全 文 ：中国农学通报 第23卷 第 4期 2007年 4月
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0引言
维生素E又称生育酚（ tocopherol），是仅由植物和
光合微生物合成的一类脂溶性抗氧化剂，具有重要的
抗氧化功能，可以清除生物体内的活性氧（ Reactive
OxygenSpecies）和自由基（ FreeRadicals），维护生物
膜的稳定性，是人体必需的一类脂溶性维生素[1]。根
据侧链的饱和程度，维生素E分为生育酚和三烯生育
酚（ tocotrienol）两大类，又根据芳香环上甲基的位置
和数量，可以分为α，β,γ，δ-生育酚和α，β，γ，
δ-三烯生育酚[2]。2-甲基-6-叶绿基-1,4-苯醌甲基
转移酶（ MPBQMT）是维生素 E合成途径中的关键
酶之一，催化2-甲基-6-叶绿基-1,4-苯醌（ MPBQ）
拟南芥2-甲基-6-叶绿基-1,4-苯醌甲基转移
酶启动子在转基因烟草中的表达特性分析
刘 宾 1,2,王 磊 2,张 伟 2
（ 1河北大学生命科学学院，河北保定071002；2中国农业科学院生物技术研究所，北京100081）
摘 要:通过对报告基因GUS产物的分析进行了拟南芥2-甲基-6-叶绿基-1,4-苯醌甲基转移酶(MPBQ
MT)启动子在转基因烟草中的表达特性的初步研究。构建含该启动子和GUS报告基因的植物表达载
体,通过农杆菌介导转化烟草,对转基因烟草进行GUS组织化学染色和GUS荧光定量分析该启动子表
达特性。GUS在转基因烟草的根和种子中基本不表达,茎上有一定表达,叶上表达量最高,约是茎的
4.7~10.9倍。结果表明MPBQMT基因启动子主要在烟草绿色组织中特异性高表达。
关键词:烟草;维生素 E;2-甲基 -6-叶绿基 -1,4-苯醌甲基转移酶(MPBQMT);启动子;GUS组织化学
染色
中图分类号:Q786 文献标识码:A
CharacterizationofArabidopsisthaliana2-methyl-6-phytyl-1,4-benzoquinol
Methyltransferase(MPBQMT)GenePromoterinTransgenicTobacoo
LiuBin1,2,WangLei2,ZhangWei2
(1ColegeofLifeSciences,HebeiUniversity,Baoding071002;
2BiotechnolgyResearchInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalScience,Beijing100081)
Abstract:TheexpressionpaternofthepromoterofArabidopsisgene2-methyl-6-phytyl-1,4-benzoquinol
methyltransferase (MPBQMT)intransgenictobaccowasstudiedaccordingtotheanalysisofGUSreporter
gene.ThepromoterwasfusedwithGUSreportergeneandthisexpressioncassetewasintroducedintowild
tobaccobyAgrobacterium-mediatedtransformation.Theexpressionpaternofthepromoterwasanalyzedby
GUSstainingandquantitativefluorometricGUSassay.TheGUSstainingwasntobservedinrootsand
seedsoftransgenictobacco,whichwasvisualizedinstemsandleaves.TheGUSexpressionwasthehighest
inleaves,whichwasabout4.7~10.9timesofstems.MPBQMTpromoterwasexpressedpreferentialyin
thegreentissuesoftobacco.
Keywords:Tobacco,VitaminE,2-methyl-6-phytyl-1,4-benzoquinolmethyltransferase (MPBQMT),
Promoter,GUS-staining
基金项目:国家重点基础研究发展规划（ 973项目）资助“ 大豆应用核心种质构建与基因多样性”（ 2004CB17203）。
第一作者简介:刘宾，男，1977年出生，河北邯郸人，硕士，研究方向：植物基因工程与分子生物学。E-mail:time_729@126.com。
通讯作者:张伟，女，河北石家庄人，副研究员，博士。通信地址：100081北京市海淀区中关村南大街12号 中国农业科学院生物技术研究所。Tel：
010-62133870，E-mail:zwcaas@hotmail.com。
收稿日期:2007-02-02，修回日期：2007-02-08。
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的甲基化，产生 2,3-二甲基 -6-叶绿基 -1,4-苯醌
（ DMPBQ）[3]。MPBQ和DMPBQ能够在生育酚环化酶
（ TC）的催化下分别产生δ、γ-生育酚[4]。δ，γ-生
育酚分别在γ-生育酚甲基转移酶（ γ-TMT）作用下
分别甲基化生成β，α-生育酚[5]。研究表明生育酚环
化酶的活性在植物自然发育或胁迫过程中对生育酚
合成没有明显影响[6]，在转基因大豆中种子特异表达
的MPBQMT基因，使大豆中的δ-生育酚由原来占
总生育酚 20%降低到占 2%，MPBQMT突变体拟南
芥种子中 δ-生育酚含量累积增加，γ-生育酚含量
降低[7]。因此MPBQMT的表达及活性对决定植物维
生素E的组成起着重要作用。
天然存在的生育酚和三烯生育酚中，芳香环完全
被甲基化的α-生育酚生理活性最高，并且被人体优
先吸收利用，研究表明每天吸收7~9mg的α-生育酚
是维持肌肉、中枢神经系统和血管系统的正常代谢，
以及许多生理功能所必需的 [8]。每天吸收250mgα-
生育酚可以提高人体免疫功能，并具有降低心脑血管
疾病、防癌、防止或延缓一些慢性疾病的进程的作
用[9,10]。α-生育酚大多存在于植物绿色组织中，但这
些组织的总生育酚水平却非常低（ 10~50μg/g鲜
重）[11]。植物的非绿色组织（ 如大多数油料作物的种
子）中总生育酚含量常常比较高（ 500~2000μg/g鲜
重），而其中 α-生育酚的含量却比较低（ 84~200
μg/g鲜重），绝大多数为它的生物合成前体— γ-生
育酚[11]。占世界食用油消费30%的豆油，虽然平均每
100g豆油中就含有 100mg生育酚[12]，但是维生素 E
的活性却很低，因为其中只有不到10%为 α-生育
酚，大多为 γ-生育酚（ 60%~65%）和 δ-生育酚
（ 20%~26%）[13]。
本研究以GUS作为报告基因，对MPBQMT启动
子在转基因烟草中的表达特性进行了初步分析研究，
为人们深入了解 MPBQMT基因在植物体内的表达
特性和植物维生素E代谢途径的表达调控研究奠定
基础，为该基因的应用和富含高活性维生素E转基因
植物的培育奠定基础。
1材料和方法
1.1实验时间、地点
实验时间：2005年 10月 12日-2006年 10月
27日；实验地点：中国农业科学院生物技术研究所
植物代谢工程实验室。
1.2实验材料
1.2.1 植 物 材 料 珊西烟（ Nicotianatabacum var.
Xanthinc）由本实验室保存。
1.2.2菌种和载体 MPBQMT启动子、大肠杆菌(E.
coli)菌株 DH5α、农杆菌菌株 GV3101、pBI121质粒
由本室保存。pGEM-TEasyVector购自 Promega公
司。
1.2.3酶和试剂 各种限制性内切酶和修饰酶购自
Promega公司。X-gluc、4-MUG和 4-MU购自 Sigma
公司；其他化学药品均为国产分析纯试剂。
1.3实验方法
1.3.1植物表达载体的构建 将两端分别添加HindⅢ
和 XbaI酶切位点的 MPBQMT启动子片段与
pGEM-Teasy连接，构成pMPBQMT-promoter质粒，
测序。提取pMPBQMT-promoter质粒，用HindⅢ 和
XbaI双酶切，经1%琼脂糖凝胶电泳，回收纯化。将植
物表达载体pBI121用HindⅢ 和XbaI双酶切，1%琼
脂糖凝胶电泳，回收纯化。T4DNAligase连接两个片
段，构成pBI121-MPBQMT-promoter重组质粒，电击
转化入E.coli菌株DH5α，对获得重组质粒进行酶切
鉴定、测序分析。
1.3.2烟草的转化 将 pBI121-MPBQMT-promoter质
粒电击转化转入农杆菌 GV3101中，挑取含有
pBI121-MPBQMT-promoter质粒的GV3101单菌落，
接种于5mlYEB（ Kan50mg/L,Rif50mg/L）液体培养
基中，28℃，250rpm培养 36h。按照 1:100转接至
200mlYEB（ Kan50mg/L,Rif50mg/L）液体培养基
中，28℃，250rpm培养约 8h，至 OD600为 0.8~1.0。
10,000rpm离心5~7min，收集菌体。菌体重悬于约2
倍体积的液体MS，至OD600≈0.6左右。采用叶盘转
化法转化烟草，在含有 6-BA2mg/L+IAA0.1mg/L的
MS平板上25℃暗培养3d，将转化处理的叶盘浸于
液体MS中3~5min，在无菌滤纸上吸去残夜，转移到
含 有 CB500mg/L+Kan100mg/L+6-BA2mg/L+IAA0.
1mg/L的MS培养基上，25℃光照培养至形成愈伤组
织并分化出芽。将分化的芽切割，并移于盛MS固体
培养基(含 CB500mg/L，Km100mg/L)的培养瓶中筛
选，获得抗性植株。
1.3.3抗性植株 PCR检测 以叶片为材料，采用SDS
法提取抗性植株基因组DNA为模版进行PCR检测，
获得PCR阳性植株。
1.3.4PCR阳性植株 GUS染色 取 PCR阳性转基因
烟草的不同组织和种子，进行GUS染色（ 37℃,12h），
脱色液脱色后，在体视镜下（ NikonDIGITAL
CAMERADxm1200F）观察染色结果。
1.3.5PCR阳性植株 GUS荧光定量 提取 GUS组织
化学染色阳性转基因烟草的根、茎、叶的GUS，测定蛋
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白浓度（ Bradford法），以4-MUG为底物测定不同组织
来源的GUS酶活，单位为μgMU/min/mg。
2结果与分析
2.1MPBQMT基因启动子的植物表达载体的构建
酶切处理植物表达载体 pBI121和 MPBQMT基
因启动子，1%琼脂糖凝胶电泳，回收纯化。T4DNA连
接酶连接两个片段，构建pBI121-MPBQMT-promoter
重组质粒(图1)。对获得的阳性克隆进行酶切鉴定。获
得的载体上MPBQMT启动子序列后面带有 GUS报
告基因（ 图1），便于通过GUS染色和荧光定量观察
图1植物表达载体pBI121-MPBQMT-promoter结构图
转基因植株中启动子的表达情况。
2.2烟草的转化及抗性植株的PCR检测
本研究共转化珊西烟叶片7皿,在抗性平皿上培
养4周左右后，切下再生芽45个，3周后共获得 30
颗抗性转基因烟草。对获得的30颗抗性转基因烟草
进行PCR检测，共获得27颗PCR阳性转基因烟草
（ 图2）。
2.3GUS组织化学染色
以 27颗 PCR阳性的转基因烟草的叶片为材料
进行GUS染色，其中21颗为阳性。挑选具有代表性
图2抗性转基因烟草的PCR检测电泳图
M为Marker,CK为pBI121-MPBQMT-promoter质粒,wt为野生型烟草;1~9为转基因烟草植株
图3转基因烟草不同组织的GUS组织化学染色
A野生型烟草叶片;B转基因烟草叶片;C烟草的根(左为野生型;右为转基因);D烟草的茎(左为野生型;右为转基因);E转基因烟
草茎(左为横切;右为纵切);F烟草的种子(左为野生型;右为转基因)
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的转基因烟草，分别对其根、茎、叶、种子等组织进行
GUS组织化学染色，结果表明不同PCR阳性烟草表
达模式基本相同，但不同组织中GUS活性存在较大
差异（ 图3）。
在转基因烟草叶片中GUS基因有较高表达（ 图
3-B），与野生型烟草叶片有明显区别（ 图 3-A）；GUS
基因在转基因烟草的根上观察不到表达，与野生型的
根基本没有区别（ 图3-C）；在转基因烟草的茎上也明
显观察到了GUS的表达（ 图3-D），但表达程度没有叶
片中的高，为了更为清晰的观察GUS基因在茎中的
表达情况，我们对转基因烟草的茎先横切和纵切，再
进行GUS组织化学染色，发现在茎毛和表皮上GUS
基因有表达，但表达量较低，皮层、初生韧皮部和原
生、后生木质部有较高表达(图3-E)，其中初生韧皮部
的表达量最高，比叶片着色深；在授粉37天的种子上
也没有观察到GUS基因的产物（ 图3-F）。
2.4GUS荧光定量
以转基因烟草叶片的GUS组织化学染色结果为
依据，挑选具代表性的转基因烟草，分别提取它们根、
茎、叶的GUS，进行荧光定量。结果表明GUS基因在
转基因烟草的根、茎、叶中表达量明显不同（ 图4）。
野生烟草没有内源的 GUS基因，所以其根、茎、
叶没有GUS酶活；转基因烟草根部的GUS酶活也很
低，与野生型烟草的根没有区别，说明GUS基因在转
基因烟草的根中没有表达。转基因烟草叶片GUS酶
活最高，最高达到 0.1547μgMU/min/mg（ 4号样品），
最低为 0.0325μgMU/min/mg（ 2号样品），茎上的
GUS酶活比叶片的低，最高为0.0305μgMU/min/mg
（ 4号样品），最低为 0.0030μgMU/min/mg（ 2号样
品）； 转 基 因 烟 草 叶 片 GUS酶 活 平 均 值 为
0.1038μgMU/min/mg，茎的 GUS酶活平均值为
0.0183μgMU/min/mg。叶片GUS酶活的平均值约是
茎的5.65倍，最高是茎的10.9倍。说明GUS基因总
体上在转基因烟草叶片中的表达量最高，虽然通过
GUS染色观察到在茎的局部组织中GUS基因表达超
过了在叶片中的表达，但总体上GUS在茎中的表达
量低于在叶中的表达量。
3讨论
生育酚是一组苯环上有多个甲基的苯并二氢吡
喃衍生物，都具有一个疏水侧链和一个芳香环的极性
头部，当参与膜组成时，它们的疏水侧链插入脂双层
分子的疏水核心，而极性头部保留在膜的表面[11]。到
目前为止，生育酚合成所必须基因都在蓝细菌和拟南
芥中找到[2,3]。生育酚能有效清除脂类过氧化及光合过
程产生的单线态氧、过氧化氢、超氧阴离子、羟基自由
基等活性氧[14,15]，使膜免受脂类过氧化物的伤害，维护
生物膜的完整性和稳定性[16]。
MPBQMT和γ-TMT是决定组织中生育酚组成
的关键酶 [2]。大豆MPBQMT突变体影响其种子中
δ，β-生育酚与γ，α-生育酚的比例，该突变体中
δ-生育酚的含量提高了4~25倍，同时γ-生育酚含
量下降，但是总生育酚含量不变[7]。目前，关于维生素
E合成途径中的关键酶的研究主要集中在尿黑酸叶
绿醇转移酶（ HPT）和 γ-生育酚转甲基酶（ γ-TMT）
上，关于MPBQMT的研究报道还较少，MPBQMT在
烟草体内的表达特性也未见报道。本研究中以该启动
子驱动的报告基因GUS在转基因烟草的根和种子中
未见表达，而已有文献报道中均发现种子中含有较高
的γ-生育酚，推测这可能是由于本研究只取了转基
因烟草授粉后37d的种子进行检测，或者MPBQMT
启动子仅在烟草种子发育的某一阶段表达或表达量
较低造成，也可能MPBQMT仅在种子的某一特定部
位表达，其中的具体原因有待进一步研究。
本实验室在对拟南芥 MPBQMT启动子在转基
因拟南芥中的表达特性的研究中发现，其表达特性
（ 数据未显示）与在烟草中的基本一致。此外，本实验
室在对拟南芥尿黑酸叶绿醇转移酶(HPT)和γ-TMT
启动子的研究中发现：γ-TMT主要在茎叶等绿色组
织表达[17]，与本研究中MPBQMT的表达模式基本一
致，而控制维生素E合成总含量的HPT基因的表达
模式则与之相反，其主要在根中表达[18]。这都于相关
文献中报导的 α-生育酚主要存在于绿色植物组织
里，但绿色组织中总生育酚含量较低[11]，而在植物的
非绿色组织中，比如大多数油料作物的种子中，总生
育酚含量很高，但其中累积的主要是γ-生育酚和三
图4转基因烟草根、茎、叶的GUS荧光定量
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烯生育酚[19]的测定结果相一致。
4结论
通过对转基因烟草的不同组织进行GUS染色和
GUS荧光定量表明：GUS在转基因烟草的根和种子
中基本不表达，茎上有一定表达，叶上表达量最高，约
是茎的2.4~10.9倍。推测MPBQMT基因启动子主要
在烟草绿色组织中特异性高表达。
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（ 责任编辑：秦守亮）
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