全 文 :园艺学报,2016,43 (5):991–997.
Acta Horticulturae Sinica
doi:10.16420/j.issn.0513-353x.2016-0009;http://www. ahs. ac. cn 991
收稿日期:2016–03–11;修回日期:2016–05–13
基金项目:国家自然科学基金项目(31060148,31260258)
* 通信作者 Author for correspondence(E-mail:guanli@xju.edu.cn)
西瓜花叶病毒新疆鄯善分离物的纯化及不同甜
瓜品种的抗病性鉴定
王 东,杜姗姗,李 冠*
(新疆大学生命科学与技术学院,乌鲁木齐 830046)
摘 要:从新疆哈密瓜(Cucumis melo L.)主产区之一的鄯善县采集表现病毒病症状的哈密瓜嫩叶,
经昆诺藜连续 3 次单斑分离纯化后,采用 RT-PCR 扩增、克隆和测序分析,将该分离物鉴定为西瓜花叶病
毒(Watermelon mosaic virus,WMV)。利用该分离物,采用汁液摩擦接种法对 12 个常见的甜瓜商业品种
和 13 个国际通用的甜瓜白粉病生理小种鉴别寄主进行室内抗病性鉴定,结果表明,所有供试品种中没有
免疫和高抗品种,表现抗病、中抗、感病和高感的品种分别有 1、11、10 和 3 个,其中表现抗病的为 Iran H。
关键词:甜瓜;西瓜花叶病毒;抗性评价;分离物
中图分类号:S 652 文献标志码:A 文章编号:0513-353X(2016)05-0991-07
Purification of a Watermelon mosaic virus Isolate from Shanshan County
and Evaluation for the Virus Resistance of Various Melon Cultivars
WANG Dong,DU Shan-shan,and LI Guan*
(College of Life Science and Technology,Xinjiang University,Urumqi 830046,China)
Abstract:As one of the most important economic crops in Xinjiang,Hami melon(Cucumis melo L.)
is of high reputation over the world. However,virus diseases are currently a serious threat for sustainable
production of Hami melon because of the lack of effective antivirus chemical and appropriate virus-control
method. To develop virus-resistant varieties,young leaves of Hami melon with virus-infected symptoms
were collected from Shanshan county,which is one of the major Hami melon growing locations in
Xinjiang. This specimen was biologically cloned by three local lesion passages in Chenopodium quinoa.
Such biologically cloned virus is hereafter called an isolate,which was further identified by RT-PCR
amplification,molecular cloning and sequencing. The results showed that the purified isolate was
Watermelon mosaic virus(WMV),which was then inoculated to some common commercial melon
varieties and 13 international universal hosts for identification of melon powdery mildew physiological
races by mechanical rubbing,the laboratory evaluation of virus resistance indicated that there was no
immune and high resistance varieties in the present study. The number of resistance,moderate resistance,
sensitivity,and high sensitivity varieties were 1,11,10,and 3,respectively,out of these,cultivar
Iran H showed resistance to WMV isolate.
Key words:melon;Watermelon mosaic virus;evaluation for the resistance;isolate
Wang Dong,Du Shan-shan,Li Guan.
Purification of a Watermelon mosaic virus isolate from Shanshan County and evaluation for the virus resistance of various melon cultivars.
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图 1 感病哈密瓜叶片在田间的症状
Fig. 1 The leaves of Hami melon with virus-infected
symptoms in the field
新疆位于欧亚大陆的腹地,远离海洋,具有典型的大陆性气候特点,空气干燥,降雨量少,昼
夜温差大,日照充足(Han et al.,2009),是中国甜瓜产量最大的地区之一(王志丹,2014)。然而,
新疆甜瓜受到病毒病的为害严重,产量降低,品质下降,严重的年份甚 至导致整个田块的甜瓜失去
商品价值(谢浩 等,1994;李继洋 等,2015)。甜瓜病毒病在新疆发生的历史尚无文字记载,据称
是 1958 年以后随着西葫芦的引进和种植面积扩大后逐步发生的(谢浩 等,1994)。据文献报道,为
害新疆甜瓜的主要病毒为西瓜花叶病毒(Watermelon mosaic virus,WMV)、黄瓜花叶病毒(Cucumber
mosaic virus,CMV)、小西葫芦黄化花叶病毒(Zucchini yellow mosaic virus,ZYMV)和南瓜花叶
病毒(Squash mosaic virus,SqMV)(尹玉琦 等,1982;魏宁生 等,1991;谢浩 等,1994)。其中
WMV、CMV 和 ZYMV 也是为害世界其他地区葫芦科作物的最主要病毒(Desbiez & Lecoq,1997;
Lecoq & Desbiez,2012;Vučurović et al.,2012)。
在新疆,1982 年尹玉琦等(1982)首次报道 WMV 是为害哈密瓜最严重的病毒,田间发病植株
90%以上是由 WMV 引起。随后的研究表明 WMV 已广泛地分布在新疆若干主要的甜瓜种植区,引
起比较严重的为害(魏宁生 等,1991)。目前,WMV 在新疆甜瓜种植区分布广泛,为害严重(李
继洋 等,2015)。病毒属于分子寄生物,目前尚无有效的防治方法和化学防治药剂(Moradi,2011)。
因此,利用抗病毒品种是预防病毒病蔓延和减轻其为害的有效方法,而对不同甜瓜种质进行抗病性
鉴定是培育抗病品种的前提和基础。作者从新疆哈密瓜(Cucumis melo L.)主产区之一的鄯善县采
集表现病毒病症状的哈密瓜嫩叶,经分离纯化和分子鉴定,获得 WMV 鄯善分离物。利用该分离物
对 25 个甜瓜品种进行室内抗病性鉴定,以期获得对 WMV 具有抗性的甜瓜种质,从而为新疆甜瓜
抗病毒育种和 WMV 的有效防控奠定基础。
1 材料与方法
1.1 病毒毒源的采集、分离纯化和保存
2014年 6月在新疆鄯善县采集田间自然发
病的表现病毒病症状的哈密瓜叶片(图 1),采
用汁液摩擦接种法在昆诺藜(Chenopodium
quinoa)上连续进行 3 次单斑分离纯化后,接
种到西葫芦(Cucurbita pepo)幼苗保存毒源,
大约 15 d 以后西葫芦开始出现系统症状。
1.2 病毒毒源的鉴定
1.2.1 总 RNA 提取和反转录—聚合酶链式反
应(RT-PCR)
采集用于保存毒源的西葫芦植株的新鲜病
叶,利用植物总 RNA 提取试剂盒提取病叶的总 RNA。用于检测 WMV、CMV、ZYMV、SqMV 和
番木瓜环斑病毒(Papaya ringspot virus,PRSV)的特异性引物见表 1。利用两步法 RT-PCR 对所提
总 RNA 分别检测这 5 种病毒。反转录采用 10 μL 体系,首先向 5 μL 总 RNA 中加入 10 μmol · L-1 的
反向引物 1 μL,70 ℃加热 10 min 后在冰中迅速冷却 2 min 以上,之后分别加入 2 μL 5× RT-buffer,
0.5 μL 10 mmol · L-1 dNTP mix,0.5 μL 200 U · μL-1 M-MLV 反转录酶,0.25 μL 40 U · μL-1 RNA 酶抑
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制剂和 0.75 μL DEPC(焦碳酸二乙酯)处理的双蒸水(ddH2O),42 ℃温育 1 h,之后 70 ℃加热 15
min。合成的 cDNA 用于 PCR 扩增,PCR 采用 50 μL 反应体系:3 μL cDNA,2 μL 2.5 mmol · L-1 dNTP
mix,正向引物和反向引物各 1 μL,5 μL 10 × buffer(含有 Mg2+),0.5 μL 5 U · μL-1 Taq 酶和 37.5 μL
ddH2O。PCR 反应程序见表 1。反应完成后取 3 μL PCR 产物用 1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。在总
RNA 提取和 RT-PCR 过程中,选择健康的哈密瓜叶片作为阴性对照。
表 1 用于病毒毒源鉴定的引物
Table 1 Primers used for virus identification
PCR 病毒
Virus
引物
Primer
引物序列(5′–3′)
Sequence 变性
Denaturation
退火
Annealing
延伸
Extension
循环数
Cycles
片段大小/bp
Amplicon size
参考文献
Reference
WMV WMV-F GGTTGCTGYGARTCAGTGTC 94 ℃,45 s 52 ℃,60 s 72 ℃,70 s 30 917
WMV-R CGACCCGAAATGCTAACT
刘卫荣和向本春,
2008
CMV CMV Au1u CATGGATGCTTCTCCRCGAG 94 ℃,30 s 58 ℃,30 s 72 ℃,60 s 35 850
CMV Au2d CGTAAGCTGGATGGACAACC
Stanković et al.,
2011
ZYMV CPfwd GCTCCATACATAGCTGAGAC 94 ℃,25 s 55 ℃,25 s 72 ℃,70 s 35 1 100
CPrev AACGGAGTCTAATCTCGAGC
Pfosser & Baumann,
2002
SqMV SqMV-F TGTGTACAAGATTGGTGGAGATGC 94 ℃,45 s 48 ℃,60 s 72 ℃,120 s 35 1 900
SqMV-R AGGCTTCTAAAGCGAACTGGG
Svoboda & Leisova-
Svobodova,2011
PRSV HRP52/F TCCAARAATGAAGCTGTGGATGT 94 ℃,30 s 46 ℃,120 s 72 ℃,60 s 40 850 Jain et al.,2004
RKJ3/R GTTGCGCATACCCAGGAGAG
注:WMV、CMV、ZYMV、SqMV 和 PRSV 分别表示西瓜花叶病毒、黄瓜花叶病毒、小西葫芦黄化花叶病毒、南瓜花叶病毒和番木
瓜环斑病毒。引物均用于扩增病毒的外壳蛋白基因序列。
Note:WMV,CMV,ZYMV,SqMV and PRSV show Watermelon mosaic virus,Cucumber mosaic virus,Zucchini yellow mosaic virus,
Squash mosaic virus,and Papaya ringspot virus,respectively. There primers were described to amplify coat protein(CP)gene sequences.
1.2.2 PCR产物的回收、克隆和测序分析
将 PCR 扩增获得的目的条带进行回收,PCR 产物回收试剂盒购自生工生物工程(上海)股份
有限公司。将回收的 PCR 产物与克隆载体 pMD18-T 进行连接,之后转化大肠杆菌 DH5α 感受态细
胞。采用菌落 PCR 筛选阳性克隆,LB 液体培养基 37 ℃过夜摇菌,送菌液由华大基因进行测序。
克隆载体购自宝生物工程(大连)有限公司,感受态细胞由本实验室保存。将测序获得的目的序列
在 GenBank 中进行相似性检索。采用 DNAMAN6.0 软件进行目的序列的相似性比对。
1.3 不同甜瓜品种的抗病性鉴定
选择常见的 12 个甜瓜商业品种和 13 个国际通用的甜瓜白粉病生理小种鉴别寄主种子经表面消
毒处理后在防虫温室中播种盆栽。所用的土壤事先高温高压灭菌处理。待幼苗长出两片真叶时选择
生长一致的健康植株,采用汁液摩擦接种法进行病毒接种(方中达,1998)。配制 0.1 mol · L-1(pH 7.0)
的磷酸缓冲液,加 0.1%的亚硫酸钠(Na2SO3)粉末,此为接种缓冲液。用预冷的接种缓冲液充分研
磨病叶,获得接种用的病毒汁液。在病毒汁液中加入少许活性炭,在幼苗两片真叶上撒上少许金刚
砂(400 目),用经过高温高压灭菌的毛笔蘸取病毒汁液进行摩擦接种。接种大约 15 min 后用灭菌
水将叶面上的磨料和多余汁液洗去。将接种的幼苗置于防虫温室中,温度控制在 21 ~ 28 ℃。每个
品种设置 3 个重复,每个重复接种 30 株幼苗,同时每个品种用接种缓冲液接种 30 株作为对照处理。
接种一周后逐日观察症状,45 d 后记录症状等级(陈洁云,2003):0,无明显症状;1,叶片
轻花叶或轻度卷叶;2,重花叶或植株轻度矮化;3,严重疱斑花叶伴随畸形,植株无明显矮化;4,
叶片明显缩小伴重度畸形花叶,植株明显矮化。病情指数 = ∑(感病株数 × 发病等级)/(总株数 ×
最高病级)× 100。将抗性评价标准分为 6 级(张宗义 等,1999;林清 等,2005),分别为免疫(病
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图 3 病毒分离物的 RT-PCR 检测
N:阴性对照。
Fig. 3 Detection of virus isolate by RT-PCR
N:Negative control.
情指数为 0),高抗(0.1 ~ 10),抗病(10.1 ~ 20),中抗(20.1 ~ 30),感病(30.1 ~ 60)和高感(> 60)。
2 结果与分析
2.1 病毒毒源的分离纯化
将田间自然发病的表现病毒病症状的哈密瓜叶片在昆诺藜上连续进行 3 次单斑分离纯化后获得
病毒分离物,将该分离物接种西葫芦幼苗进行保存。接种昆诺藜后,刚开始在接种叶上形成少量褪
绿斑(图 2,a1),之后褪绿斑的数量逐渐增多并进一步形成坏死斑(图 2,a2)。该分离物接种西葫
芦后形成系统花叶症状(图 2,b1、b2)。
图 2 病毒分离物的症状
a:接种昆诺藜的症状;b:接种西葫芦的症状。
Fig. 2 Symptoms of virus isolate
a:Symptoms of Chenopodium quinoa inoculated virus isolate;b:Symptoms of Cucurbita pepo inoculated virus isolate.
2.2 病毒毒源的鉴定
将分离纯化保存于西葫芦植株上的病毒分
离物进行总 RNA 提取和 RT-PCR 扩增 WMV、
CMV、ZYMV、SqMV 和 PRSV 等 5 种病毒的
外壳蛋白(Coat protein,CP)基因,只获得了
1 条大约 900 bp 的目的条带(图 3)。将该条带
回收、克隆和测序,其全长为 849 bp。在
GenBank 中进行序列的相似性检索,结果表明,
该条带为 WMV 全长 CP 基因序列,其与
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GenBank 中已登录的 WMV 分离物全长 CP 基因序列的相似性大于 94%(表 2),因此,该分离物被
鉴定为 WMV。
表 2 鄯善分离物与 GenBank 中已登录的 WMV 分离物 CP 基因全长序列的相似性值
Table 2 The sequence similarity of the complete CP sequences of WMV isolates from Shanshan and GenBank
序列相似性/% The sequence similarity 序列相似性/% The sequence similarity GenBank 登录号
GenBank accession number 核苷酸 Nucleotide 氨基酸 Amino acid
GenBank 登录号
GenBank accession number 核苷酸 Nucleotide 氨基酸 Amino acid
AB001994 94.7 97.2 EF122501 94.5 97.5
AB353119 94.7 98.2 EF127832 94.8 98.6
AB369278 94.9 98.6 EU660578 95.7 99.6
AJ579481 95.4 97.9 EU660580 94.3 97.9
AJ579521 95.5 99.6 JX079685 95.3 98.9
AY437609 95.8 99.6 KP330247 94.9 98.9
AY464948 94.1 98.9 KP406639 94.2 96.8
AY995215 95.7 98.2 KP406643 94.3 98.9
D13913 94.8 96.8 KP406644 94.3 98.9
DQ399708 94.9 98.9 L22907 94.1 97.5
2.3 不同甜瓜品种的抗病性鉴定
抗病性鉴定结果(表 3)表明,所有供试品种中没有免疫和高抗品种,表现高感的品种为伽师
瓜、PMR5 和 PMR45。在 12 个商业品种中有 6 个表现中抗,5 个表现感病;在 13 个国际通用的甜
瓜白粉病生理小种鉴别寄主中表现中抗和感病的品种均为 5 个,表现抗病的为 Iran H。所有的对照
处理植株均表现健康。
表 3 不同甜瓜品种抗西瓜花叶病毒(WMV)鉴定结果
Table 3 Resistance test for various melon cultivars against WMV
各病级株数
The number of each disease scale
甜瓜品种
Melon cultivar
0 1 2 3 4
病情指数
Disease
index
抗性评价
Evaluation
商业品种 伽师瓜 Jiashi Melon 2 8 17 63 0 64.2 高感 High sensitivity
Commercial cultivar 皇后 Queen 0 41 15 34 0 48.1 感病 Sensitivity
黄旦子 Huangdanzi 10 78 2 0 0 22.8 中抗 Moderate resistance
早黄蜜 Zaohuangmi 20 57 13 0 0 23.1 中抗 Moderate resistance
绿宝石 Green Gemstone 6 58 26 0 0 30.6 感病 Sensitivity
新密杂十一号 Xinmiza 11 5 66 19 0 0 28.9 中抗 Moderate resistance
金皇后 Golden Queen 9 17 35 29 0 48.3 感病 Sensitivity
白兰瓜 Bailan Melon 5 75 10 0 0 26.4 中抗 Moderate resistance
神帅 Shenshuai 0 28 9 53 0 56.9 感病 Sensitivity
美玉 Meiyu 9 58 23 0 0 28.9 中抗 Moderate resistance
安农 Annong 13 59 18 0 0 26.4 中抗 Moderate resistance
红心脆 Hongxincui 3 64 23 0 0 30.6 感病 Sensitivity
鉴别寄主 PMR5 0 10 26 54 0 62.2 高感 High sensitivity
Differential host PMR6 2 64 19 5 0 32.5 感病 Sensitivity
PMR45 0 2 8 24 56 87.2 高感 High sensitivity
PI414723 16 68 6 0 0 22.2 中抗 Moderate resistance
PI124111 16 59 15 0 0 24.7 中抗 Moderate resistance
PI124112 6 72 12 0 0 26.7 中抗 Moderate resistance
MR1 8 62 20 0 0 28.3 中抗 Moderate resistance
WMR29 0 17 31 42 0 56.9 感病 Sensitivity
Iran H 21 69 0 0 0 19.2 抗病 Resistance
Vedrantis 11 34 45 0 0 34.4 感病 Sensitivity
Edisto47 8 62 12 8 0 30.6 感病 Sensitivity
Topmark 4 67 19 0 0 29.2 中抗 Moderate resistance
Nantais Oblong 2 18 58 12 0 47.2 感病 Sensitivity
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3 讨论
WMV 是为害新疆甜瓜最严重的病毒之一。本试验中从新疆哈密瓜主产区之一的鄯善县获得
WMV 分离物。利用该分离物对一些常见的甜瓜商业品种和 13 个国际通用的甜瓜白粉病生理小种鉴
别寄主进行室内抗病性鉴定,从而为 WMV 的有效防控和甜瓜抗病毒育种提供依据。
在种质资源抗病性鉴定中,大田接种鉴定虽然更接近生产实际,但田间接种容易受到地理位置
和气候环境的影响,另外田间大量接种成本较高而且费时费力,而室内鉴定能够保证鉴定条件的一
致性,用时短,成本低(张美鑫 等,2014)。因此,本试验中采用室内接种鉴定的方法对不同甜瓜
品种进行抗性测定。
据文献报道,在全世界范围内为害葫芦科作物的主要病毒为 WMV、CMV、ZYMV、SqMV 和
PRSV(Desbiez & Lecoq,1997;Lecoq & Desbiez,2012;Vučurović et al.,2012)。WMV、CMV、
ZYMV 和 SqMV 在新疆已有报道(尹玉琦 等,1982;郑光宇和董涛,1989;魏宁生 等,1991;谢
浩 等,1994)。本研究中在进行病毒分离物种类鉴定时,对这 5 种严重为害葫芦科作物的病毒都进
行了分子鉴定,从而排除分离物中混合有其他病毒的可能性,为后续品种抗病性鉴定提供了纯净的
病毒分离物。
近年来调研发现,目前在新疆主栽的甜瓜品种对病毒病都比较敏感,很难发现对病毒病有良好
抗性的品种。因此,本研究中除了选用一些常见的甜瓜商业品种以外,还选用 13 个国际通用的甜瓜
白粉病生理小种鉴别寄主进行抗病性鉴定。这些鉴别寄主虽然没有在大田中大面积栽培,但其很可
能存在对病毒有良好抗性的抗病基因(Brotman et al.,2002)。例如,鉴别寄主 PI414723 中就携带
对 ZYMV 具有抗性的 Zym 基因(Romay et al.,2014)。本试验的研究结果表明,鉴别寄主 Iran H 对
WMV 鄯善分离物具有较好的抗性,其抗病机理和相关抗性基因的发掘有待进一步的研究。
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