sergeant School of Communication，Dalian 116600，China; 2. Guangxi Key Laboratory
of Marine Environmental Science，Guangxi Academy of Sciences，Nanning 530007，China )
Abstract: Bruguiera gymnorrhiza is a common buttressed tree found in the mangrove forests. The hypocotyl of a
mangrove B. gymnorrhiza are traditionally used as food and herbal medicine in Guangxi. A new alkaloid (1) was isolated
from the hypocotyl of a mangrove B. gymnorrhiza and purified by repeated column chromatography on silica and HPLC.
The structure of Compound 1 was elucidated on the basis of extensive spectroscopic analysis (HRMS，1H NMR，13C
NMR，DEPT， 1H-1H COSY，HSQC and HMBC). Compound 1 was a new compound by the method of SciFinder
scholar，and it showed that anti-Hepatitis B virus (HBV) activity against HbsAg and HbeAg with IC50 values of 4.37
mmol· L-1 and 4.89 mmol· L-1， and TI values of 2.68 and 2.40， respectively. The hypocotyl of a mangrove
B. gymnorrhiza has been commonly used as crude material of herbal medicine for a long time，and this study would
accumulate data for chemical constituents research of the genus.
Key words: natural product research，alkaloid，HbsAg，HbeAg，therapeutic index
收稿日期： 2015-07-11 修回日期： 2015-11-30
基金项目：广西自然科学基金（2014GXNSFAA118048，2015GXNSFBA139195）；广西近海海洋环境科学重点实验室开放基金（GXKLHY13-06)
[Supported by the Natural Science Foundation of Guangxi（2014GXNSFAA118048; 2015GXNSFBA139195）； Guangxi Open Fund For Key Laboratory of
Marine Environmental Science（GXKLHY13-06）]。
作者简介： 陈志勇（1969-），男，江苏丹阳人，主治医师，主要从事肿瘤和病毒疾病及相关药物的研究，（E-mail）czyyy-1@126.com。
*通讯作者： 高程海，博士，研究员，主要从事海洋药物研究，（E-mail）gaochenghai@gxas.cn。
木榄（Bruguiera gymnorrhiza）为红树科木榄属
植物，主要分布于非洲、东南亚、美洲加勒比海的
海岸线沿岸，在中国主要分布于广东、广西、海南、
福建和台湾等地（高程海等，2011）。广西沿海城市
http://journal.gxzw.gxib.cn
http://www.guihaia-journal.com
2期 陈志勇等：木榄胚轴中一个新生物碱及其抗乙肝病毒活性研究 237
防城港、北海和钦州都分布有木榄，其在广西沿海
地区有用作食物的传统，同时也有消炎、治疟疾和
清热解毒的功效（邵长伦等，2009）。虽然对红树木
榄根茎叶的化学成分已有研究，但文献调查发现仅
有对木榄属植物B. parviflora的胚轴粗提物进行抗氧
化活性评价（Bunyapraphatsara et al，2003）。
笔者之前报道了木榄胚轴含有苯丙素类化合
物、醇苷类化合物（易湘茜等，2013，2015）。本文
承接以上研究，继续深入研究红树木榄中次生代谢
产物，从中获得1个新生物碱类化合物，并测试了其
抗乙肝病毒活性，为相关新药研发提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 仪器与材料
Brucker Avance 600 型核磁共振波谱仪（德国
Bruker 公司），Waters e2695 Alliance分析半制备高效
液相色谱仪，N-1100V-W旋转蒸发仪（日本东京理
化株式会社），LCQDECAXP ESI质谱仪（美国 Finnigan
公司），SIM-F140AY65型制冰机（日本 Sanyo公司），
CO2恒温细胞培养箱（HERA，German），Olympus
倒置相差显微镜（Japan CK-40-P200），MS3型振荡
器（德国 IKA 公司），IKA MS3 basic圆周振荡器（广
州艾卡仪器设备有限公司）。
柱层析正相硅胶（200~300目，青岛海洋化工
厂），高效薄层色谱预制板（烟台化学工业研究所），
HepG2.2.15细胞株（上海研域生物科技有限公司），
胎牛血清（杭州四季青生物公司），1640 培养液
（gibco，USA），胰蛋白酶（北京索莱宝生物），拉
米夫定（葛兰素史克制药有限公司）。
2011年 6月在广西北仑河口红树林自然保护区
采集研究样品，经王新助理研究员（广西红树林研
究中心）鉴别为红树科（Rhizophoraceae）木榄属
（Bruguiera）木榄（B. gymnorrhiza）的胚轴。木榄
胚轴标本保藏于广西科学院广西北部湾海洋研究中
心（编号：2011-GXAS-018）。
1.2 提取与分离
将新鲜的木榄胚轴（湿重约 12.0 kg）粉碎后使
用有机溶剂（VCH2Cl2:VC2H5OH=1:2）在室温下浸泡 7 d，
重复 3次，每次获得的浸出液经减压浓缩得总提取
物（915 g）。分别用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇等溶剂
对总提取物萃取，减压回收溶剂，依次得到氯仿萃
取物（干重 59.0 g）、乙酸乙酯萃取物（干重 52.0 g）
和正丁醇萃取物（干重 171.0 g）和水相剩余物。
取适量硅胶粉至乙酸乙酯萃取物（52.0 g），充
分搅拌干燥和研磨后装入正相硅胶柱。依次用氯仿-
丙酮洗脱系统（CHCl3:Me2CO=10:0-5:4/V:V）和氯
仿-甲醇洗脱系统（CHCl3:MeOH=10:1-0:10/V:V）进
行梯度洗脱，流分经薄层层析色谱检测后合并为12
个分离部位（Y1-Y12）。组份Y7用半制备型高效液
相色谱HPLC分离纯化，在梯度MeOH:H2O=5:95/V:V
处，获得化合物1（1.2 mg，t=19.02 min）。
1.3 化合物 1的结构鉴定
运用1H NMR、13C NMR、1H-1H COSY、HSQC、
HMBC、1H-1H COSY、HRMS等分析方法，对分离
得到的化合物1进行结构鉴定。
1.4 化合物 1抗乙肝病毒活性筛选测试
采用孙静等（2014）的方法，用二甲基亚砜
（DMSO）溶解化合物 1为母液，临用前用细胞培养
液将母液依次稀释成 10、 5、 2.5、 1.25、 0.625
mmol·L-1等 5个浓度梯度。阳性对照为拉米夫定，
浓度 0.1 mmol·L-1。
肝癌细胞 HepG2.2.15复苏后，再传代，以每升
1×107个接种于 96 孔培养板。培养 2 d以等待细胞
贴壁，然后加入上述所配不同浓度梯度的含药培养
液，同时设仅加正常培养液的阴性对照组和含 1
mmol·L-1拉米夫定的阳性对照组，每组设 3个平行
样，继续培养 6 d，分离上清液的低温保存待用，剩
余部分加 5 g·L-1 MTT 20 μL，在 37℃孵育 4 h，震
荡 10 min，在吸收波长为 490 nm处测试其吸光度值，
计算得到细胞抑制率和 TC50。用 ELISA 法对低温保
存的上清液中 HbsAg和 HbeAg进行检测，出现显色
反应后，用酶标仪读取在 A450 nm的吸收值。利用
公式计算获得抗原抑制率和半数有效浓度(IC50)。治
疗指数 (TI)=TC50(半数毒性浓度 )/IC50(半数有效浓
度)。（其中 TI≤1为毒性作用，1TI≥2为有效低毒）
2 结构鉴定和抗乙肝病毒活性测试
2.1 结构鉴定
化合物 1为墨绿色晶体，易溶于甲醇。三氯化
铁溶液显色为紫色。比旋光度（[α] 20 D）为–57.2 (c
0.54，MeOH)。IR谱显示有羟基 (3 428 cm-1)，酰胺
238 广 西 植 物 36卷
基 (1 667 cm-1)和芳香环 (1 604 cm-1)等官能团。
HR-ESI-MS（m/z: 269.155 8 [M+H]+）提示分子量为
268. 156 9，再结合 1H NMR和 13C NMR谱确定化合
物 1分子式为 C14H23NO4，具有 4个不饱和度。结合
1H-NMR 和 13C-NMR谱，提示有 3个不饱和度为三
个碳碳双键，因此，该化合物存在 1个苯环。UV谱
在  max 237和 348 nm处有最大吸收。1H NMR谱在
展示存在 3个氧甲基H 3.82 (3H，s，3-OCH3)，3.82
(3H，s，5-OCH3)，3.73 (3H，s，4-OCH3)和 2个氮
甲基 3.35（3H，s，NCH3），3.35（3H，s，NCH3），
2个亚甲基 2.78 (1H，dd，5.4，13.8，Hb-1ʹ)，2.62(1H，
dd，7.8，13.8，Hb-1ʹ)，3.50 (2H，m，H-3ʹ)，3个次
甲基 6.56 (1H，s，H-2)，6.56 (1H，s，H-6)，3.80(1H，
m，H-2ʹ)。13C NMR 和 DEPT 谱表明了五个甲基C
49.9（N-CH3），49.9（N-CH3），56.5 (OCH3)，56.5
(OCH3)，61.1 (OCH3)，二个亚甲基(C 41.2，66.6)，
三个次甲基(C 74.4，107.7，107.7)和四个季碳的存
在(C 136.4，137.4，154.2，154.2)。
以上这些数据类似于化合物 elemicin（Jayasinghe
et al，2003）和 3，4，5-trimethoxy-α- aminomethylbenzyl
alcohol (Heacock & Hutzinger，1962)，以上信息提示
该分子具有四取代的芳香环母核。
在 HMBC谱中，从H 3.82 (3H，s，OCH3)到C
154.2 (C-3)，H 3.73 (3H，s，OCH3)到C 137.4 (C-4)，
H 3.82 (3H，s，OCH3)到C 154.2 (C-5)之间的相关
性表明了 3个甲氧基分别与苯环上的 C-3、C-4 和
C-5相连。从H 3.35 (2×NCH3)与C 66.6 (C-3ʹ)相关
表明，氮甲基结构单元与 C-3ʹ相连。从 1H-1H COSY
可知，存在 H-2ʹ和 Ha-1ʹ /Hb-1ʹ /H2-3ʹ相关，表明存在
-CH2-CH(OH)-CH2-结构片段。从 Ha-1ʹ (2.78，dd，
5.4，13.8)和 Hb-1ʹ (2.62，dd，7.8，13.8)与C 136.4 (C-1)
相关表明，揭示结构片段-CH2-CH(OH)-CH2-位于苯
环骨架的 C-1位置上。另外，2×NCH3和C 66.6（C-3ʹ）
确定 2×NCH3接连在 C-3ʹ。基于以上数据，最终确
定了化合物 1 的结构（图 1）。化合物 1 的 1H 和
13C NMR谱的数据归属通过 HSQC和 HMBC谱确定
（见表 1），命名为 Gymnorrhizin A。
2.2 抗乙肝病毒活性测试
MTT法作为一种检测细胞存活和生长的方法，
已经广泛应用于生物因子的活性检测、抗肿瘤药物
筛选、细胞毒性试验及肿瘤放射敏感性测试。本实
验应用该方法观察化合物 1 在具有抗 HBV 活性
图 1 化合物 1的结构
Fig. 1 Structure of Compound 1
图 2 化合物 1的关键 HMBC和 1H-1H COSY相关
Fig. 2 Key HMBC correlation and 1H-1H
COSY of Compound 1
表 1 化合物 1的 1H (600 MHz)和 13C (150 MHz)
NMR核磁数据（氘代甲醇）
Table 1 1H (600 MHz) and 13C (150 MHz) NMR
data of Compound 1 (CD3OD，δ in ppm)
编号
Code
H信号化学位移和
耦合常数
δH
C信号
化学位移
δC
H的异核多量
子相关
HMBC(H→C)
H 136.4
2 6.56 (1H，s) 107.7 C-1ʹ，C-4，C-6
3 154.2
4 137.4
5 154.2
6 6.56 (1H，s) 107.7 C-1ʹ，C-2，C-4
1ʹ 2.78(dd，5.4，13.8)
2.62(dd，7.8，13.8)
41.2 C-1，C-2，C-6，
C-2ʹ，C-3ʹ2ʹ 3.80(m 1H CH) 74.4 C-3ʹ
3ʹ 3.50(m，2H，CH2) 66.6 C-1ʹ，C-2ʹ
3-OCH3 3.82(3H，s，OCH3) 56.5 C-3
4- OCH3 3.73(3H，s，OCH3) 61.1 C-4
5- OCH3 3.82(3H，s，OCH3) 56.5 C-5
NCH3 3.35（6H，s，2×NCH3） 49.9 C-3ʹ
的同时对 HepG2.2.15 细胞本身的生长是否有影响。
结果显示，0.625 mmol·L-1时化合物 1对细胞的抑
制与阴性对照组差异无统计学意义(P>0.05)。说明此
浓度下的化合物 1对 HepG2.2.15细胞本身的生长没
有影响，即对细胞本身没有毒性作用。其他浓度下
均对 HepG2.2.15细胞正常生长有不同程度的抑制作
用，即对细胞本身有毒性作用。但 10 mmol·L-1时，
2期 陈志勇等：木榄胚轴中一个新生物碱及其抗乙肝病毒活性研究 239
表 2 化合物 1对 HepG 2.2.15的细胞毒活性及其分泌 HbsAg和 HbeAg的抑制作用
Table 2 Inhibition rate of Compound 1 on HbsAg and HbeAg secretion of HepG 2.2.15 cells ( ±s，n=3)
浓度
Concentration
(mmol·L-1)
细胞毒性
Cytotoxicity
乙肝表面抗原
HbsAg
乙型肝炎 E抗原
HbeAg
抑制率
Inhibiton ratio (%)
半数毒性浓度
TC50
抑制率
Inhibiton ratio (%)
半数有效浓度
IC50 ( mmol·L-1)
抑制率
Inhibiton ratio (%)
半数有效浓度
IC50 ( mmol·L-1)
Normal 0.00 0.00 0.00
3TC 42.4 72.1 62.5
10 37.8
11.75
72.5
4.37
68.4
4.89
5 31.7 59.3 57.6
2.5 28.2 48.5 46.9
1.25 19.7 34.1 34.1
0.625 11.2 22.3 20.2
化合物 1和 0.1 mmol·L-1拉米夫定组在细胞毒性上
差异无统计学意义(P>0.05)。
乙肝表面抗原（HBsAg）和乙型肝炎E抗原
（HBeAg）是肝癌细胞株HepG2.2.15分泌到培养上
清液中特异性的可溶性蛋白质，能够间接反映病毒
复制状况。因此，通过检测用药后细胞上清液中
HBsAg和HbeAg的活性，观察化合物1对HepG2.2.15
细胞分泌HBsAg和HbeAg的抑制作用，能够确定其体
外抗乙型肝炎病毒的活性。结果显示，相对于阴性
对照组，各浓度实验组所测A450 nm值均降低，且随
着浓度的增加，降低愈明显。培养6 d后，化合物1
对HBsAg的IC50为4.37 mmol·L-1，TI为2.68；H12对
HBeAg的IC50为4.89 mmol·L-1，TI为2.40。
3 结论
通过现代分离技术和结构鉴定方法，从广西北
仑河口采集从红树木榄（B. gymnorrhiza）胚轴中获
得新的 1个生物碱类单体化合物 gymnorrhizin A。活
性测试发现，化合物 gymnorrhizin A具有抗 HBV活
性，对 HbsAg和 HBeAg的 IC50分别为 4.37 mmol·L-1
（TI=2.68）和 4.89 mmol·L-1（TI=2.40）。
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