全 文 ：广 西 植 物 Guihaia　Dec．２０１５,３５(６):８５３－８６２　　　　　　　　　　 http://journal．gxzw．gxib．cn　
DOI:１０．１１９３１/guihaia．gxzw２０１４１１０３０
兰欣欣,徐栋生,贺转转,等．大麦与油菜种皮特异启动子表达模式的比较[J]．广西植物,２０１５,３５(６):８５３－８６２
LanXX,XuDS,HeZZ,etal．ComparisonoftheexpressionpatternoftwoseedcoatＧspecificpromotersfrombarleyandseedrape[J]．Guihaia,２０１５,３５
(６):８５３－８６２
大麦与油菜种皮特异启动子表达模式的比较
兰欣欣,徐栋生,贺转转,兰海燕∗
(新疆大学 生命科学与技术学院 新疆生物资源基因工程重点实验室,乌鲁木齐８３００４６)
摘　要:启动子位于转录起始位点上游并能特异性地结合RNA聚合酶,其作为调控序列驱动外源基因在异
源植物中表达,从而实现转基因的高效性,具有时空表达特异性的启动子对获得有效转基因植物及产物具有
重要意义.为了解种皮特异启动子的表达模式,该研究基于前期报道的序列,通过同源克隆的方法分别从大
麦和油菜中克隆获得Gerb和Bntt两个种皮特异性启动子,并对其进行生物信息学分析,构建了Gerb::GUS
和Bntt::GUS植物表达载体并转化拟南芥,通过组织化学染色观察了GUS的表达情况.结果表明:两种启
动子序列中都含有多拷贝种皮特异表达启动子元件以及多种胁迫诱导响应元件;转基因拟南芥幼苗期,大麦
Gerb种皮特异启动子驱动GUS全株表达且子叶和下胚轴较真叶和根中表达量高;油菜Bntt种皮特异启动子
表达较弱;成株期,Gerb在不同组织(叶片、茎、花序和角果)中均有表达,未显示组织特异性;Bntt仅在叶片及
角果维管束中有微弱表达.在各种非生物胁迫下,Gerb表达模式未发生显著变化,而Bntt仅在盐胁迫下显示
很强的角果和种子特异性表达,其他胁迫未见明显表达.以上结果显示,大麦种皮特异性启动子Gerb和油菜
种皮特异性启动子Bntt在时间和空间表达模式上存在差异,这对今后选择种皮特异启动子具有参考作用,但
其具体机制仍需进一步研究验证.
关键词:种皮特异启动子;GUS组织化学染色;非生物胁迫;大麦;油菜
中图分类号:Q９４３．２　　文献标识码:A　　文章编号:１０００Ｇ３１４２(２０１５)０６Ｇ０８５３Ｇ１０
Comparisonoftheexpressionpaternoftwoseed
coatＧspecificpromotersfrombarleyandseedrape
LANXinＧXin,XUDongＧSheng,HEZhuanＧZhuan,LANHaiＧYan∗
(XinjiangKeyLaboratoryofBiologicalResourcesandGeneticEngineering,Collegeof
LifeSciencesandTechnology,XinjiangUniversity,Urumqi８３００４６,China)
Abstract:PromoterisasegmentofDNAmoleculewhichlocatesintheupstreamoftranscriptionstartsiteandspecificalＧ
lybindstoRNApolymerase．EficientgeneticmodificationoftransgenicplantrequirespromoterastheregulatoryseＧ
quencetodrivetheexpressionofforeigngene．SpecificpromoterswithspatialandtemporalcontrolofectopicgeneexＧ
pressionareimportantforacquirementofthetransgenicplantanditsproductwithhighquality．TounderstandtheexＧ
pressionpaternofseedＧcoatspecificpromoters,basedonthereportedsequences,twoseedＧcoatspecificpromotersＧGerb
andBnt wereisolatedfromBrassicanapusandHordeumvulgarebyhomologousＧbasedcloningmethod,analysisof
theelementsinbothpromoters,thenGerb::GUSandBnt::GUSwereconstructedandintroducedintoArabidopsis,
andtheexpressionpaternsofGerbandBnt wereobservedbyGUShistochemicalstaining．Theresultsofbioinformatics
showedthatmultiＧcopiesofseedspecificexpressioncisＧactingelementsandvariousstressresponseelementswereidentiＧ
收稿日期:２０１４Ｇ１２Ｇ１０　　修回日期:２０１５Ｇ０４Ｇ０９
基金项目:国家自然科学基金(３０８６００２０,３１２６００３７,３１０６００２７)
作者简介:兰欣欣(１９９１Ｇ),女,新疆阿勒泰人,硕士研究生,研究方向为植物抗逆分子生物学,(EＧmail)６２５７１２７５９＠qq．com.
∗通讯作者:兰海燕,教授,博士,从事植物抗逆分子生物学研究,(EＧmail)lanhaiyan＠xju．edu．cn.
fiedinbothpromoters．HistochemicalGUSstainingofthetransgenicplantindicatedthatinseedlingstage,GerbproＧ
motershowedstrongblueGUSstainingwiththecotyledonandhypocotylwhilerelativelyweakerofGUSactivitywith
thetrueleavesandroots;BntpromotershowedweakGUSstaininginwholeseedling;foradultplant,varioustissues
(leaf,stem,inflorescence,silique,etc．)withpromoterGerbpresentedvisibleGUSstainingwhilewithpromoterBnta
veryweakstainingwasonlyobservedonvascularbundleofsiliqueandtheleaf．Undervariousstresses,theexpression
paternoftransgeniclinewithGerb::GUSshowednosignificantchange,however,forBnt::GUS,NaClstresscould
causestrongGUSstainingwithsiliqueandseeds,whilenosignificantstainingwasdetectedinothertissuesorunderothＧ
erstresses．TheseresultsindicatedthatGerbandBntpromotersdisplayeddiferenttemporalandspatialexpressionpatＧ
terns,whichmaybehelpfulforscreeningseedＧcoatspecificpromoterinpractice,however,thedetailsofregulation
mechanismneedsfurtherstudytovalidate．
Keywords:seedcoatＧspecificpromoters;GUShistochemicalstaining;abioticstress;Hordeumvulgare;Brassica
napus
　　外源基因在转基因植物中的有效表达需要合适
的启动子调控序列进行驱动(Songetal．,２０００).
启动子是位于转录起始位点上游并能特异结合
RNA聚合酶的一段DNA序列,它会对转基因的效
果产生显著影响.启动子可分为两大类:一类是组
成型表达启动子,另一类是特异性表达启动子(魏雯
雯等,２０１０).前者在不同组织和发育阶段均能激活
基因的表达,而后者则限制外源基因仅在特定组织
和条件下表达.迄今为止,植物基因工程使用的大
多数启动子都是组成型的(Hajdukiewiczetal．,
１９９４;Ouwerkerketal．,２００１),尤其对于单拷贝
基因而言,此类启动子为基因功能的研究奠定了基
础(Jacketal．,１９９４).目前应用最为广泛的经典
异位表达强启动子为花椰菜花叶病毒(CaMV)３５S
启动子(Odeletal．,１９８５).然而,外源基因的不
适当表达可能会对植物造成危害,这在很多研究中
已被证实(Laufsetal．,２００３).特异性表达启动子
为定性及定量阐明外源基因的作用提供了有力工
具,尤其是不同发育阶段特异表达的启动子.合适
的特异启动子能在特定细胞类型中有效激活靶基
因,因此,根据不同需要选择适当的组织特异性启动
子很有必要(Zhangetal．,２００２).
据报道,很多组织特异性启动子已被分离出来,
如叶(Gowiketal．,２００４)、根(Jonesetal．,２００８)、
花(Gengetal．,２００９)、果实(Yinetal．,２００８)、种
子(Rossaketal．,２００１)、花粉 (Rogersetal．,
２００１)、韧皮部(Yinetal．,１９９７)等特异表达启动
子.此外,特异启动子上多种重要作用元件已得到
鉴定(Carrancoetal．,１９９９;Reidtetal．,２０００).
组织特异性启动子应用广泛,包括在特定细胞类型
中调控基因的表达,对基因调控建立一系列模型,或
用作生物技术的操作工具等.
特异表达启动子并不总能满足需要,表现为不
能在特定细胞中准确激活基因表达.因此,筛选更
多能精确表达外源基因的特异启动子很有必要,如
从花器官特异的启动子中筛选柱头特异类型,从种
子特异启动子中筛选种皮特异类型等.转基因植物
可以大量生产人类需要的产物,而种子作为植物天
然的贮藏器官,是积累外源基因产物的理想场所
(Zhangetal．,２００２).种皮占种子质量的１/６,是
不可消化纤维的最大来源,这使种皮特异性启动子
在通过调控种皮靶基因的表达从而改善种子质量过
程中起重要作用(Aliaaetal．,２００９).但目前只有
少数种皮特异性启动子(seedＧcoatspecificpromotＧ
er,SSP)从植物中分离出来(Debeaujonetal．,
２００９;Wuetal．,２０００).因此,有必要鉴定更多此
类启动子,从而进一步了解其调控机制,为农业生产
提供有价值的信息(Zhangetal．,２００２).本研究从
大麦(Hordeumvulgare)和甘蓝型油菜(Brassica
napus)中克隆了种皮特异启动子,将二者构建到
GUS报告基因的上游,转化拟南芥后检测不同发育
阶段及不同非生物胁迫下GUS 基因的表达情况,
以揭示两种种皮特异启动子在时间和空间表达模式
上的特性,为后续的相关研究提供参考.
１　材料与方法
１．１植物种植
将大麦和甘蓝型油菜种子播于珍珠岩∶蛭石
(１∶３)混合基质中,于２０~２５℃、１６h光照/８h黑
暗、光照强度平均２０００lx的温室中培养.期间给
予充足的水,每隔２周浇１次Hoagland营养液(AlＧ
４５８ 广　西　植　物　　　 　　　　　　　　　　　　　　３５卷
focealetal．,１９９３).１~２个月后取嫩叶制备基因
组DNA.用于转化的拟南芥(ColＧ０)种植于人工培
养室中(２０~２２℃,１６h光照/８h黑暗,光照强度为
４０００~６０００lx,相对湿度为４０％~６０％).选取生
长为８周左右的拟南芥(正值初花期)进行农杆菌介
导转化.
１．２方法
１．２．１种皮特异性启动子驱动植物表达载体的构建
　据已报道的序列(Wuetal．,２０００;黄华磊等,
２００７)克隆大麦和甘蓝型油菜种皮特异启动子片段,
并分别命名为Gerb(大麦)和Bntt(甘蓝型油菜).
设计引物为Gerb 上游引物:５′ＧCCCAAGCTTAＧ
ATCCTTTACTCTGTCTＧ３′;下游引物 ５′ＧCGGＧ
GATCCATTGTGAGTTGCTTTGTCAＧ３′,扩增出
约８５０bp的片段.Bntt 上游引物:５′ＧAACTGＧ
CAGGTGGTCTAGGGTTTTATGAＧ３′;下 游 引
物:５′ＧCGCGGATCCTCTCTTCTGTTAGTTATAGＧ３′,
扩增出约１６００bp的片段.
将测序正确的Gerb和Bntt启动子片段分别构
建至pCAMBIA１３９１ＧZ表达载体的多克隆位点,该
载体具有缺失启动子序列的GUS 报告基因及一个
潮霉素抗性选择标记.同时,从植物表达载体
pBI１２１上切下８００bp的CaMV３５S 启动子序列,
回收后插入pCAMBIA１３９１ＧZ的GUS 基因上游作
为阳性对照.重组质粒鉴定正确后分别命名为
pCAMBIA１３９１ＧZＧGerb,pCAMBIA１３９１ＧZＧBntt和
pCAMBIA１３９１ＧZＧ３５S(分别简称为Gerb::GUS,
Bntt::GUS,３５S::GUS;统称为SSP::GUS),并
用于下一步转化拟南芥.
１．２．２转基因拟南芥抗性筛选及PCR检测　根据快
速冻融法(Cloughetal．,１９９８)将以上三种重组质
粒转化至根癌农杆菌EHA１０５中,通过花序浸染法
转化拟南芥植株并收集T０代种子,随后将T０代种
子播于含３０mg􀅰LＧ１潮霉素的 MS培养基上培养
８~１０d.筛选出的抗性苗转移至无潮霉素的 MS
培养基上恢复生长１周后移栽至珍珠岩∶蛭石(１∶
３)混合基质中.于人工培养室中培养１~２月后,提
取潮霉素抗性植株的基因组,进行PCR鉴定,转基
因株系筛选至T３代.
DNA提取按天根植物基因组DNA提取试剂
盒 (Tiangen,北京)说明书进行.PCR反应体系:
９４℃预变性５min,９４℃变性５０s,５５℃复性５０s,
７２℃延伸１min,３０个循环后,７２℃再延伸５min.
１．２．３转基因拟南芥的非生物胁迫处理　分别用盐、
激素以及高温处理拟南芥T３代转基因植株.(１)
盐胁迫:用１５０mmol􀅰LＧ１NaCl溶液(以 Hoagland
营养液配制)处理植物,胁迫处理期间花盆始终置
于１５０ mmol􀅰LＧ１NaCl溶液中;(２)激素处理
(ABA):用１００μmol􀅰LＧ１的ABA处理植物;(３)高
温胁迫 (３７℃):将植物放置在３７℃恒温箱 (EYEＧ
LANDOＧ４００,日本)中,胁迫处理期间花盆始终置
于充满水的托盘中.各胁迫分别处理２４h后采集
植物不同组织样本(包括叶、花序、角果和种子)备
用.未处理植株作为对照.
１．２．４GUS活性检测　转基因拟南芥GUS活性的
组织化学染色参照Jeffersonetal．(１９８７)的方法.
将对照或处理组的新鲜样本浸泡于现配的PB溶液
(５０mmol􀅰LＧ１磷酸钠缓冲液,pH７．０;１mmol􀅰LＧ１
EDTA;０．５mg􀅰mLＧ１XＧGluc;０．４％ TritonXＧ１００;
１００mg􀅰mLＧ１氯霉素;５mmol􀅰LＧ１亚铁氰化钾)
中,黑暗条件下３７℃孵育过夜,随后转移到７０％乙
醇中室温过夜去除叶绿素.于体视显微镜(Nikon
SMZ８００,日本)下观察染色结果并拍照.
１．２．５启动子元件的功能分析　利用在线分析软件
PLACE(Jeffersonetal．,１９８７)分析启动子中不同
元件的功能.
２　结果与分析
２．１种皮特异性启动子序列分离与SSP::GUS构建
分别从大麦和甘蓝型油菜基因组DNA中PCR
扩增获得约８５０bp和１６００bp的启动子片段.序
列分析显示,与已报道的Gerb和Bntt序列(Wuet
al．,２０００;黄华磊等,２００７)相比达９９％和９９．２５％
的一致性,其中改变的核苷酸不在重要元件上.用
以上两段序列及现有的８００bp的３５S 启动子片段
构建了三个启动子驱动的GUS植物表达载体.构
建示意图如图１所示,酶切鉴定结果如图２所示.
２．２Gerb,Bnt 和CaMV３５S启动子生物信息学分析
利用在线分析软件PLACE对三个启动子片段
的分析结果如表１ (Gerb)、表２ (Bntt)和表３
(CaMV３５S)所示.Gerb启动子序列中包含大量
与组织特异性表达、非生物胁迫相关的元件,花粉、
种子、胚乳、种皮特异表达相关元件如 AGAAA、
CATGCA、GTACGTG、CATGCA等;响应外界刺
激如光、低温、ABA 等的 GATAA、GATA、ACＧ
５５８６期　　　　　　　　　兰欣欣等:大麦与油菜种皮特异启动子表达模式的比较
图１　Gerb::GUS,Bntt::GUS,３５S::GUS 构建　
TB(L),TB(R)．TＧDNA 的左、右边界;PolyA．终 止 子;
CaMV３５S．３５S启动子;Hygr．潮霉素抗性基因;MCS．多克隆位
点;GUS．βＧ葡糖苷酸酶;３５S．CaMV３５S启动子;Gerb．大麦种
皮特异启动子;Bntt．油菜种皮特异启动子.
Fig．１　ConstructionschemeofthreepromotersGerb,
Bnt and３５SrecombinedintothebinaryvectorpCAMＧ
BIA１３９１ＧZ　TB(L),TB(R)．Leftandrightbordersofthetransfer
DNA;PolyA．Terminator;CaMV３５S．３５Spromoter;Hygr．HygroＧ
mycinresistancegeneusedasselectablemarker;MCS．Multipleclone
site;GUS．βＧglucuronidase;Gerb ．SeedＧcoatspecificpromoterfrom
Hordeumvulgare;Bnt．SeedＧcoatspecificpromoterfromBrassica
napus;３５S．ConstitutivepromoterofCaMVfrompBI１２１．
图 ２　pCAMBIA１３９１ＧZＧGerb 和 pCAMBIA１３９１ＧZＧ
Bntt(A),pCAMBIA１３９１ＧZＧ３５S (B)重组质粒的酶
切鉴定　(A)　M．标记 DL１５０００＋２０００;１．重组质粒
pCAMBIA１３９１ＧZＧGerb;２．质 粒 pCAMBIA１３９１ＧZＧGerb,
BamHI＋HindIII的双酶切;３．重组质粒pCAMBIA１３９１ＧZＧ
Bntt;４．质粒pCAMBIA１３９１ＧZＧBntt,PstI＋BamHI双酶切.
(B)　M．标志 DL２０００;１．重组质粒pCAMBIA１３９１ＧZＧ３５S;
２．质粒pCAMBIA１３９１ＧZＧ３５S,BamHI＋HindIII双酶切.
Fig．２　pCAMBIA１３９１ＧZＧGerbandpCAMBIA１３９１ＧZＧ
Bntt(A),pCAMBIA１３９１ＧZＧ３５S(B)verifiedbyrestricＧ
tionanalysis　(A)M．MarkerDL１５０００＋２０００;１．Plasmid
pCAMBIA１３９１ＧZＧGerb;２．Digestion of pCAMBIA１３９１ＧZＧGerb
withBamHI＋HindIII．３．PlasmidpCAMBIA１３９１ＧZＧBntt;４．DiＧ
gestionofpCAMBIA１３９１ＧZＧBnt withPstI＋ BamHI．(B)M．
MarkerDL２０００;１．PlasmidpCAMBIA１３９１ＧZＧ３５S;２．Digestion
ofpCAMBIA１３９１ＧZＧ３５SwithBamHI＋HindIII．
CGACA、YACGTGGC等.还有多个增强转录效
率的CAAT盒(表１).Bntt启动子序列中含有大
量与Gerb启动子中类似的元件 (表２).二者之间
也存在一些区别,如Bntt中有多种胁迫应答相关的
MYB１AT 序 列,以 及 转 录 精 确 起 始 序 列
TATABOX２和TATABOX５等.与Gerb和Bntt
相比,CaMV３５S序列中除了一些与光调节及组织
特异表达元件GATA外 (表３),其上多分布着基因
表达增强元件、转录激活元件及启动子常见元件等
(Benfeyetal．,１９９０;Tjadenetal．,１９９５).
２．３转基因拟南芥的筛选与鉴定
Gerb::GUS,Bntt::GUS 及３５S::GUS 转化
拟南芥经鉴定筛选得到T３代植株(图３).图３结
果表明,三种启动子皆已整合到拟南芥基因组当中.
２．４启动子活性的检测
对Gerb及Bntt启动子片段转拟南芥T３代植
株不同发育阶段和不同组织的样品进行GUS表达
模式的分析,转３５S 启动子的拟南芥作为阳性对
照,野生型拟南芥作为阴性对照.
对苗期(１~４周)的检测结果显示(图４ＧI),３５S
启动子驱动 GUS在全株不同部位均为较强表达
(图４ＧI:B,F,J,N);大麦Gerb启动子在第一周有
一定表达,随着幼苗生长表达增强,子叶和下胚轴的
表达较强,真叶和根中的表达相对较弱 (图４ＧI:C,
G,K,O);油菜Bntt启动子在幼苗期均表达较弱,
子叶表达量较真叶稍高 (图４ＧI:D,H,L,P).野
生型拟南芥幼苗未观察到GUS染色 (图４ＧI:A,E,
I,M).在成株中 (图４ＧII),Gerb::GUS在叶、表皮
毛、花序、茎中均有一定量的表达,角果中表达量较
高 (图４ＧII:B,E,H,K),而Bntt::GUS仅在角果
维管束及叶片中有微弱表达,其它组织中未见染色
(图４ＧII:C,F,I,L).３５S::GUS在不同组织都有
较强表达 (图４ＧII:A,D,G,J).
为进一步研究这些启动子的特点以及胁迫诱导
表达情况,分别对转基因拟南芥进行了NaCl,ABA
和３７℃高温处理.图５显示,盐胁迫时,转Gerb和
Bntt启动子的植株皆可以检测到GUS活性,大麦
Gerb启动子在叶、表皮毛、茎和果皮中均可看到明
显的表达,但花序和种子中未见染色(图５:A);油菜
Bntt启动子仅在角果(果皮和种子)中有强烈表达
(图５:A).ABA处理时,Gerb启动子在叶和茎中
表达,而花序和角果中未见明显染色(图５:B),Bnt
启动子在各种组织中均未检测到GUS染色(图５:
B).３７℃胁迫下,Gerb启动子在不同组织中均表达,
而Bnt 启动子则未检测到明显染色 (图５:C).
３　讨论
基因工程提高植物的产量和品质是基于外源基
６５８ 广　西　植　物　　　 　　　　　　　　　　　　　　３５卷
表１　Gerb假定启动子序列中的顺式作用元件分析
Table１　ListofcisＧactingelementsintheputativepromotersequenceofGerbidentifiedbyusingPLACEprogram
转录调控元件名称
Nameofthesite
碱基序列
Sequence
与转录起始位点的距离
Positionfromstart
功能
Function
参考文献
Reference
ABREATCONSENSUS YACGTGGC ＋６９７ ABA应答元件
ABAＧresponsiveelements
Kangetal．,２００２
ACGTOSGLUB１ GTACGTG ＋６２４ 胚乳特异表达所需元件
RequiredforendospermＧspecificexpression
Wuetal．,２０００a
CAATBOX１ CAAT ＋２１８,＋２６１,＋３００,＋３９６,
＋５６６,＋７７４,＋８７９,＋９３４
CAAT启动子共有序列
CAATpromoterconsensussequence
Shirsatetal．,１９８９
CCAATBOX１ CCAAT ＋２６０,＋２９９ 真核生物５′非编码区的通用序列
InvolvedinoxygenＧresponse
Wenkeletal．,２００６
CURECORECR GTAC ＋２６７,＋２８９,＋６２４,
＋８０６,＋９４８
参与氧反应
InvolvedinoxygenＧresponse
Quinnetal．,２００２
GATABOX GATA ＋１１９,＋２７４,＋７２７,＋８０２ 光调节与组织特异表达所需元件
Requiredforlightregulated,andtissue
specificexpression
Teakleetal．,２００２
IBOXCORE GATAA ＋１１９,＋２７４ 单、双子叶植物光调节共有序列
ConservedsequenceinlightＧregulated
promotersofbothmonocotsanddicots
Terzaghietal．,１９９５
LTREATLTI７８ ACCGACA ＋６７９ 低温响应元件
Requiredforlowtemperatureresponsive
genes
Nordinetal．,１９９３
POLLEN１LELAT５２ AGAAA ＋４５１,＋５４２,＋６７４,＋１７３ 花粉特异表达元件
Requiredforpolenspecificexpression
Bateetal．,１９９８
RYREPEATBNNAPA CATGCA ＋３３,＋８３１,＋８４１ 种皮特异表达元件
Requiredforseedspecificexpression
Fujiwaraetal．,１９９４
RYREPEATLEGUMINBOX CATGCAY ＋８４１ 种子贮藏蛋白特异元件
RequiredforseedＧstorageproteingenes
Ezcurraetal．,１９９９
表２　Bntt假定启动子序列中的顺式作用元件分析
Table２　ListofcisＧactingelementsintheputativepromotersequenceofBnttidentifiedbyusingPLACEprogram
转录调控元件名称
Nameofthesite
碱基序列
Sequence
与转录起始位点的距离
Positionfromstart
功能
Function
参考文献
Reference
AACACOREOSGLUB AACAAAC ＋１５４５ 胚乳特异表达元件
InvolvedincontrolingtheendospermＧspeＧ
cificexpression
Wuetal．,２０００a
MYB１AT WAACCA ＋１５３８ 脱水反应元件
InvolvedindehydrationＧresponse
Abeetal．,１９９７
CAATBOX１ CAAT ＋４１４,＋５１７,＋７２２,＋１０３３
＋１１１１,＋１１７０,＋１４９９,＋１３６９
CAAT启动子共有序列
CAATpromoterconsensussequence
Shirsatetal．,１９８９
CCAATBOX１ CCAAT ＋７２１ 真核生物５′非编码区通用序列
Commonsequencefoundinthe５′ＧnoncodＧ
ingregionsofeukaryote
Wenkeletal．,２００６
CURECORECR GTAC ＋８９７,＋１２２１ 参与氧反应
InvolvedinoxygenＧresponse
Quinnetal．,２００２
GATABOX GATA ＋３０５,＋３７８,＋３９９,＋４２８,
＋５０６,＋５３８,＋６３６,＋１０３９,
＋１１０２,＋１３５３
光调节与组织特异表达元件
Requiredforlightregulated,andtissue
specificexpression
Teakleetal．,２００２
TATABOX２ TATAAAT ＋１３７７,＋１４１２ 转录精确起始关键元件
Criticalforaccurateinitiation
Nakaminamietal．,
２００９
NTBBF１ARROLB ACTTTA ＋４３０ 组织特异表达和生长素诱导元件
RequiredfortissueＧspecificexpressionand
auxininduction
Jainetal．,２０１３
TATABOX５ TTATTT ＋１８５,＋１９１,＋３３３,＋７４０ 转录精确起始关键元件
Criticalforaccurateinitiation
Graceetal．,２００４
RYREPEATBNNAPA CATGCA ＋３４０,＋１３０６ 种皮特异表达元件
Requiredforseedspecificexpression
Fujiwaraetal．,１９９４
RYREPEATLEGUMINBOX CATGCAY ＋３４０ 种子贮藏蛋白特异元件
RequiredforseedＧstorageproteingenes
Ezcurraetal．,１９９９
７５８６期　　　　　　　　　兰欣欣等:大麦与油菜种皮特异启动子表达模式的比较
表３　３５S启动子序列中的顺式作用元件分析
Table３　ListofcisＧactingelementsintheputativepromotersequenceof３５SidentifiedbyusingPLACEprogram
转录调控元件名称
Nameofthesite
碱基序列
Sequence
启动子序列中的分布位置
Positionfromstart
功能
Function
参考文献
Reference
AS１CAMV CCACTGACGTAAGG
GATGACGCACAATCC
＋１０２ 转录激活序列
ActivationsequenceinCaMV３５Spromoter
Benfeyetal．,１９９０
CAATBOX１ CAAT ＋１４２,＋２６８,＋３３７,＋３８６,
＋４６９,＋５９５,＋６６４,＋７１３
CAAT启动子共有序列
CAATpromoterconsensussequence
Shirsatetal．,１９８９
CTRMCAMV３５S TCTCTCTCT ＋１９ 基因表达增强元件
Requiredforenhancementofgeneexpression
Paulietal．,２００４
GATABOX GATA ＋８,＋９５,＋１３２,＋２４９,
＋３２７,＋３６１,＋４２０,
＋５７６,＋６５４,＋６８８
光调节与组织特异表达元件
Requiredforlightregulated,andtissuespeＧ
cificexpression
Teakleetal．,２００２
图３　拟南芥潮霉素抗性苗的基因组PCR检测　M．DNAMarker;１Ｇ３．潮霉素抗逆苗PCR结果;Gerb启动子箭头指示８５０bp,
Bntt启动子箭头指示１６００bp,３５S 启动子箭头指示８００bp.
Fig．３　GenomicDNAPCRofHygrＧresistantArabidopsisplantwiththreepromoters　M．DNAmarker;１Ｇ３．PCRresultofHygrＧ
resistantplants;Thebandwitharrowheadrepresents８５０bpinGerbpromoter,１６００bpinBnttpromoter,８００bpin３５Spromoter．
因在转基因植物中的高效表达,而启动子对基因转
录的数量和性质起到了决定性作用(Bateetal．,
１９９８).因此转基因技术的成功应用依赖于有效的
启动子(Lietal．,２００１).目前已从不同植物中分
离获得大量的启动子.系统研究启动子的功能有助
于我们了解特定基因表达的时空模式(Inabaetal．,
２００７).本研究通过比较几种种皮特异性启动子的
表达模式,期望为后续的相关研究选择合适的启动
子提供依据.
种皮特异启动子能有效控制外源基因仅在种皮
中表达,从而可应用于改变种皮特性或聚集商业上
重要的重组蛋白(邹敏等,２０１２).相比其它类型的
启动子,从植物中鉴定的种皮特异启动子较缺乏.
拟南芥中的种皮特异启动子 AtGILT(GAMMA
INTERFERONＧ RESPONSIVE LYSOSOMAL
THIOLREDUCTASE)能够驱动报告基因在油菜
的外种皮中特异表达(Tiwarietal．,２００６;Wuet
al．,２０１１).拟南芥Banyuls(BAN)基因启动子
(ProAtBAN)转化油菜,显示该启动子在种皮中被
特异性激活,且ProAtBAN 的激活发生在胚胎发育
早期阶段的原花色素(PA)的积累部位(Nesietal．,
２００９).除拟南芥外,其它植物中也发现了种皮特异
启动子,如棉花种皮蛋白基因中的GhＧsp,只在成熟
种子中检测到该启动子的活性(Songetal．,
２０００).研究这类启动子对于我们了解启动子的异
源表达具有重要意义.
启动子表达效率及时空表达模式是启动子的顺
式作用元件与相应转录因子协同作用的结果(Fuet
al．,２００９).本研究根据已发表的文献分别从大麦
和油菜中获得两个种皮特异性启动子 Gerb 和
Bntt.PLACE软件分析Gerb和Bntt序列发现,种
皮特异性启动子Gerb和Bntt上含有大量与组织特
异相关(特别是与种子相关)的顺式作用元件,如大
麦Gerb 启动子序列中的 ACGT 元件,在水稻
GluBＧ１基因中发现其是胚乳特异表达所必须的
(Wuetal．,２０００);该启动子中还含有三个与种皮
特异表达相关的RYREPEATBNNAPA元件,以及
四个组织特异性表达相关的GATABOX(Teakleet
al．,２００２),这些元件意味着Gerb启动子能够参与
组织特异性(特别是种子)表达过程.Bntt启动子
中的AACACOREOSGLUB,在水稻中可控制胚乳
特异性表达(Wuetal．,２０００).该启动子同样含有
８５８ 广　西　植　物　　　 　　　　　　　　　　　　　　３５卷
图４　转基因及野生型拟南芥不同发育阶段 (I)和不同组织 (II)中GUS组织化学染色　I．苗期　AＧD．一周;EＧH．两周;
IＧL．三周;MＧP．四周;A,E,I,M．WT;B,F,J,N．３５S::GUS;C,G,K,O．Gerb::GUS;D,H,L,P．Bntt::GUS.II．成株期　AＧC．
Leaf(l);DＧF．花(f);GＧI．茎(st);JＧL．角果(si)．A,D,G,J．３５S::GUS;B,E,H,K．Gerb::GUS;C,F,I,L．Bntt::GUS.
Fig．４　HistochemicalstainingofGUSindiferentdevelopmentalstages(I)anddiferenttissues(II)oftransgenicArabiＧ
dopsisandWTwiththreepromoters　I．Seedling　AＧD．OneＧweekold(１w);EＧH．TwoＧweekold(２w);IＧL．ThreeＧweekold(３w);MＧ
P．FourＧweekold(４w)．A,E,I,M．WT;B,F,J,N．３５S::GUS;C,G,K,O．Gerb::GUS;D,H,L,P．Bnt ::GUS．　II．Adultplant　AＧ
C．Leaf(l);DＧF．Flower(f);GＧI．Stem(st);JＧL．Silique(si)．A,D,G,J．３５S::GUS;B,E,H,K．Gerb::GUS;C,F,I,L．Bnt::GUS．
与胚乳特异表达(１个)、种子储藏蛋白表达(１个)及
组织特异表达(多个)相关的元件,还含有与种皮特
异表达相关的双拷贝的CATGCA元件,由此显示
Bntt可能驱动相关基因的组织特异性(特别是种
子)表达.本研究GUS组化染色结果显示,Gerb在
转基因拟南芥的幼苗及成株中均有表达,且幼苗中
的表达量高于成株,但未表现出组织特异性.Bntt
驱动的GUS无论在幼苗期还是成株期表达均较弱
９５８６期　　　　　　　　　兰欣欣等:大麦与油菜种皮特异启动子表达模式的比较
图５　在NaCl(A)、ABA(B)、３７℃(C)胁迫处理下转基因拟南芥中GUS组织化学染色　l．叶;f．花;st．茎;si．角果.
Fig．５　Histochemicalstaining(GUS)invarioustissuesoftransgenicArabidopsiswithdifferentpromotersunderNaCl(A),
ABA(B)and３７℃ (C)stresses　３５S．３５S::GUS;Bnt．Bntt::GUS;Gerb:Gerb::GUS．l．Leaf;f．Flower;st．Stem;si．Silique．
且无组织特异性.前期研究显示,Gerb和Bntt在
其本身植物中均为种皮特异性启动子(Wuetal．,
２０００;黄华磊等,２００７),但在拟南芥中异源表达并
未表现明显的组织特异性,其原因可能是异源植物
０６８ 广　西　植　物　　　 　　　　　　　　　　　　　　３５卷
中的特殊调控机制包括转录因子的识别等的差异从
而对其功能产生了影响(Esfandiarietal．,２００３).
本研究中Gerb和Bntt启动子还包含大量胁迫
(光、低温、氧反应等)应答元件,如 YACGTGGC、
GTAC、LTRE、MYB１AT等,YACGTGGC与ABA
应答相关,研究表明,ABA可用于调节种子中贮藏
蛋白和mRNA的表达水平(肖娜等,２００８);Gerb中
有五个参与氧反应的 GTAC元件(Quinnetal．,
２００２);LTRE 元件在拟南芥中与低温胁迫相关
(Nordinetal．,１９９３);Bntt启动子的 MYB１AT序
列在拟南芥中为脱水应答基因rd２２启动子上的
MYB识别位点(Abeetal．,２００３),MYB转录因子
广泛参与植物的代谢活动、发育及对生物和非生物
胁迫响应(刘晓月等,２０１４).GATABOX、IBOX均
与光调节过程相关(Teakleetal．,２００２;Terzaghi
etal．,１９９５).本研究对Gerb和Bntt转基因拟南
芥进行不同胁迫处理结果显示,Gerb在不同组织中
对NaCl、ABA、３７℃处理均有响应但表达量低且无
组织特异性;Bntt除了 NaCl胁迫下在角果中有强
烈表达外,其他胁迫下均未检测到表达.以上结果
初步显示两种启动子对各种胁迫具有不同的响应.
本研究对两种启动子的比较研究只是初步结果,对
其功能的深入探讨还有待后续实验验证.
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