全 文 ：广 西 植 物 Guihaia　Dec．２０１５,３５(６):７８２－７８５　　　　　　　　　　 http://journal．gxzw．gxib．cn　
DOI:１０．１１９３１/guihaia．gxzw２０１４０５００３
王磊,刘金磊,卢凤来,等．酶催化糖基转移反应在改善罗汉果苦味皂苷口味中的应用[J]．广西植物,２０１５,３５(６):７８２－７８５
WangL,LiuJL,LuFL,etal．Improvethetasteofbittermogrosidebyenzymaticglycosylationmethod[J]．Guihaia,２０１５,３５(６):７８２－７８５
酶催化糖基转移反应在改善罗汉果苦味皂苷口味中的应用
王　磊１,２,刘金磊１,卢凤来１,宋云飞２,李元元２,李典鹏１∗
(１．广西植物功能物质研究与利用重点实验室,广西植物研究所,广西 桂林５４１００６;
２．桂林莱茵生物科技股份有限公司,广西 桂林５４１１９９)
摘　要:罗汉果皂苷II是罗汉果嫩果的主要皂苷成分,味道极苦,在罗汉果生产季节的末期大量滞长果(苦
果)因为天气原因而产生,这些滞长果因体内的苦味皂苷尚未转化为甜味皂苷而被丢弃;另外,在罗汉果甜苷
提取行业中,脱苦工艺同样会产生大量的苦味罗汉果皂苷II.但在化学结构上,罗汉果苦味皂苷与甜味皂苷
拥有完全相同的苷元部分,仅存在葡萄糖残基数目和位置的差别.该研究通过酶催化糖基转移反应将新的葡
萄糖基团引入苦味的罗汉果皂苷II中,可以延长其糖链,从而达到改善其口味的目的.该研究从原料选择、糖
源选择以及反应温度等多方面考察了反应条件,最终确定的反应最佳条件为纯度在５０％以上的罗汉果皂苷
II、２倍于皂苷重量的淀粉、６０U􀅰gＧ１罗汉果苦味皂苷的酶、６０~６５℃反应２４h.经实际罗汉果苦果样品验证
了方法的可行性,所获得的产品可以完全消除苦味,并且带有淡淡的甜味,经 HPLCＧMS确定了所获得的微甜
产物为３~６个糖的皂苷混合物.该方法对于目前罗汉果生产中大量出现并被遗弃的嫩果、苦果以及脱苦工
艺中产生的罗汉果皂苷II而言,是一种潜在的实现废物利用的方法.
关键词:罗汉果皂苷;葡萄糖转移酶;酶应用
中图分类号:Q８１４．９　　文献标识码:A　　文章编号:１０００Ｇ３１４２(２０１５)０６Ｇ０７８２Ｇ０４
Improvethetasteofbitermogrosideby
enzymaticglycosylationmethod
WANGLei１,２,LIUJinＧLei１,LUFengＧLai１,SONGYunＧFei２,
LIYuanＧYuan２,LIDianＧPeng１∗
(１．GuangxiKeyLaboratoryforFunctionalPhytochemicalsResearchandUtilization,GuangxiInstituteofBotany,
Guilin５４１００６,China;２．GuilinLAYNNaturalIngredientsCorp．,Guilin５４１１９９,China)
Abstract:MogrosideIIisabittermogrosideandthemainsaponincomponentofunripeSiraitiagrosvenori(LuohanＧ
guo)fruit．Duetotheexistenceofbittermogroside,therearenumerousbitterfruits(growtharrest)whicharedisＧ
cardedonthebranchesinthelateharvestseason．Theonlydiferencebetweenbitterandsweetmogrosidesonthe
molecularstructureisthenumberofglucosegroups．Therefore,itcanbeachievedthepurposeofimprovingthetaste
ofbittermogrosidebyintroducingnewglucoseresiduesonitschemicalstructure．Inthispaper,glycosyltransferase
enzymeＧcatalyzedreactionwasappliedtoextendthesugarchainsofbittermogrosideII．TheoptimumreactioncondiＧ
tionsweredeterminedtobemorethan５０％puritymogrosideII,２timesofstarchinweight,６０U􀅰gＧ１enzymeacＧ
cordingtomogrosideIIinweight,６０－６５℃reactiontemperature,and２４hoursreactiontime．Basedonabove
reationcondtions,bitterS．grosvenorifruitswerecolectedandusedtoconfirmfeasibilityofthismethod．TheresulＧ
收稿日期:２０１４Ｇ１１Ｇ０６　　修回日期:２０１５Ｇ０５Ｇ１５
基金项目:国家自然科学基金(８１１６０５１８);桂林市科技攻关项目(２０１２０１０５Ｇ６,２１１０１１２Ｇ１６,２０１２０１１８Ｇ６);广西植物功能物质研究与利用重点实
验室项目(ZRJJ２０１２Ｇ７,ZRJJ２０１３Ｇ５).
作者简介:王磊(１９８３Ｇ),男,广西柳州人,博士,助理研究员,研究方向为天然产物修饰,(EＧmail)ww８３０４＠１６３．com.
∗通讯作者:李典鹏,博士,研究员,研究方向为植物化学及药物化学,(EＧmail)phytoldp＠hotmail．com.
tedproducdwasnolongerbitterbutslightlysweet,ByHPLCＧMSdetection,thecomponentsofthefinalmixture
weredeterminedtobesaponinscontaining３－６sugars．ThismethodcanimprovethetasteofmogrosideII,anditis
apotentialapproachtoutilizeresourcesofabandonedmogrosideIIinindustrialproductionandbitterS．grosvenori
fruitinagriculture．
Keywords:mogroside;gluconeogenesis;applicationofenzymes
　　罗汉果皂苷具有诸多保健功效,已有的研究指
出罗汉果皂苷或其苷元具有抗氧化、防癌及降血糖
等功效(Shietal．,２０１４;Dietal．,２０１１;Murataet
al．,２０１０;Zouetal．,２０１５;Jinetal．,２０１２;Chiuet
al．,２０１３).罗汉果皂苷是一类葫芦烷型的四环三
萜皂苷,目前已从罗汉果中提取出２０多种不同的皂
苷成分,它们的区别主要是苷元３位和２４位连接的
葡萄糖链不同.考察罗汉果皂苷的结构与味觉的关
系可以发现,其口味的苦与甜是由苷元所连接的葡
萄糖残基数目所决定的,而糖链上葡萄糖残基相互
连接的不同位置只能改变皂苷的相对甜度.苷元本
身是苦味的,而苷元的３位和２４位连接的葡萄糖残
基总数为１~３个时是苦味的(苦苷),连接４~６个
葡萄糖的皂苷则都是强甜味的(甜苷),从罗汉果中
提取作为甜味剂使用的罗汉果总皂苷正是这部份含
有４~６个葡萄糖的皂苷的混合物(Lietal．,２００７;
Jiaetal．,２００９;Murataetal．,２００６;Xiaetal．,
２００８).其中尤其以罗汉果皂苷 V含量最高,一般
为总量的３０％~４０％,因而使其成为衡量罗汉果品
质的标准(苏小建等,２００８).
在罗汉果皂苷生产中不可避免地会有少量含葡
萄糖残基较少的苦味皂苷产生,并被做为废弃物遗
弃,同时受天气及植株营养消耗等因素影响每年采
收季末会有大量罗汉果无法成熟,成为所谓的滞长
果或苦果,这部份果实含有大量以罗汉果皂苷IIE为
主的苦味皂苷.为了解决罗汉果生产中的苦果问
题,目前主要是从新品种培育和田间管理入手,希望
能减少苦果和落果产生,但这并不能从根本上解决
问题,因为苦苷是罗汉果自身生物合成甜苷过程中
所必须经历的一个阶段.因此需要适当转变研究思
路,探索新的方法,如果能够直接将苦苷作为资源利
用起来,将会从根本上解决苦果和苦苷的问题.
１　实验部分
１．１材料及试剂
罗汉果(青皮果)均采自永福县龙江乡,所用乙
腈、甲醇为色谱纯,其它试剂均为分析纯,环糊精葡
糖基转移酶购自阿玛诺天野酶制剂公司.
１．２仪器及测试条件
HPLC使用仪器为Agilent１２００分析型高效液
相色谱仪.色谱条件:色谱柱为ZORBAXSBC１８
柱(４．６mm×１５０mm,５μm);柱温３０℃;流动相为
水Ｇ乙腈(梯度洗脱０~２５min,１３．５％~３５％乙
腈);检测时间２５min;流速０．８mL􀅰minＧ１;检测波
长２０３nm;进样量１０μL.LCＧMS使用的仪器为
Agilent１１００LC/MSD液质联用仪,色谱条件同
上.核磁共振试验使用 BrukerAvanceIII５００
MHz核磁共振波谱仪.
２　制备方法
２．１苦味皂苷的制备
取罗汉果苦果或落地果,破碎,加水或加
４５％~５５％体积的乙醇提取,提取液过大孔树脂柱
层析,水洗树脂柱至流出液无色,用７０％~９０％体
积的乙醇洗脱,洗脱液回收乙醇,干燥,得罗汉果苦
味皂苷.
２．２反应条件
取罗汉果苦味皂苷溶于水中,加入罗汉果苦味
皂苷重量１~４倍的淀粉,按４０~６０U􀅰gＧ１罗汉果
苦味皂苷的量加入环糊精葡萄糖基转移酶,在６０~
６５℃条件下酶催化反应至完全,灭酶活,反应液过
滤,收集滤液;所得滤液直接过大孔树脂柱或反相硅
胶柱层析,水洗,乙醇梯度洗脱,收集３０％~４０％体
积的乙醇洗脱液;将收集的这些乙醇洗脱液或流出
液浓缩、干燥,得罗汉果甜味皂苷混合物.
２．３罗汉果皂苷含量测试
样品溶液的配制:准确称取样品粉末０．１g,置
于１００mL具磨口塞锥形瓶中,精确加入２５mL甲
醇,摇匀,称定重量;超声处理１h,冷却,再重新称
重,甲醇补足损失的重量;摇匀,以０．４５μm微孔滤
膜过滤,滤液作为供试品溶液.
标准溶液的配制:分别精确称取罗汉果苷对照
品５mg,置于５mL的容量瓶中,加甲醇溶解并定
容至刻度,即得１mg􀅰mLＧ１标准溶液.
３８７６期　　　　　　　王磊等:酶催化糖基转移反应在改善罗汉果苦味皂苷口味中的应用
HPLC的条件同１．２,采用标准曲线法,计算罗
汉果的皂苷含量.
３　结果与分析
３．１原料要求
环糊精葡萄糖基转移酶催化淀粉水解并将葡萄
糖残基转移至罗汉果苦味皂苷上是一个竞争性的反
应,理论上化合物中只要含有羟基就有可能成为潜
在的葡萄糖受体.但是,通过对实际样品多次不同
条件下反应所获得的产物进行１H NMR、１３CNMR
及HSQC核磁试验,发现罗汉果皂苷苷元部分的３
个羟基始终没有参与反应,新生成的葡萄糖基团均
处在原皂苷的糖链部分,也就是说葡萄糖链更适合
成为反应的受体.因而在准备原料苦味皂苷时仅需
考虑果实中的多糖、寡糖和其他带糖的苷类物质的
影响.通过研究我们发现使用大孔树脂直接处理果
实的水提液,富集皂苷即可除掉大部分干扰物.
在酶催化下底物淀粉同时发生水解、分子内糖
转移和分子间糖转移等多种反应,因而在多种反应
竞争情况下必需尽量提高原料苦味皂苷含量才能保
证反应的产率.通过 HPLC检测反应中罗汉果皂
苷IIE的减少情况(表１),可发现随着原料纯度提
高,反应物减少越多.经大孔树脂处理过的罗汉果
皂苷IIE原料中残余的杂质主要是以黄酮(苷)为主
的一些小分子化合物,因而必需保证反应物中罗汉
果皂苷IIE的含量达到５０％才能获得较好的收率.
表１　不同纯度罗汉果皂苷IIE反应２４h后的剩余情况
Table１　RemainingamountofmogrosideIIEafter
２４hbyusingdifferentpurityreactants
项目Item
皂苷IIE含量
ContentofmogrosideIIE (％)
反应前
Beforereaction
２３ ３６ ５０ ６７ ９３
反应后
Afterreaction
１１ １０ ７ ８ ８
相对减少量
Relativereduction
５２ ７２ ８６ ８８ ９１
　注:反应条件为２倍重量的淀粉、６０U􀅰gＧ１罗汉果苦味皂苷的酶、６０℃.
　Note:Reactionconditionsare２timesofthestarch(weight),６０U􀅰gＧ１enＧ
zyme(bytheweightofmogroside),６０℃.
３．２淀粉的选择和用量
做为反应的底物和糖源,淀粉的选择十分重要,
通过 HPLC检测罗汉果皂苷IIE的消耗量,对比测
试了包括水溶性淀粉、土豆淀粉、糊精、玉米淀粉等
多种来源的淀粉(表２).由表２可知,不同的淀粉
对反应的影响并不大,虽然反应初始阶段各种淀粉
的速率略有不同,但最终都能使９０％左右的罗汉果
皂苷IIE发生反应.
表２　不同淀粉作为糖源对罗汉果
皂苷IIE消耗情况的影响
Table２　RemainingamountofmogrosideIIE
byusingdifferentamountsstarchs
反应时间
Reactiontime
(h)
水溶性淀粉
WaterＧsoluble
starch
土豆淀粉
Potato
starch
糊精
Dextrin
玉米淀粉
Corn
starch
３ ０．６３ ０．４７ ０．５５ ０．４６
１２ ０．９１ ０．８９ ０．９０ ０．８７
２４ ０．９３ ０．９０ ０．９１ ０．８９
　注:反应液中减少的罗汉果皂苷IIE的量与反应前的比值;反应条件为含量
９３％的罗汉果皂苷IIE、２倍重量的淀粉、６０U􀅰gＧ１罗汉果苦味皂苷的酶、６０
℃.下同.
　Note:Ratiobetweenreductionamountandtheoriginalamountofmogroside
IIE;ReactionconditionsarecontentofmogrosideIIEis９３ ％,２timesthe
weightofstarch,６０U􀅰gＧ１enzyme(bytheweightofmogroside),６０℃．The
samebelow．
　　当固定使用水溶性淀粉为底物考察不同淀粉用
量对反应的影响时,发现淀粉的用量会对反应造成
很大影响.由表３可知,当加入的淀粉为罗汉果皂
苷IIE质量的２~４倍时反应率最高,过多或过少的
淀粉都会影响糖基向罗汉果皂苷IIE的转移反应.
表３　淀粉用量对罗汉果皂苷IIE消耗情况的影响
Table３　RemainingamountofmogrosideIIE
byusingdifferentamountsofstarch
反应时间
Reactiontime
(h)
１倍量
１time
２倍量
２times
４倍量
４times
６倍量
６times
８倍量
８times
３ ０．５５ ０．６４ ０．６２ ０．５１ ０．４３
１２ ０．７７ ０．８９ ０．９０ ０．６８ ０．６１
２４ ０．８５ ０．９１ ０．９０ ０．７７ ０．６９
表４　反应温度对罗汉果皂苷IIE消耗情况的影响
Table４　RemainingamountofmogrosideIIE
byusingdifferenttemperature
反应时间
Reactiontime
(h)
反应温度 Reactiontemperature(℃)
４０ ４５ ５０ ５５ ６０ ６５ ７０
３ ０．３９ ０．３７ ０．３５ ０．４２ ０．６３ ０．６７ ０．６４
１２ ０．６６ ０．６５ ０．６８ ０．８３ ０．９２ ０．９２ ０．８６
３．３反应温度
酶催化反应受温度的影响很大,如表４所示,随
着反应温度的提高反应速率明显加快,尤其在６０~
６５℃范围内罗汉果皂苷IIE的消耗速度最快,而更
高的温度则会影响酶的稳定性,所以７０℃时反应速
率反而下降.因此反应最佳温度为６０~６５℃.
４８７ 广　西　植　物　　　 　　　　　　　　　　　　　　３５卷
图１　酶催化反应前(上)后(下)的高效液相色谱图
Fig．１　HPLCspectraofenzymaticreaction(upper:beforereaction,lower;afterreaction)
３．４反应条件验证和产物的鉴定
确定反应最佳条件后,我们用收集的罗汉果苦
果实际样品进行验证.将１００个罗汉果苦果(未成
熟的滞长果,重约３kg)打碎、水提、大孔树脂D１０１及
D９００分别精制后获得罗汉果皂苷６３g(罗汉果皂苷
II含量６７％),将此原料置于如下条件反应:皂苷重
量２倍的水溶性淀粉,６０U􀅰gＧ１罗汉果皂苷的环糊
精葡萄糖基转移酶,６０~６５℃下搅拌反应２９h.产
物经大孔树脂D１０１吸附后的洗脱液浓缩干燥得淡
黄色固体５９g,经 HPLCＧESIMS鉴定,产物中除少
量未反应的罗汉果皂苷IIE外,生成了大量３~６个
糖的皂苷,其液相色谱图见图１.由图１可以看出,
１３~１８min的色谱峰均为罗汉果皂苷IIE增加葡萄
糖的产物,其中部分含量较高的色谱峰在图中标出:
罗汉果皂苷IIE(HPLC:１８．７３４min,MS:７９９．７)、三
糖苷(HPLC:１７．９５１,１７．２７６min,MS:９６１．８)、四糖
苷(HPLC:１６．２３３,１５．６７６min,MS:１１２４．０)、五糖
苷(HPLC:１５．１２０,１４．６５９,１４．３２４,１３．９０９min,
MS:１２８６．１).作为糖基受体的罗汉果皂苷IIE的３Ｇ
和２４Ｇ的葡萄糖上各有４个游离的羟基,因而存在众
多可能的反应产物,因此在色谱图上显示出了极其
复杂的产物,其具体的化学结构仍需继续研究.
综上所述,利用酶催化糖基化反应处理罗汉果
苦味皂苷是一种可行的方法,利用该方法制备的罗
汉果皂苷可以完全消除苦味,并且带有淡淡的甜味,
虽然无法与天然罗汉果皂苷V相比,但它仍保留与
天然皂苷相同的化学结构特征,提供了一种低甜度
的选择,对于罗汉果提取行业中脱苦工艺产生的苦
味皂苷废弃物,以及农业生产上不能自然成熟的罗
汉果苦果问题都是较好的解决办法.
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