全 文 ：广 西 植 物 Guihaia　Nov．２０１４,３４(６):８４１－８４７　　　　　　　　　　 http://journal．gxzw．gxib．cn　
DOI:１０．３９６９/j．issn．１０００Ｇ３１４２．２０１４．０６．０１９
刘艳丽,梁坤南,黄桂华,等．柚木无性系愈伤组织诱导及植株再生[J]．广西植物,２０１４,３４(６):８４１－８４７
LiuYL,LiangKN,HuangGH,etal．Calusinductionandplantregenerationofteak(Tectonagrandis)clones[J]．Guihaia,２０１４,３４(６):８４１－８４７
柚木无性系愈伤组织诱导及植株再生
刘艳丽,梁坤南∗,黄桂华,曾炳山,周再知,马华明
(中国林业科学研究院 热带林业研究所,广州５１０５２０)
摘　要:以柚木优良无性系７１Ｇ１４组培苗节间茎段为材料,MS为基本培养基,采用正交设计对６ＧBA、IBA、
TDZ、NAA等４个生长调节剂各４水平进行愈伤组织诱导,并以最佳组合使用不同浓度的TDZ进行柚木愈
伤组织再生.结果表明:TDZ对形成具再生能力的致密型愈伤组织影响最大,低浓度水平的TDZ和６ＧBA更
易形成致密型愈伤组织;以愈伤组织大小、诱导率和致密型所占比例采用隶属函数法评定得出最优的愈伤组
织诱导培养基为 MS＋０．９mg􀅰LＧ１６ＧBA＋０．０４mg􀅰LＧ１IBA＋０．０２mg􀅰LＧ１TDZ＋０．８mg􀅰LＧ１NAA,愈伤组
织诱导率达８０．７８％、平均直径１．６５cm,获致密型愈伤组织８３．０％;得出优化的再生培养基为 MS＋０．１３２
mg􀅰LＧ１TDZ,分化率为３４．２２％;初步建立了以茎段为外植体的柚木优良无性系７１Ｇ１４的再生体系,为柚木转
基因技术的研究提供技术支撑.
关键词:柚木无性系;生长调节剂;愈伤组织诱导;植株再生
中图分类号:Q９４３．１;S７２２．３　　文献标识码:A　　文章编号:１０００Ｇ３１４２(２０１４)０６Ｇ０８４１Ｇ０７
Calusinductionandplantregenerationof
teak(Tectonagrandis)clones
LIUYanＧLi,LIANGKunＧNan∗,HUANGGuiＧHua,
ZENGBingＧShan,ZHOUZaiＧZhi,MAHuaＧMing
(ResearchInstituteofTropicalForestry,ChineseAcademyofForestry,Guangzhou５１０５２０,China)
Abstract:Toestablishateak(Tectonagrandis)regenerationsystemforfurtherteaktransformation,internodesegＧ
mentsforclone７１Ｇ１４wereselectedforcalusinductionanddiferentiation．Inthisstudy,６ＧBA、IBA、TDZ、NAAwere
usedtostudytheefectsofPlantGrowthRegulators(PGRs)andtheirratiosoncalusinductionbyanorthogonaldeＧ
signwithfourconcentrations,thentheoptimalcaluswereusedfordifferentiationwithdiferentconcentrationof
TDZ．TheresultsshowedthatTDZhadthegreatestinfluenceonthetypesofcalus,compactcalusweremucheasier
tobeformedinlowconcentrationsofTDZand６ＧBA．Meanwhile,usingmembershipfunctionwhichtheevaluationinＧ
dicatorswerecalussize,calusinductionrateandthecompactcalusrate,theoptimalcombinationofPGRsforcalus
inductionwas０．９mg􀅰LＧ１６ＧBA＋０．０４mg􀅰LＧ１IBA＋０．０２mg􀅰LＧ１TDZ＋０．８mg􀅰LＧ１NAA,with８０．７８％calus
percentage,１．６５cmaveragediameterand８３．０％compactcaluspercentage．Thehighestcalusdiferentiationrate
was３４．２２％ with０．１３２mg􀅰LＧ１TDZ．Throughthisstudy,aregenerationsystemforteakclone７１Ｇ１４wasinitialy
established．
Keywords:Tectonagrandisclone７１Ｇ１４;plantgrowthregulators;calusinduction;plantregeneration
收稿日期:２０１４Ｇ０３Ｇ３０　　修回日期:２０１４Ｇ０５Ｇ１６
基金项目:国家林业公益性行业科研专项重大项目(２０１１０４００１)
作者简介:刘艳丽(１９９０Ｇ),女,湖南益阳人,在读硕士研究生,主要从事柚木抗性育种,(EＧmail)yifanilv＠hotmail．com.
∗通讯作者:梁坤南,研究员,硕士生导师,主要从事林木遗传育种与栽培技术研究,(EＧmail)chinateak＠１６３．net.
　　柚木(Tectonagrandis)系马鞭草科(VerbenＧ
aceae)柚木属(Tectona)半落叶性高大乔木,原产于
缅甸、印度、泰国和老挝.柚木具有生长迅速、纹理
美观、耐腐抗虫和易于加工等优良特性,被誉为最重
要的热带珍贵用材树种之一(White,１９９１;马华明
等,２００３).柚木用途极广,适于制作高档家具、木地
板,也适于造船、桥梁以及露天建筑,是世界船舰、军
需海航及海港、雕刻、红木家具和贴面板的重要用材
(刘进平等,２００６).随着国际市场对柚木需求逐年
上升,加上来自天然林的柚木越来越紧缺,自８０年
代以来,柚木传统出口国如印度、泰国和印尼均已终
止柚木的原木出口,目前仅有缅甸仍出口柚木原木,
印尼只容许成品出口(马华明等,２００３),柚木在市场
上十分短缺.
我国无柚木天然林分布,现存柚木种质资源基
本由国外引进.且柚木幼林期不耐霜冻,国内适合
种植的有海南、云南及广东、广西和福建的南部极少
数地区(梁坤南等,２０１１).选育耐寒抗性柚木优良
品种,在偶有霜冻地区推广种植尤为重要,常规育种
的周期长、难度大、选择效率低(郑勇奇,２００１),转基
因技术的应用给柚木无性系耐寒品种创制提供了一
条选育途径.尽管２０世纪８０年代始,国内开展了
柚木组织培养研究(王宝生等,１９８０;曹月华等,
１９８１),经过多年研究,已形成了成熟的适合规模化
生产的组培快繁工艺技术(裘珍飞等,２００１).但目
前尚未建立合适的再生体系,这很大程度上限制了
通过基因工程改良柚木的进程.本文拟通过柚木无
性系愈伤组织的诱导与植株再生,建立柚木无性系
再生体系,为柚木无性系转基因技术提供支撑.
１　材料与方法
１．１材料
实验材料为中国林业科学研究院热带林业研究
所选育的印度优良无性系７１Ｇ１４,以该无性系无菌
组培瓶苗的、不带腋芽的节间茎段为外植体.
１．２方法与条件
１．２．１愈伤组织诱导　根据单因素试验确定４种植
物生长调节剂(６ＧBA、IBA、TDZ和 NAA),各设４
个浓度水平:６ＧBA(０．９、１．１、１．３、１．５mg􀅰LＧ１)、IBA
(０．０４、０．０８、０．１２、０．１６mg􀅰LＧ１)、TDZ(０．０２、０．０５、
０．０８、０．１１mg􀅰LＧ１)和NAA(０．８、０．９、１．０、１．１mg􀅰
LＧ１).用正交设计 L１６(４５),１６个处理(组合)(表
１),每处理３次重复,每重复６瓶.切取７１Ｇ１４无性
系无菌瓶苗长０．５~０．７cm的节间茎段为外植体,
每瓶接种５个外植体,每处理共接种外植体９０个.
表１　正交试验设计表L１６(４５)
Table１　Orthogonaldesignofexperiment
处理号
No．of
treatment
生长调节剂浓度水平
Growthregulatorconcentration
(mg􀅰LＧ１)
６ＧBA IBA TDZ NAA
接种外植体数
No．of
explant
inoculation
１ ０．９ ０．０４ ０．０２ ０．８ ９０
２ ０．９ ０．０８ ０．０５ ０．９ ９０
３ ０．９ ０．１２ ０．０８ １．０ ９０
４ ０．９ ０．１６ ０．１１ １．１ ９０
５ １．１ ０．０４ ０．０５ １．０ ９０
６ １．１ ０．０８ ０．０２ １．１ ９０
７ １．１ ０．１２ ０．１１ ０．８ ９０
８ １．１ ０．１６ ０．０８ ０．９ ９０
９ １．３ ０．０４ ０．０８ １．１ ９０
１０ １．３ ０．０８ ０．１１ １．０ ９０
１１ １．３ ０．１２ ０．０２ ０．９ ９０
１２ １．３ ０．１６ ０．０５ ０．８ ９０
１３ １．５ ０．０４ ０．１１ ０．９ ９０
１４ １．５ ０．０８ ０．０８ ０．８ ９０
１５ １．５ ０．１２ ０．０５ １．１ ９０
１６ １．５ ０．１６ ０．０２ １．０ ９０
　　以 MS为基本培养基,添加蔗糖３０g􀅰LＧ１,琼
脂７．０g􀅰LＧ１,pH 调至５．８.高温高压灭菌.接种
材料先在２５℃恒温箱中暗培养２８d,再转入到培养
室中进行光培养,光照时间为１２h,光强２０００lx,
温度为(２５±２)℃;３５d后观察外植体愈伤组织的
大小、颜色、质地状况,并统计愈伤组织诱导率和褐
化率.
１．２．２植株再生　取节间茎段接种在MS＋０．９mg􀅰
LＧ１６ＧBA＋０．０４mg􀅰LＧ１IBA＋０．０２mg􀅰LＧ１TDZ＋
０．８mg􀅰LＧ１NAA的培养基中诱导愈伤组织,光培
养３０d,切取茎段基部长出的愈伤组织接入 MS＋
TDZ(０．０２２~０．２２mg􀅰LＧ１共１０个浓度梯度)的培
养基中,继代３次,转接周期为２０d,观察愈伤组织
生长和愈伤表面发生的变化.
１．３数据处理与统计分析
愈伤组织诱导率(％)＝诱导出愈伤组织的外植
体数/接种外植体总数×１００％;分化率(％)＝已分
化的愈伤组织数/接种的愈伤组织总数×１００％;褐
化率(％)＝褐化愈伤组织的外植体数/接种外植体
总数×１００％;植株再生系数＝再生芽数/形成再生
芽的愈伤组织数.
所用数据采用GENSTAT和SPSS１８．０软件进
２４８ 广　西　植　物　　　 　　　　　　　　　　　　　　３４卷
行方差分析和邓肯多重比较.应用隶属函数法计
算,以每个处理多项指标隶属值的平均来评判处理
对愈伤组织的诱导能力,平均值越大诱导能力越强.
计算公式:M(Xij)＝(Xij－Xjmin)/(Xjmax－
Xjmin)
式中,M(Xij)为第i处理j指标的隶属函数
值,Xij为第i个处理j指标的测定值,Xjmin和Xjmax
分别为j指标的最小和最大测定值.
２　结果与分析
２．１不同生长调节剂处理与浓度水平对愈伤组织诱
导率、大小和褐化率的影响
对１６个处理愈伤组织诱导率进行方差分析,结
果表明(表２):愈伤组织平均诱导率为７５．９％,处理
间差异极显著,其中处理３和处理１２诱导率分别达
到９８．１６％和８４．２３％,前者与另外的１４个处理差异
显著.不同处理对愈伤组织大小影响差异也极显
著,其中处理４最大,平均直径为１．７８cm,处理７其
次,为１．７４cm,处理２平均直径最低.从实验设计
看,处理４是６ＧBA浓度水平最低、其他３种生长调
节剂浓度水平最高的一个组合,尽管处理４的愈伤
组织平均直径最大,但诱导率仅为８０．５１％,与诱导
率最高的处理３差异显著.处理３的诱导率最高,
但愈伤组织平均直径仅０．９７cm,与平均直径最大
的处理４差异极显著,在１６个处理中排序倒数第
二.处理３愈伤组织诱导率虽高,但平均直径小,不
利于下一步的愈伤组织继代.褐化率低有利于愈伤
组织继代增殖,１６个处理愈伤组织褐化率从０到
１０．７１％,差异不显著.
不同生长调节剂浓度水平对愈伤组织的诱导率
和平均直径影响表现不同(表３).６ＧBA和IBA的
不同浓度水平间愈伤组织诱导率差异显著,其中６Ｇ
BA影响愈伤组织诱导率规律性明显,随着浓度增
加,愈伤组织诱导率降低,即低浓度的６ＧBA更易于
诱导愈伤组织;而IBA规律性不明显;TDZ和NAA
的不同浓度水平间愈伤组织诱导率差异不显著.
TDZ和NAA水平间平均直径差异分别达极显著和
显著;而６ＧBA和IBA水平间差异不显著.４种生
长调节剂浓度水平间的褐化率差异均不显著.根据
方差分析的显著性和极差大小可知,６ＧBA和IBA
是影响愈伤组织诱导率的主要因素.影响愈伤组织
诱导率、平均直径及褐化率大小的排序分别为６ＧBA
＞IBA＞NAA＞TDZ、TDZ＞NAA＞６ＧBA＞IBA、
NAA＞TDZ＞IBA＞６ＧBA.
表２　不同生长调节剂处理对愈伤
诱导的影响与邓肯多重比较
Table２　Effectsofdifferentcombinationsforthefour
plantgrowthhormonesoncalusinductionand
theDuncan＇smultiplecomparison(０．０５,０．０１)
处理号
No．of
treatment
愈伤组织
诱导率
Calus
induction
percentage
(％)
处理号
No．of
treatment
平均直径
Average
diameter
(cm)
处理号
No．of
treatment
褐化率
Browning
percentage
(％)
３ ９８．１６aA ４ １．７８aA １４ ０．００
１２ ８４．２３abAB ７ １．７４aA ５ ０．００
６ ８１．４７bcAB １ １．６５abAB ８ ０．００
１１ ８１．０６bcAB １１ １．６０abABC ３ ０．００
８ ８１．０６bcAB １０ １．４３abcABCD ４ ０．２１
１ ８０．７８bcAB １４ １．３７abcdABCD １０ ０．４４
４ ８０．５１bcAB ５ １．２７bcdABCD １６ ０．５１
７ ７８．８２bcAB ６ １．２６bcdABCD ９ ０．６２
５ ７７．８１bcAB ９ １．２１bcdABCD ６ １．２８
１６ ７５．６０bcAB ８ １．１２cdBCD ２ １．３６
１０ ７３．６３bcAB １５ １．１２cdBCD １１ ２．４５
１３ ７０．０２bcB １６ １．０４cdCD １３ ３．９１
２ ６５．１２bcB １３ １．０２cdCD ７ ６．７０
１５ ６２．４３bcB １２ １．０１cdCD １ ６．７０
１４ ５２．９７cB ３ ０．９７cdD １５ ８．０７
９ ５２．２７cB ２ ０．９２cdD １２ １０．７１
F值
Fvalue
２．２５∗∗ ４．１９∗∗ １．２２ns
Fpr显著性
Fsignificance
０．００７ ＜０．００１ ０．２６４
平均 Mean ７５．９ １．２８ １．５３
　注:ns、∗、∗∗分别表示方差分析的F值差异不显著、显著和极显著.小写
或大写字母相同,表示两两间差异不显著或极不显著;反之,则表示差异显著
或极显著.下同.
　Note:ns,∗,∗∗ meanthedifferencesofFvalueinANOVAarenotsignifiＧ
cant,significantandverysignificant,separately．Thelowercaseoruppercase
lettersafterthefiguresbetweentwotreatmentarethesamemeanthedifferＧ
encewasnotsignificantornotverysignificant;Contrary,meanthedifference
wassignificantorverysignificant．Thesamebelow．
２．２不同生长调节剂处理与浓度水平对愈伤组织质
地的影响
不同处理对７１Ｇ１４诱导发现,愈伤组织以致密型
居多,占４５．８％,而疏松致密型和疏松型分别为
２３．６％和３０．６％.１６个处理间三种类型愈伤组织差
异均达极显著(表４).其中处理１、２、３、５、６、９、１１、１５
形成的愈伤组织以致密型为主,占５２．１％~８５．０％.
处理１０、１４、１６形成的愈伤组织以表面疏松,内部致
密为主,占５０．８％~５５．０％;处理４、８形成的愈伤组织
以疏松型为主,分别占８０．８％和５６．７％,其他３个处
理的三种类型愈伤组织所占比例相差不大.
不同生长调节剂浓度水平对形成愈伤组织的质
３４８６期　　　　　　　　　　刘艳丽等:柚木无性系愈伤组织诱导及植株再生
表３　６ＧBA、IBA、TDZ、NAA不同浓度水平对７１Ｇ１４
愈伤组织诱导的影响与邓肯多重比较
Table３　Effectsofdifferentlevelsfor６ＧBA,IBA,TDZ,
NAAoncalusinductionofclone７１Ｇ１４andthe
Duncan＇smultiplecomparison(０．０５,０．０１)
生长调节剂
Growth
regulator
水平
Level
愈伤组织
诱导率
Calusrate
(％)
平均直径
Average
diameter
(cm)
褐化率
Browning
rate
(％)
６ＧBA ０．９ ８３．６a １．３２９ １．１
１．１ ７９．０a １．３８３ ０．７
１．３ ７３．８ab １．３０６ ２．４
１．５ ６５．５b １．１３６ １．９
F值Fvalue ３．１６∗ ２．１４ns ０．４２ns
Fpr显著性
Fsignificance
０．０２７ ０．０９８ ０．７４
IBA ０．０４ ７０．８ab １．２９０ １．７
０．０８ ６７．９b １．２７２ ０．４
０．１２ ８２．７a １．３６２ ３．１
０．１６ ８０．５ab １．２３ １．２
F值Fvalue ２．７９∗ ０．５７ns ０．８２ns
Fpr显著性
Fsignificance
０．０４３ ０．６３６ ０．４８５
TDZ ０．０２ ７８．７ １．４１１aA ２．１
０．０５ ７３．２ １．０８６bB ３．３
０．０８ ７４．７ １．１７０bB ０．０
０．１１ ７６．３ １．４８８aA ２．０
F值Fvalue ０．２９ns ６．８６∗∗ ２．０４ns
Fpr显著性
Fsignificance
０．８３２ ＜０．００１ ０．１１１
NAA ０．８ ７５．３ １．４４４a ４．５
０．９ ７５．０ １．１５９c １．４
１．０ ８３．２ １．１８４bc ０．１
１．１ ６８．７ １．３６８ab １．６
F值Fvalue １．９２ns ３．６４∗ ２．１７ns
Fpr显著性
Fsignificance
０．１２９ ０．０１４ ０．０９５
平均 Mean ７５．９ １．２９ １．５
地影响不一(表５,图１),６ＧBA、IBA和TDZ不同水
平间形成致密型愈伤组织差异极显著,其中TDZ对
致密型愈伤影响较大,水平间的极差为３８．５２％,其
次为IBA(３０．７２％)、６ＧBA(２７．０９％),低浓度水平的
６ＧBA和TDZ更易形成致密型的愈伤组织.６ＧBA
对疏松致密型的愈伤组织影响最大,水平间差异极
显著,极差为３８．６７％,随着浓度的增加,疏松致密型
的愈伤组织所占比例增大;其他生长调节剂对疏松
致密型愈伤组织的形成水平间差异不大.TDZ和
IBA则对疏松型的愈伤组织影响较大,水平间差异
达极显著,其中TDZ水平间极差为３５．８１％,随着浓
度水平的增加,疏松型愈伤组织比例增大,IBA水平
间的极差则为２８．９％.
根据方差分析的显著性和极差大小,４种生长
调节剂对致密型和疏松型愈伤组织影响大小的顺序
表４　不同处理对形成愈伤组织质地的影响与邓肯多重比较
Table４　Effectsofdifferentcombinationsfor６ＧBA,IBA,
TDZ,NAAoncalustypesofclone７１Ｇ１４andthe
Duncan＇smultiplecomparison(０．０５,０．０１)
处理号
No．of
treatment
致密型
Compact
type
(％)
处理号
No．of
treatment
疏松致密型
Friableand
compact
type(％)
处理号
No．of
treatment
疏松型
Friable
type
(％)
２ ８５．０aA １６ ５５．０aA ４ ８０．８aA
１ ８３．０aA １４ ５１．７aA ８ ５６．７abAB
３ ７６．０aA １０ ５０．８aA ７ ３９．６bcBC
１５ ７１．５abAB ７ ３９．５abAB ５ ３９．６bcBC
１１ ５５．７abcABC １３ ３８．３abcABC １０ ３６．７bcBC
９ ５５．６abcABC １２ ３６．７abcdABC １２ ３６．３bcBC
６ ５２．７abcdABC ６ ３４．６abcdABC １３ ３５．０bcBC
５ ５２．１abcdABC １１ ３１．３abcdeABC ９ ２９．２bcBC
８ ３８．３bcdeBC ９ １５．２bcdeABC ３ ２４．０bcBC
１６ ３０．７cdeBC ５ ８．３bcdeBC １４ ２３．３bcBC
１２ ２７．０cdeC １５ ８．３bcdeBC １５ ２０．２cBC
１３ ２６．７cdeC ８ ５．０cdeBC １ １７．０cBC
１４ ２５．０cdeC ２ ３．１deBC １６ １４．３cBC
７ ２０．９cdeC １ ０．０eC １１ １３．０cC
４ １９．２deC ３ ０．０eC ６ １２．７cC
１０ １２．５eC ４ ０．０eC ２ １１．９cC
F值
Fvalue
４．８１∗∗ ３．８７∗∗ ２．７２∗∗
Fpr显著性
Fsignificance
＜０．００１ ＜０．００１ ０．００１
平均mean ４５．８ ２３．６ ３０．６
图１　不同激素对愈伤组织质地影响的极差
Fig．１　Rangeofefectsofdiferentregulatorsoncalustypes
均为TDZ＞IBA＞６ＧBA＞NAA;而对疏松致密型愈
伤组织影响大小的顺序为６ＧBA＞IBA＞NAA＞
TDZ.节间茎段在诱导培养基上培养１４d左右即
从切口处长出少量不规则淡黄色愈伤组织(图２:
A),６０d左右愈伤可达０．５~１．５cm３(图２:B).致
密型愈伤其结构紧致,且呈黄绿色,部分愈伤组织表
面有芽冒出(图２:B),继代生长慢;而疏松型愈伤组
织呈淡黄色(图２:C),其在继代培养中生长速度极
快,但只增大体积,外植体呈黄色,愈伤组织上无绿
４４８ 广　西　植　物　　　 　　　　　　　　　　　　　　３４卷
图２　柚木愈伤组织诱导及植株再生　A,B,C．茎段愈伤组织诱导;D,E．愈伤组织分化.
Fig．２　CalusinductionandshootregenerationofTeak　A,B,C．Calusinducedfromstem;D,E．diferentiationofthecalus．
表５　６ＧBA、IBA、TDZ、NAA对７１Ｇ１４愈伤
组织质地影响与邓肯多重比较
Table５　Effectsofdifferentlevelsfor６ＧBA,IBA,TDZ,
NAAoncalustypesofclone７１Ｇ１４andthe
Duncan’smultiplecomparison(０．０５,０．０１)
生长调节剂
Growthregulator
水平
Level
致密型
Compact
type
(％)
疏松致密型
FriableＧ
looking
andcompact
type(％)
疏松型
FriableＧ
looking
type
(％)
６ＧBA ０．９ ６５．３６aA ０．０２bB ３４．６２
１．１ ４２．０５bB ２０．３１aA ３７．６６
１．３ ３８．８４bB ３３．１２aA ２８．０６
１．５ ３８．２７bB ３８．６９aA ２３．０３
F值Fvalue ５．０１∗∗ １１．１６∗∗ １．３９ns
Fpr显著性
Fsignificance
０．００２ ＜０．００１ ０．２４８
IBA ０．０４ ５４．３１aA １５．５５ ３０．１４bB
０．０８ ４６．１３aA ３４．０４ １９．８６bB
０．１２ ５７．４０aA １７．９９ ２４．６１bB
０．１６ ２６．６８bB ２４．５６ ４８．７６aA
F值Fvalue ５．７２∗∗ ２．５９ns ５．１６∗∗
Fpr显著性
Fsignificance
０．００１ ０．０５５ ０．００２
TDZ ０．０２ ５８．０１aA ２８．９６ １３．０４cC
０．０５ ５９．５５aA １３．４４ ２７．０１bcBC
０．０８ ４５．９３aA １９．６０ ３４．４６abAB
０．１１ ２１．０３bB ３０．１４ ４８．８５aA
F值Fvalue ９．５１∗∗ ２．３９ms ７．１８∗∗
Fpr显著性
Fsignificance
＜０．００１ ０．０７１ ＜０．００１
NAA ０．８ ４０．２６ ３０．６５ ２９．１０
０．９ ４９．９１ ２０．４１ ２９．６８
１．０ ４２．９９ ２８．１８ ２８．８４
１．１ ５１．３８ １２．９０ ３５．７５
F值Fvalue
Fpr显著性
Fsignificance
０．８６ns
０．４６３
２．４５ns
０．０６６
０．３５ns
０．７９
平均 Mean ４５．８ ２３．６ ３０．６
色芽点,多次继代易褐化;前者和后者分别被称为具
再生能力和不具再生能力的愈伤组织.根据愈伤组
织类型继代生长情况,以愈伤组织诱导率、愈伤组织
平均直径和致密型所占比例采用隶属函数法评定各
处理的诱导能力,得出处理１(MS＋０．９mg􀅰LＧ１６Ｇ
BA＋０．０４mg􀅰LＧ１IBA＋０．０２mg􀅰LＧ１TDZ＋０．８
mg􀅰LＧ１NAA)的平均隶属值最大,为０．８１,随后依
次是处理１１、处理３和处理４,分别为０．６７、０．６５、
０．５７.处理１是综合３项指标最适宜的生长调节剂
组合,其愈伤组织诱导率、愈伤组织平均直径和致密
型所占比例分别为８０．７８％,１．６４８cm和８３．０％.
２．３愈伤组织再生植株
选择黄绿色致密愈伤组织接入１０个TDZ浓度
的分化培养基上进行再生诱导,约３０d可见绿色芽
点逐渐分化成再生植株,及时去掉无芽点的愈伤组织
块,并继代２次后,芽点再生苗增多,茎干粗壮,颜色
嫩绿,叶片开始舒展(图２:D),部分再生苗苗高为３~
５cm(图２:E).再分化培养５０d时,部分再生植株高
而且健壮.通过不同浓度TDZ对愈伤组织再生率的
方差分析表明,TDZ对于不同愈伤组织的不定芽分
化和植株再生系数均有显著影响.当TDZ浓度为
０．０６６~０．１３２mg􀅰LＧ１时,不定芽分化效果相对较好
(表６),分化率为２６．４２％~３６．５４％,且分化出的不定
芽大部分能正常生长,其中TDZ浓度为０．１３２mg􀅰
LＧ１时,愈伤状态和再生苗长势表现最好.
３　讨论与结论
热带林木树种植物组织培养常采用６ＧBA、NAA、
５４８６期　　　　　　　　　　刘艳丽等:柚木无性系愈伤组织诱导及植株再生
表６　不同TDZ浓度的愈伤组织再分化率和再生系数
Table６　Calusdifferentiationrateandregeneration
coefficientofteakatdifferentlevelsofTDZ
TDZ浓度
TDZ
concentration
(mg􀅰LＧ１)
愈伤分化率
Calus
differentiaＧ
tionrate
(％)
再生系数
Regeneration
coefficient
愈伤生
长状态
Growth
vigourof
calus
再生植株
生长状态
Growth
vigour
ofplantlet
０．０２２ ２６．９３abcd １．２８bcd ＋＋ ＋＋
０．０４４ ２１．９３bcd １．０８bcd ＋＋ ＋＋
０．０６６ ３６．５４a １．５４bcd ＋＋＋ ＋＋
０．０８８ ２６．４２abcd １．２９bcd ＋＋＋ ＋＋
０．１１０ ３２．９０ab １．６７abc ＋＋ ＋＋＋
０．１３２ ３４．２２a ２．２３a ＋＋＋ ＋＋＋
０．１５４ ３０．５０abc １．７６ab ＋＋ ＋＋＋
０．１７６ １９．４３cd ０．９５d ＋＋ ＋
０．１９８ １６．６６d １．０８bcd ＋ ＋＋
０．２２０ １５．３９d １．００cd ＋ ＋＋
　注:小写字母表示LSD多重分析结果(P＜０．０５).“＋”代表愈伤组织和再
生植株的长势,“＋”越多,长势越好.
　Note:Lowercasesrepresentsignificantdifferencesat０．０５levelwithLSD
multipleanalysis(P＜０．０５)．“＋”representsthegrowthvigourofcalusand
plantlets,themore“＋”,thebettergrowth．
IBA进行愈伤组织诱导和植株再生,如桉树(卜朝
阳,２００４)、相思(姬明,２００６)、土沉香(汪腾跃等,
２０１２)等,早期国外如 Noerhadetal．(１９８０),RosiＧ
lahetal．(２００５)、Kushalkaretal．(１９９６)柚木的组
织培养研究也多采用６ＧBA、NAA、IBA.近２０~３０
a一种新型植物生长调节剂TDZ逐渐被应用于组
织培养中(裘珍飞等,２００９).对柚木愈伤组织的诱
导,单一生长调节剂可能不起作用,国内郭彦彤等
(２０１２)用０．５~２．０mg􀅰LＧ１NAA诱导同一７１Ｇ１４
无性系,结果无法获得愈伤组织,而与６ＧBA共同作
用,则诱导率达４０．０％~８６．７％,６ＧBA和 NAA各
水平差异极显著,它们间的交互作用也达极显著.
基于这一点,本研究采用６ＧBA、NAA、IBA、TDZ设
计４因素４水平的正交实验,结果显示,各个处理
(组合)对７１Ｇ１４愈伤组织的诱导率为５２．２７％~
９８．１６％.对愈伤组织的诱导率影响最大的激素为
６ＧBA,且低浓度６ＧBA的诱导率显著高于高浓度的
６ＧBA,与郭彦彤结果较吻合;Bagheletal．(２００８)和
Widiyantoetal．(２００５)认为最具有再生能力的愈伤
组织是浅黄色或浅绿色的致密型愈伤组织,且从该
类型的愈伤组织获得柚木再生植株.本研究得出最
适宜诱导７１Ｇ１４无性系愈伤组织的为处理１(MS＋
０．９mg􀅰LＧ１６ＧBA＋０．０４mg􀅰LＧ１IBA＋０．０２mg􀅰
LＧ１TDZ＋０．８mg􀅰LＧ１NAA),可获得较高的诱导
率、较大及易于分化的愈伤组织.
TDZ对７１Ｇ１４无性系愈伤大小和致密型质地
影响最大,难于再生的植物应用TDZ可获得体细胞
胚及再生植株.如 Widiyantoetal．(２００５)用TDZ
和IBA诱导柚木愈伤组织;Akrametal．(２００８)用
TDZ诱导丛生芽可使诱导率达１００％.本研究采用
１０个浓度梯度的TDZ进行愈伤组织植株再生研究
发现,TDZ能诱导愈伤组织的不定芽分化,分化率
为１５．３９％~３６．５４％,再生系数为０．９５~２．２３,处理
间的差异达显著.尽管这两个指标不高,但能从愈
伤组织获得再生植株,并初步选出分化率和再生系
数较佳的浓度,即 MS＋０．１３２mg􀅰LＧ１TDZ,其愈伤
生长状态和再生植株苗的长势最好.
在愈伤诱导过程中,基因型不同是影响实验结
果的一个重要因素.即使是来自同一种源不同个
体,因基因型不同,对同一生长调节剂的敏感性不
同.郭彦彤等(２０１２)发现柚木同一种源的两个无性
系７１Ｇ５和７１Ｇ１４诱导愈伤组织要求的浓度范围不
一致.至于不同来源的外植体所建立的再生体系之
间可能更难完全具备可重复性.本研究曾参考
Akrametal．(２００９)和郭彦彤等(２０１２)获得的培养
基配方进行试验,但效果不理想,形成的愈伤组织量
少,水泽化,并在持续培养中愈伤极易褐化死亡.
柚木愈伤组织诱导及分化是再生体系建立和基
因工程的前提.本研究通过激素和培养基的优化,
建立柚木无性系７１Ｇ１４愈伤组织再生体系,初步解
决了胚性愈伤组织诱导率低,几乎无进一步分化等
难题,为后期建立高效再生体系提供技术支持,也为
建立柚木遗传转化体系奠定了基础.但植株再生分
化率仍较低,最高仅３６．５４％,达不到直接进行转基
因的条件.这是由于木本植物再生率低、难度大,无
性系植株再生难度更大,其外植体与其他胚性外植
体(Akrametal．,２００８,２００９)不同,建立起来的高
效再生体系能直接运用于转基因研究中.因此,目
前仍有许多工作需进一步研究和完善,如进一步提
高愈伤分化、植株再生率和试验瓶苗的移栽等.
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