全 文 ：南 方 农 业 学 报
收稿日期：2013-04-09
基金项目：国家公益性行业科研专项项目（201303028）；江苏省农业科技自主创新项目［SCX（13）3181］
作者简介：*为通讯作者，程兆榜（1969-），博士，研究员，主要从事植物病毒和水稻病害研究工作，E-mail：onlyone8501@126.com。
任春梅（1981-），主要从事植物病毒研究工作，E-mail：Renjie_rcm@126.com
0 引言
【研究意义】西瓜花叶病毒（Watermelon mosaic
virus，WMV）是马铃薯Y病毒属（Potyvirus）的典型成
员，主要分布于温带和地中海地区。WMV在我国陕
西、山东、云南、辽宁、山西、新疆、黑龙江等地广泛分
布（Purcifull and Hiebert，1979；张建新等，2007a），自
江苏省葫芦科作物西瓜花叶病毒的
分子鉴定和序列分析
任春梅，程兆榜*，缪 倩，魏利辉，周益军，范永坚
（江苏省农业科学院 植物保护研究所，南京 210014）
摘要：【目的】对江苏各地具典型褪绿花叶症状的多种葫芦科作物是否为西瓜花叶病毒（Watermelon mosaic virus，
WMV）侵染进行分子鉴定，明确该病毒在江苏的遗传分化。【方法】提取样品总RNA，利用西瓜花叶病毒的cp基因特
异性引物进行RT-PCR扩增，克隆测序，应用DNASTAR和Clustal X软件进行序列分析。【结果】来自南瓜、瓠瓜、西瓜
和西葫芦的11个分离物的RNA模板中均检测到1200 bp左右的片段；序列测定表明该片段含1154个核苷酸，包含完
整的编码281个氨基酸的WMV-cp基因。序列比对结果表明，11个分离物和来自不同地区的17个分离物WMV-cp基因
核苷酸和推导的编码CP蛋白氨基酸序列同源性分别为90.5%~100.0%和92.9%~100.0%。【结论】WMV的遗传变异与
地缘相关性较强而与寄主相关性较弱。江苏分离物WMV-CP氨基酸均具有蚜传株系的特征结构域DAG，暗示其田间
流行与蚜虫有关。
关键词：西瓜花叶病毒；葫芦科作物；cp基因；序列分析；江苏
中图分类号：432.41 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2013）09-1464-07
DOI：10.3969/j：issn.2095-1191.2013.9.1464
南方农业学报 JOURNAL OF SOUTHERN AGRICULTURE 2013，44（9）：1464-1470
ISSN 2095-1191；CODEN NNXAAB http：//www.nfnyxb.cn
Molecular identification and sequence analysis for watermelon
mosaic virus in Jiangsu
RENChun-mei，CHENGZhao-bang*，MIAOQian，WEILi-hui，
ZHOUYi-jun，FANYong-jian
（Institute of Plant Protection，Jiangsu Academy of Agricultural Sciences，Nanjing 210014，China）
Abstract：【Objective】Molecular identification was conducted to identify whether varieties of cucurbit crops with typi-
cal chlorisis mosaic symptoms from Jiangsu were infected by watermelon mosaic virus （WMV）. The genetic differentiation of
WMV in Jiangsu was also defined. 【Method】Total RNA was extracted from the infected isolates and the coat protein （cp）
gene of WMV was amplified by RT-PCR with the specific primers. The DNA products were cloned and sequenced， and
sequence analysis was conducted by DNAStar and Clustalx software. 【Result】A fragment with the size of about 1200 bp
was detected from 11 isolates including pumpkin， gourd， watermelon and zucchi. Sequence analysis indicated that the nu-
cleotide fragment contained 1154 bp， including complete cp gene and encoded 281 amino acids. By DNAStar and Clustalx
software， the obtained sequences were compared with 17 reported WMV-cp sequences from different regions. The similari-
ties of nucleotide and deduced amino acid sequences among these isolates were ranged from 90.7% to 100.0% and 93.2%
to 100.0%， respectively. 【Conclusion】The phylogenetic tree of nucleotide and comparison of amino acid analysis indicated
that its genetic diversity was related to geological distribution with little difference from the host origin. Jiangsu isolates
contained the motif sequence DAG associated with aphid transmission.
Key words： watermelon mosaic virus； cucurbit crops； coat protein gene； sequence analysis； Jiangsu
然条件下可侵染葫芦科、藜科、豆科等多种植物，引起
叶片花叶和皱曲，植株矮小，坐果困难，对产量产生极
大影响，并常与番木瓜环斑病毒西瓜株系（PRSV-W）、
黄瓜花叶病毒（CMV）、小西葫芦黄花叶病毒（ZYMV）、
南瓜花叶病毒（SqMV）、番茄斑萎病毒（TSWV）等病
毒复合侵染造成严重损失（Chala et al.，1987）。田间
WMV主要由桃蚜、棉蚜等多种蚜虫以非持久性方式
传播（Rouze et al.，2001）。近年来，江苏省葫芦科作物
的年种植面积稳定在40万ha，多数年份春季雨水量偏
少，露地栽培时苗期蚜虫发生量偏大，造成包括WMV
在内的病毒流行。近几年葫芦科作物病毒病在江苏省
偏重发生，已成为影响葫芦科作物稳产高产的制约因
素之一。对江苏各地葫芦科作物上的WMV进行分子
鉴定，并与其他地区分离物进行序列比对，分析其在
江苏的遗传分化，可以明确该病害在江苏流行的成因，
并为病毒病的防控提供依据。【前人研究进展】西瓜花
叶病毒最初被分为WMV-1和WMV-2两个株系（Webb
and Scott，1965），但后续研究发现WMV-1实际上是
番木瓜环斑病毒（PRSV）的一个株系，因此国际病毒
分类委员会（ICTV）第七次报告将WMV-1归于PRSV，
而WMV-2即为WMV，本研究所涉及的WMV也即为
最初的WMV-2。WMV核苷酸全长约10 kb，具单链正
义RNA基因组，编码一个分子量为365.8 kD的多聚蛋
白，该蛋白可裂解形成10个成熟蛋白P1、HC-Pro、P3、
6K1、CI、6K2、NIa、VPg、NIa-Pro、NIb和CP，其中CP蛋
白除了与病毒的系统侵染相关外，还具有与蚜虫传播
相关的特异基序DAG，并且与HC-Pro的KITC区和
PTK区共同作用完成病毒的蚜传特性（Frenkel et al.，
1989；Yu et al.，1989；张建新等，2007b）。病毒的变异
是其流行的主要原因之一。李大伟等（2000）对山西分
离物cp基因研究表明，其CP蛋白多出4个氨基酸，蚜传
株系特征结构亦有变化。Moreno等（2004）综合分析了
西班牙甜瓜上WMV分离物几个主要基因（p1、ci、cp）
的遗传多样性，发现组内相同地区的分离物聚在一
起，说明具一定的地理相关性。张建新等（2007a）测定了
WMV中国株系（WMV-Ch）全基因组序列，发现其与
法国株系（WMV-Fr）整个基因组核苷酸一致性为
92.5%（Desbiez and Lecoq，2004），两者的差异说明
WMV在不同地区存在一定的遗传多样性。刘卫荣和
向春本（2008）分析了新疆昌吉分离物的CP氨基酸序
列，发现其变异较大且蚜传株系特征结构域发生了改
变。以上研究均表明与蚜传特征结构相关的CP蛋白在
不同地域的遗传变异性较大。【本研究切入点】鉴于江
苏近年来葫芦科作物病毒病发生偏重的现状，在江苏
各地采集具有典型褪绿花叶症状的多种葫芦科作物，
分别提取总RNA，利用西瓜花叶病毒（WMV）的cp基
因特异性引物进行RT-PCR扩增，克隆测序，采用序列
分析软件对江苏WMV分离物与已报道的其他国家及
我国其他地区的分离物进行序列同源性比较和系统
进化分析。【拟解决的关键问题】对江苏各地葫芦科作
物上的WMV进行分子鉴定，明确WMV在作物上的分
布状况，并与其他地区分离物进行序列比对，分析其
在江苏的遗传分化，明确该病害在江苏流行的成因，
为该病毒病的防控提供科学依据。
1 材料与方法
1. 1试验材料
2010~2011年从江苏南京、盐都、宿迁、连云港、金
坛、徐州、洪泽等地的瓠瓜、南瓜、西瓜、丝瓜、黄瓜、甜
瓜、冬瓜、西葫芦等葫芦科作物上采集表现为典型褪
绿花叶症状的病样32份。总RNA提取试剂Trizol购自
Invitrogen公司，Taq DNA聚合酶、dNTP、BamHⅠ、SalⅠ
购自大连宝生物公司，反转录酶M-MLV、RNA酶抑制
剂购自Promega公司，琼脂糖凝胶回收试剂盒、大肠杆
菌（E.coli DH5α）感受态细胞、pMD18-T载体购自上海
生工生物工程技术服务有限公司。
1. 2RNA提取
称取各样品病叶0.1 g，冰浴条件下迅速彻底研
磨，然后用Trizol试剂盒按产品说明书提取总RNA。
1. 3RT-PCR扩增与克隆
根据张建新等（2007a）报道的WMV分离物序列
（Genbank登录号DQ399708）设计一对用于扩增WMV-
cp基因的特异性引物：F：5′-TGGATCCTGGGATAG
GAGCAAG-3′（下划线表示带有BamHⅠ酶切位点）；
R：5′-TGTCGACATAACGACCCGAAATG-3′（下划线
表示带有SalⅠ酶切位点）。引物由上海英骏生物技术
公司合成。
按照常规RT-PCR方法合成外壳蛋白第一链及进
行PCR反应。1%琼脂糖凝胶电泳检测，柱式胶回收试
剂盒回收，回收DNA溶于30 μL的溶解液中。回收产物
与pMD18-T载体连接（参见pMD18-T试剂盒说明书），
连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，碱裂解法
提取质粒，经PCR及酶切鉴定筛选重组质粒。每个分
离物挑选两个阳性克隆进行测序，测序由上海生工生
物工程技术服务有限公司完成。
1. 4序列分析
在GenBank中利用 BLAST搜索（网址 http：//
www.ncbi.nlm.nih.gov/blast）WMV已发表的其他国
家及我国其他地区分离物（参见表2）进行比较分析。
序列比对和进化树分析分别用Clustal X（Version
1.83）和DNASTAR（5.0）软件完成。
任春梅等：江苏省葫芦科作物西瓜花叶病毒的分子鉴定和序列分析 1465· ·
南 方 农 业 学 报
2 结果与分析
2. 1江苏葫芦科作物分离物的RT-PCR鉴定
以采集到的各种表现为花叶症状的葫芦科植物
病叶总RNA为模板进行RT-PCR扩增，产物经1%琼脂
糖凝胶电泳检查，其中来自瓠瓜、南瓜、西瓜和西葫芦
的11个分离物（表1）的RNA模板得到一个长度为1200
bp左右的扩增片段，与预期目的片段大小相符，而丝
瓜、黄瓜、甜瓜、冬瓜等其他葫芦科作物上未出现预期
扩增条带（图 1）。
表 1 江苏葫芦科作物分离物的来源及采集时间
Tab.1 Source and collection time of the tested WMV isolates
序号 No. 分离物 Isolate 来源 Sampling place 寄主植物 Host plant 采集时间（年-月-日）Time of collection（Y-M-D）
1 JSHZ11-NanG 江苏洪泽 Hongze，Jiangsu 南瓜 Cucurbita modchate 2011-06-05
2 JSJT11-NanG 江苏金坛 Jintan，Jiangsu 南瓜 Cucurbita modchate 2011-06-22
3 JSLYG10-NanG 江苏连云港 Lianyungang，Jiangsu 南瓜 Cucurbita modchate 2010-09-02
4 JSNJ10-HuG 江苏南京 Nanjing，Jiangsu 瓠瓜 Lagenaria siceraria 2010-09-04
5 JSNJ10-XiG 江苏南京 Nanjing，Jiangsu 西瓜 Citrullus lanatus 2010-09-04
6 JSNJ10-XiHL 江苏南京 Nanjing，Jiangsu 西葫芦 Cucurbita pepo 2010-09-04
7 JSNJ11-HuG 江苏南京 Nanjing，Jiangsu 瓠瓜 Lagenaria siceraria 2011-07-14
8 JSSQ10-XiHL 江苏宿迁 Suqian，Jiangsu 西葫芦 Cucurbita pepo 2010-06-24
9 JSXZ11-HuG 江苏徐州 Xuzhou，Jiangsu 瓠瓜 Lagenaria siceraria 2011-07-25
10 JSYC11-XiHL 江苏盐城 Yancheng，Jiangsu 西葫芦 Cucurbita pepo 2011-06-08
11 JSYD10-NanG 江苏盐都 Yandou，Jiangsu 南瓜 Cucurbita modchate 2010-09-21
图 1 WMV-cp基因的RT-PCR扩增结果
Fig.1 Amplified fragment of WMV-cp gene by RT-PCR
M：Marker；1：丝瓜1，Cuffa cyliudrica 1；2：瓠瓜 Lagenaria siceraria；3：
黄瓜1 Cucumis sativus 1；4：丝瓜2 Cuffa cyliudrica 2；5：西瓜 Citrullus
lanatus；6：南瓜1 Cucurbita modchate 1；7：南瓜2 Cucurbita modchate
2；8：甜瓜 Cucumis melon；9：西葫芦1 Cucurbita pepo 1；10：黄瓜2 Cu-
cumis sativus 2；11：冬瓜 Benincasa hispida；12：西葫芦2 Cucurbita pe-
po 2
2. 2测序及序列同源性分析
对阳性重组质粒的插入片段进行序列测定，结果
表明，11个江苏分离物的扩增片段均含1154个核苷
酸，其中预期的cp基因全长843 bp，编码281个氨基酸。
应用DNASTAR软件对11个江苏分离物与已报道的其
他国家及我国其他地区的17个WMV分离物（表2）一
起进行cp基因的核苷酸序列和推导的编码蛋白氨基
酸序列同源性比较分析（表 3），各分离物间核苷酸序
列同源性为90.5%~100.0%，推导的氨基酸序列同源性
为92.9%~100.0%。根据Shukla等（1994）的理论，马铃
薯Y病毒属同种病毒不同分离物编码区序列的同源性
应在90%以上，不同种病毒间的同源性在38.0%~71.0%
内。由此表明本研究中的11个江苏分离物中含有
WMV。
表 2 序列比对引用的WMV分离物
Tab.2 WMV isolates used for phylogenetic comparison
序号 No. 分离物 Isolate 地理来源 Geographical origin 寄主植物 Host plant 序列登录号 Accession No.
12 CHN -Henan Henan China Cucurbita pepo EF127832
13 CHN -HLJ Heilongjiang China Citrullus lanatus AY464948
14 CHN -Liaocheng Liaocheng China Pumpkin EF122501
15 CHN Shanxi，China Citrullus lanatus DQ399708
16 France（C05-337） France Cucurbits EU660559
17 Iran（Mashhad） Iran Cucurbita pepo GQ421158
18 Iran（Urmia） Iran Cucurbita maxima JN597238
19 Israel Israel Cucurbits AF322376
20 Italy（Lecce） Italy Citrullus lanatus FJ823122
21 Japan（Akita） Japan Cucumis sativus AB693979
22 Japan Japan Habenaria AB001994
23 Pakistan（WMV-PK） Pakistan Cucumis melo var flexuosus AB218280
24 Serbia Serbia Cucumis sativus AB693979
25 Spain（M116） Spain Cucumis melon AJ579524
26 Spain（MAL99.5） Spain Cucumis melon AJ579524
27 Tonga Tonga Cucurbits WMVCOATA
28 USA USA Dendrobium anosmum（orchid） WMVCP
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
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700 bp
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任春梅等：江苏省葫芦科作物西瓜花叶病毒的分子鉴定和序列分析 1467· ·
南 方 农 业 学 报
2. 3基于cp基因核苷酸序列的系统进化分析
用DNASTAR（5.0）软件将11个江苏分离物同已
发表的17个WMV分离物一起依据cp基因核苷酸序列
同源性构建系统进化树（图 2）。从系统进化树可以看
出，28个分离物在95.3%的相似性水平上可以分为5个
小组，分离物的归类分组与地域有一定的相关性，来
自东亚的中国分离物和日本分离物同为一组（含1个
意大利分离物），中国分离物在97.6%的相似性水平上
进一步细分，4个江苏南京来自不同寄主植物的分离
物归为一组，暗示同一地区来源的WMV分离物具有
更高的同源性，而在不同寄主中不存在明显的遗传变
异性。
2. 4基于cp基因氨基酸的序列分析
用Clusta X（Version 1.83）软件分析28个WMV分
离物的氨基酸序列（图3）。比对结果显示，WMV-cp的
N′端为可变区，C′端为保守区。其中本研究中11个江
苏WMV分离物和日本、中国陕西、山东聊城、黑龙江
的4个分离物较其他分离物CP氨基酸的N′端第3、4位
多出2个氨基酸，除黑龙江的为SG（Ser，丝氨酸；
Glu，谷氨酸）外，其余均为KE（Lys，赖氨酸；Glu，谷氨
酸）。各分离物CP氨基酸N′端第10~12位均为DAG
（Asp，天冬氨酸；Ala，丙氨酸；Gly，甘氨酸），决定蚜虫
传播特性的特征结构域即为DAG（Atreya et al .，
1991），说明以上分析的各分离物都可能被蚜虫传播。
来自江苏的6个分离物（JSNJ10-XiHL、JSNJ10-HuG、
JSNJ10-XiG、JSYD10-NanG、JSJT11-NanG、JSNJ11-
HuG）在CP氨基酸的N′端第39、49、50、56、90和112位
与其他分离物均不相同，分别为A（Ala，丙氨酸）、D
（Asp，天冬氨酸）、T（Thr，苏氨酸）、A（Ala，丙氨酸）、P
（Pro，脯氨酸）、T（Thr，苏氨酸），其中4个分离物来自
江苏南京，与核苷酸序列分析结果相似，显示WMV
的遗传变异具有一定的地域性。
3 讨论
马铃薯Y病毒属是植物病毒中最大的一个属，目
前该属包括200多种植物病毒，能侵染葫芦科、茄科、
豆科和藜科等多种植物，并造成重大的经济损失。根
据Shukla等（1994）提出划分不同种病毒的基本原则，
结合本研究对江苏几种葫芦科作物上几个分离物的
克隆测序和序列比对分析，核苷酸和推导的氨基酸序
列与已报道其他分离物的WMV-cp同源性均在90.0%
以上，因此推断江苏葫芦科作物分离物中包含同种病
毒WMV。另外该病毒属病毒编码的多聚蛋白经过酶
切得到10个成熟的蛋白P1、HC-Pro、P3、6K1、CI、6K2、
NIa、VPg、NIa-Pro、NIb和CP，其中CP蛋白具有RNA衣
壳化、细胞间及长距离运输、蚜虫传播及基因组扩增
等功能（Shukla and Ward，1989）。CP的N′端存在一个
特殊的保守基序DAG（Asp-Ala-Gly），DAG的突变能
导致蚜虫的不可传毒性（Lin et al.，2000），所以在各
种关于WMV-cp的序列研究中都涉及到这一位点序
列。Atreya等（1991）研究发现，马铃薯Y病毒属病毒的
CP-N末端一段高度保守的DAG区域为许多马铃薯Y
病毒属病毒蚜传所必需，该区的改变往往引起病毒蚜
传特性的丧失。李大伟等（2000）、刘卫荣和向春本
（2008）分析的山西和新疆昌吉分离物的这一位点序
列都发生了改变，分析原因可能是田间发生的自然变
异或是在连续人工机械接种过程中造成的突变，而本
研究中江苏几种葫芦科作物上WMV-cp的N′端这一
基序均未改变，说明此地区的WMV分离物可能具有
蚜传特性，与样品均采自露地，其田间传播主要依赖
蚜虫相吻合。
国内外对西瓜花叶病毒的研究一般侧重于单一
作物，鲜见对多种葫芦科作物的比较研究。本研究检
测了江苏地区32个来自葫芦科作物上的病毒标样，仅
从南瓜、瓠瓜、西瓜和西葫芦上分离鉴定到WMV，而
其他作物上未检测到此种病毒，可能与采样时间、范
围、样本数量有一定关系，也可能与江苏WMV在不同
寄主作物上的流行分布状况相关。本研究结果显示，
在核苷酸和氨基酸序列水平上cp基因的遗传变异与
地理分布有一定的关联，地理位置较近的中国和日本
的几个分离物在系统进化上聚在同一组，而其他不同
地区和国家的分离物则多数分布在不同的亚组中，与
Moreno等（2004）分析西班牙WMV分离物所发现的
WMV分布具有一定的地理特异性及古勤生等（2008）
研究国内WMV-cp序列发现其在进化上具有一定地
理相关性的结论相符。这可能与WMV不经种传，其病
源主要来自田间野生寄主有关。不同地区因生态环境
和生物多样性差异构成不同的选择压，不同地区的
图 2 28个WMV分离物cp基因核苷酸序列同源性系统进化树
Fig.2 Phylogenetic tree constructed fromalignment of nucleotide
sequences of the cp gene of 28 WMV isolates
95.3% 97.6%
8.1
8 6 4 2 0
Nucleotide Substitutions（×100）
1468· ·
图 3 江苏分离物与报道的其他WMV-CP氨基酸序列比对
Fig.3 Alignment of acid sequences of the cp coding regions WMV isolates from Jiangsu and other geographic areas
任春梅等：江苏省葫芦科作物西瓜花叶病毒的分子鉴定和序列分析 1469· ·
南 方 农 业 学 报
WMV与寄主在协同进化过程中出现了不同的分子变
异。本研究分析了江苏区域内的WMV分子变异特征，
显示其具有一定的地域分化，而与危害的寄主相关性
不明显，显示病源来自于当地的可能性。西瓜花叶病
毒具有蚜传的特定基序，在田间流行主要由蚜虫传
播，病源主要来自当地，在如此背景下病害的控制除
采用抗病品种外，应着重考虑切断蚜虫的传毒。因此，
生产上采取多种手段早期治理有翅蚜的传毒是病害
防控的首要措施。
4 结论
本研究利用RT-PCR方法鉴定江苏各地南瓜、瓠
瓜、西瓜和西葫芦上的11个WMV分离物，并对cp基因
进行克隆测序，序列测定结果表明所有分离物均包含
完整的cp基因序列。采用DNASTAR和Clustal X软件
对11个江苏WMV分离物与已报道的其他国家及我国
其他地区的17个WMV分离物一起进行序列同源性比
较和系统进化分析，结果表明cp基因核苷酸和推导的
编码CP蛋白氨基酸序列同源性分别为90.5%~100.0%
和92.9%~100.0%。WMV-cp基因核苷酸系统进化和氨
基酸比对分析均表明其遗传变异与地缘相关性较强
而与寄主相关性较弱。江苏分离物WMV-CP氨基酸均
具有蚜传株系的特征结构域DAG，暗示其田间流行与
蚜虫有关。
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