全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2011, 37(11): 21062110 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家高技术发展计划(863计划)重点项目(2006AA10A104)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 张增艳, E-mail: zhangzy@mail.caas.net.cn, Tel: 010-82108781
Received(收稿日期): 2011-02-18; Accepted(接受日期): 2011-06-25; Published online(网络出版日期): 2011-09-06.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20110906.1106.024.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2011.02106
利用 BSMV-VIGS技术快速分析小麦 TNBL1基因的
抗黄矮病功能
赵 丹 1,2 赵继荣 1 黄 茜 1,2 李 宁 1 刘 艳 3 黄占景 1,2 张增艳 1,*
1 中国农业科学院作物科学研究所 / 农作物基因资源与基因改良国家重大科学工程 / 农业部作物遗传育种重点开放实验室, 北京
100081; 2河北师范大学生命科学院, 河北石家庄 050016; 3 中国农业科学院植物保护研究所, 北京 100093
摘 要: 小麦黄矮病是由蚜虫介导的大麦黄矮病毒(Barley yellow dwarf virus, BYDV)侵染引起的小麦重要病害之一。
利用 cDNA-AFLP 分析, 筛选出在抗黄矮病小麦易位系 YW642 中特异表达的长度为 292 bp 的 cDNA 片段, 以此片
段为启始序列, 利用RACE和RT-PCR技术克隆出该基因的全长 cDNA序列, 推导该基因编码 1个NBS-LRR蛋白, 将
其命名为 TNBL1。本研究利用大麦条纹花叶病毒(BSMV)诱导的基因沉默(virus-inducing gene silencing, VIGS)技术,
快速分析 TNBL1是否参与小麦抗黄矮病反应。通过 PCR添加酶切位点、定向酶切与连接, 将 TNBL1特异的 292 bp
片段反向整合到 BSMV-γ链的多克隆位点上, 获得重组载体 BSMV-γ:TNBL1as, 体外转录 BSMV-VIGS载体的 3个组
分(BSMV-TNBL1as、BSMV-α 和 BSMV-β), 等量混合、摩擦接种到抗黄矮病的小麦易位系 YW642 幼苗叶片上, 使
YW642中 TNBL1基因沉默, 然后接种 BYDV病原进行黄矮病抗性鉴定。结果表明, TNBL1基因沉默后的 YW642对
BYDV 敏感、显现感病症状, 其体内 BYDV 含量较未发生基因沉默的 YW642 中的明显增加, 证明 TNBL1 基因是正
向调控小麦抗 BYDV反应的 1个重要基因。
关键词: 小麦; 中间偃麦草; 黄矮病; 病毒诱导的基因沉默; NBS-LRR
Functional Analysis of TNBL1 Gene in Wheat Defense Response to Barley ye-
llow dwarf virus Using BSMV-VIGS Technique
ZHAO Dan1,2, ZHAO Ji-Rong1, HUANG Xi1,2, LI Ning1, LIU Yan3, HUANG Zhan-Jing2, and ZHANG Zeng-Yan1,*
1 National Key Facility for Crop Gene Resources and Genetic Improvement, Institute of Crop Sciences / Key Laboratory of Crop Genetic and Breed-
ing, Ministry of Agriculture, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China; 2 College of Life Science, Hebei Normal University,
Shijiazhuang 050016, China; 3 Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Biejing 10093, China
Abstract: Barley yellow dwarf virus (BYDV), transmitted by at least 25 species of aphids, causes one of the most serious virus
diseases of wheat worldwide. Through cDNA-AFLP analysis, we identified a cDNA fragment with 292bp expressing in the
BYDV-resistant wheat-Thinopyrun intermedium translocation line YW642, but not in susceptible wheat Zhong8601. The
full-length cDNA sequence of the gene, namely TNBL1, was cloned by RACE and RT-PCR methods, which encodes a putative
NBS-LRR protein. This study focused on the functional analysis of TNBL1 in wheat defense to BYDV infection using Barley
stripe mosaic virus (BSMV)-based virus-inducing gene silencing method. After the specific fragment of TNBL1 was added with 2
restriction-enzyme sequences by PCR, and digested and ligased with the digested BSMV-γ, the recombinant BSMV-γ:TNBL1as
construct was obtained. The three components of the BSMV-VIGS vectors, BSMV-TNBL1as, BSMV-α and BSMV-β were tran-
scribed in vitro, and mixed with equal quantity and inoculated onto the first and second leaves of the resistant line YW642 seed-
lings at the two-leaf stage. As a result, the TNBL1 expression was obviously repressed (silenced) in YW642 treated by
BSMV:TNBL1. These seedlings were further inoculated with BYDV aphids. The BYDV content was much higher in the
TNBL1-silenced YW642 plants than that in the control YW642 plants without BSMV:TNBL1 treatment. Furthermore, the
TNBL1-silenced YW642 plants were susceptible to BYDV infection with the viral symptom. These results indicated that the
TNBL1 gene is an important gene positively involved in wheat defense response to BYDV infection.
Keywords: Wheat; Barley yellow dwarf virus; Thinopyrum intermedium; Virus-induced gene silencing; NBS-LRR
第 11期 赵 丹等: 利用 BSMV-VIGS技术快速分析小麦 TNBL1基因的抗黄矮病功能 2107


由大麦黄矮病毒(Barley yellow dwarf virus, BYDV)
引起的小麦黄矮病是影响世界小麦稳产、高产的重要病害
之一。该病害由蚜虫介导传播, 可引起小麦叶片黄化、植
株矮化甚至枯死, 从而造成小麦产量的严重损失。目前,
在小麦属内尚未发现有效的抗黄矮病基因 , 但已从中间
偃麦草中鉴定出高抗 BYDV 多个株系的种质[1], 并通过
远缘杂交、染色体工程, 将携带抗黄矮病基因 Bdv2 的中
间偃麦草染色体 7Ai#1L 长臂片段引渗到小麦中, 育成一
批抗黄矮病的小麦-中间偃麦草易位系, 如 YW642等[2]。
分离抗黄矮病反应中的重要基因 , 对于深入研究抗黄矮
病作用机制、进而开展抗黄矮病小麦基因工程育种具有重
要的意义。
已克隆的植物抗病基因编码的蛋白产物可分为 5 类,
分别是 NBS-LRR 型(nucleotide-binding site plus leucine-
rich repeat)、丝氨酸-苏氨酸蛋白质激酶(STK)型、细胞外
受体(e LRR-TM)型、类受体蛋白质激酶(e LRR-TM-STK)
型和毒素还原酶型[3], 其中最大的一类是 NBS-LRR。迄今
为止, 所有已克隆的植物病毒基因都属于这一类。NBS区
主要由激酶 1a、激酶 2 和激酶 3a 组成, 这 3 个单元共同
组成 R 蛋白 NBS 的 ATP/GTP 的结合位点[4-5], 而核苷三
磷酸是 R 蛋白发挥功能所必需的。LRR 结构域具有蛋白
与蛋白结合、多肽与配体或蛋白与碳水化合物互作的功
能[6-7]。在 NBS-LRR类抗病基因中, 其 N端结构域也有所
不同, 包括类似的卷曲螺旋结构域(CC)、亮氨酸拉链结构
域(LZ)和 TIR结构域。对越来越多的已克隆的抗病基因序
列研究表明, 这些抗性基因可能通过复制和随后的突变、
重组从一些原始的基因家族中进化而来。抗病(R)基因的
另一个特征是总以一个同源基因簇的一部分出现 , 其相
关的同源序列功能至今仍然不太清楚。因此, 要进一步了
解克隆的抗病基因同源序列或侯选基因序列是否真正参
与寄主对病原防御反应, 还需要进行相应的功能研究。已
有一些抗病毒基因, 如番茄的 Sw-5和烟草的N基因, 通过
转基因功能互补验证这些基因赋予寄主抗性[8-9]。
我们利用 cDNA-AFLP技术, 从 256对引物组合中筛
选出在抗黄矮病的小麦-中间偃麦草易位系 YW642 中特
异表达的侯选基因 TNBL1 片段(292 bp), 在 TNBL1 基因
cDNA片段(292 bp)的基础上, 经过 1次 3′ RACE和 5次 5′
RACE反应、克隆、测序分析、拼接与克隆, 获得 TNBL1
的全长 cDNA序列, TNBL1基因编码 NBS-LRR蛋白(未发
表, 此基因为一个新基因)。本研究拟利用病毒诱导的基
因沉默(virus-induced gene silencing, VIGS)技术快速分析
该基因是否是小麦抗黄矮病重要基因。
VIGS 是基于转录后基因沉默 (post-transcriptional
gene silencing, PTGS)引起内源 mRNA序列特异性降解的
原理,发展起来的快速分析基因功能的新技术[10-13]。VIGS
技术通过携带一段靶基因表达序列的VIGS重组病毒侵染
植物、引起植物内同源基因沉默与表型变异,进而实行基
因的功能分析[13]。与传统的基因功能分析方法相比, VIGS
具有实验周期短、操作简单, 在植物当代就可以对目标基
因进行沉默和功能分析; 而且不需要遗传转化, 可在不同
的遗传背景下生效以及在不同的物种间进行基因功能的
快速分析等优点, 是一种简单、快速、有效、高通量的分
析基因功能的方法[12-13]。VIGS被广泛应用于双子叶植物
中进行基因功能分析 [12-14], 但用于单子叶植物基因功能
研究的报道较少。目前已证明大麦条纹花叶病毒(Barley
stripe mosaic virus, BSMV)作为 VIGS载体, 可以在单子
叶植物大麦、小麦上进行了一些基因功能的快速分析[15-17]。
近来还发现雀麦草花叶病毒(Brome mosaic virus)可作为
玉米等单子叶植物的 VIGS载体[18-19]。
本研究利用 BSMV 作为 VIGS 载体, 将 TNBL1 在
YW642 中特异表达的一段 cDNA 片段插入 BSMV-γ 载体
的多克隆位点上, 体外转录 BSMV-VIGS载体的 3个组分,
转染抗黄矮病的小麦 YW642幼苗的叶片, 实施 BSMV诱
导的 TNBL1 基因沉默, 随后接种 BYDV、进行抗黄矮病
鉴定, 以快速分析小麦 TNBL1基因的抗病功能。
1 材料与方法
1.1 材料
抗黄矮病小麦-中间偃麦草易位系 YW642是源于 L1
的易位系, 由本课题组选育、鉴定和保存[20], 感黄矮病的
小麦亲本中 8601由本课题组保存。
BSMV 病毒载体的 3 个组分 BSMV-α、BSMV-β 和
BSMV-γ 质粒 [16], 由美国 Large Scale Biology 公司的
Pogue Gregory博士惠赠。携带 BYDV GAV株系的蚜虫由
中国农业科学院植物保护研究所刘艳、王锡锋博士提供。
限制性内切酶购自 TaKaRa 公司 , 体外转录试剂盒为
Amplicap-Max T7 High Yield Message Maker in vitro tran-
scription kit (Epicentre, USA)。
1.2 TNBL1 基因片段的克隆与 BSMV-:TNBL1 载体的
构建
根据 TNBL1基因在YW642中特异表达的一段 cDNA
序列设计引物: TNBL1-VI1F: 5′-GCTTAATTAAGATGTG
AACGAGG CGGGAGC-3′, 带下画线的序列为 Pac I酶切
位点 ; TNBL1-VI1R: 5′-TAGCGGCCGAGCATTGGAACA
CGGGAAC-3′, 带下画线的序列为 Not I 酶切位点 , 以
YW642中特异表达的一段 cDNA序列(292 bp)为模板进行
PCR扩增, 以在该片段两端分别加入 Pac I和Not I的酶切
序列, 从 DNA 凝胶中回收、纯化该 PCR 产物, 连接到
pMD18-T Vector (TaKaRa)上, 转化到大肠杆菌感受态细
胞, 克隆小麦 TNBL1基因的特异片段。
用 Not I、Pac I双酶切上述载体和 BSMV-γ载体, 回
收双酶切的 BSMV-γ载体片段和 TNBL1基因片段, 用 T4
连接酶进行连接, 将 TNBL1 的基因片段整合 BSMV-γ 载
体多克隆位点。将连接产物转化到大肠杆菌 DH5α感受态
中, 菌液 PCR 筛选阳性克隆并测序验证, 获得序列正确
的载体质粒即为重组载体 BSMV-γ:TNBL1as。
1.3 BSMV-载体的线性化
BSMV-α、BSMV-β和 BSMV-γ: TNBL1a质粒分别用
2108 作 物 学 报 第 37卷

Mlu I、Spe I和 BssH II进行酶切线性化。
1.4 体外转录与转染
参照试剂盒说明书进行体外转录, 参照我们在小麦
上建立的基于 BSMV 介导的基因沉默体系 [16], 将
BSMV-α、BSMV-β和BSMV-γ:TNBL1a等量混合, 接种(转
染)BSMV:TNBL1于 YW642幼苗(二叶一心期)的第 2和第
1叶片上。
1.5 小麦 TNBL1 基因沉默的半定量 RT-PCR 和
qRT-PCR分析
利用 Trizol Reagent总 RNA提取试剂(北京道普生物
科技有限公司)提取小麦叶片 RNA, 反转录成单链 cDNA
作为 RT-PCR分析的模板。以 Actin (ActinA: 5′-CACTGGA
ATGGTCAAGGCTG-3′; ActinB: 5′-CTCCATGTCATCCC
AGTTG-3′)为内标, 对不同样品模板进行均一化处理, 然
后利用 TNBL1基因特异引物(TNBL1-QF1: 5′-TTGGTTGC
CGTGTCCATTAC-3′; TNBL1-QR1: 5′-TAGCCAGAGGG
TCGCCGTT-3′), 对不同小麦样品中的 TNBL1基因转录物
的积累水平进行半定量 RT-PCR分析。
以 18S rRNA (18S rRNA-QF: 5′-GTGACGGGTGAC
GGAGAAATT-3′; 18S rRNA-QR: 5′-GACACTAATGCGC
CCGGTAT-3′)为内标 , 对不同样品模板进行均一化处理 ,
然后利用 TNBL1 基因特异引物(TNBL1-QF1 和 TNBL1-
QR1)和定量荧光 RT-PCR (qRT-PCR)技术, 对不同小麦样
品中的 TNBL1基因转录物的表达水平进行相对定量分析,
一次平行实验设 3 次重复。采用 ABI7300 型实时荧光定
量 PCR仪进行扩增, 反应体系 25 μL, 含 cDNA 5μL; 正
反引物(10 μmol L1)各 0.5 μL; SYBR Premix ExTaq (2×)
12.5 μL; ROX Reference Dye (50×) 0.4 μL; ddH2O 6.1 μL。
反应程序为 95℃ 2 min; 95℃ 15 s, 60℃ 31 s, 41个循环。
1.6 TNBL1基因沉默的小麦对BYDV的反应及黄矮病抗
感表型分析
在 BSMV:TNBL1转染 7 d后接种 BYDV-GAV毒蚜,
每株小麦接种 10头毒蚜, 饲毒 2~3 d杀死毒蚜。按我们曾
报道的方法[2]进行抗病性表型鉴定。于接种 BYDV毒蚜后
第 10天和第 20天, 分别取 TNBL1基因沉默的 YW642及
其未处理的 YW642 (抗病)、感病小麦中 8601对照的叶片,
提取总 RNA, 用随机引物法反转录成单链 cDNA 作为下
列分析的模板。以 18S rRNA为内标, 利用 BYDV-GAV外
壳蛋白(CP)基因特异序列(GAV-CP-U: 5′-CAGGCAGGA
CTGAGGTATT-3′; GAV-CP-L: 5′-GTTGCTGATTTTGA
GAGGG-3′), 通过 RT-PCR、qRT-PCR 技术分析 TNBL1
基因沉默的YW642植株及其抗感对照的叶片中 BYDV的
相对含量。
2 结果与分析
2.1 TNBL1基因 cDNA片段的克隆与VIGS重组载体的构建
通过 cDNA-AFLP分离的 TNBL1基因 ORF (GenBank
登录号为 GUO67479) 3′端的那段特异表达序列, 位于该
基因 cDNA序列的第 2 455~2 666碱基), 与源于小麦品种
whchul 的假定蛋白(GenBank 登录号为 CJ957259)相应片
段的同源性为 74%。构建带有 TNBL1 基因反向 cDNA片
段的VIGS载体BSMV:TNBL1 (图 1), 线性化, 转录, 摩擦
接种, 使 BSMV:TNBL1转染抗黄矮病的小麦-中间偃麦草
易位系 YW642的叶片。
2.2 利用 BSMV使 YW642中 TNBL1基因的沉默
在 YW642播种后约 12 d (二叶一心期)进行 BSMV:
TNBL1 侵染实验, TNBL1 在 YW642 植株实施 BSMV:
TNBL1 侵染后第 7 天即发生基因表达沉默(图 2), 并一直
持续沉默。



图 1 BSMV:TNBL1重组病毒载体的示意图谱
Fig. 1 Sketch map of BSMV:TNBL1 recombination vector



图 2 BSMV:TNBL1侵染的 YW642中 TNBL1基因表达分析
Fig. 2 Expression assay of TNBL1 gene in YW642 infected
with BSMV:TNBL1
A: 半定量 RT-PCR分析; B: 荧光定量 PCR分析; 误差线: 3个重
复的标准误。
A: semiquantitative RT-PCR assay; B: qRT-PCR assay. Error bars:
the standard error of three repeats.

在 BSMV 接种后第 10 天(BSMV:TNBL1 侵染 17 d)
和第 20 天(BSMV:TNBL1 侵染 27 d)时, YW642 植株中
TNBL1基因的转录水平极大地降低(图 3)。
第 11期 赵 丹等: 利用 BSMV-VIGS技术快速分析小麦 TNBL1基因的抗黄矮病功能 2109




图 3 BSMV:TNBL1和 BYDV侵染下的 TNBL1基因的表达分析
Fig. 3 Expression of TNBL1 gene under BSMV:TNBL1 and
BYDV infections
A: 半定量 RT-PCR分析; B: 荧光定量 PCR分析; R:抗病; S: 感
病; 误差线: 3个重复的标准误。
A: semi-quantitative RT-PCR assay; B: qRT-PCR assay; R: resis-
tant; S: susceptible. Error bars: the standard error of three repeats.

2.3 TNBL1基因沉默的 YW642对 BYDV的反应
利用 BYDV 的 CP 基因特异序列以及 RT-PCR、
qRT-PCR 技术, 分析 TNBL1 基因表达沉默后的 YW642
植株中 BYDV相对浓度。在接种 BYDV-GAV的 10 d和
20 d后, BYDV浓度逐渐积累; 在接种BYDV-GAV的 20 d
后, 感黄矮病的小麦中 8601的 BYDV浓度大约为 TNBL1
基因正常表达的 YW642 植株中 BYDV 浓度的 7 倍, 而
TNBL1 基因下调表达的 YW642 植株中 BYDV 浓度为
TNBL1基因正常表达的 YW642植株中 BYDV浓度的 3~4
倍(图 4-A, B), 表明 TNBL1 基因正常表达的结果抑制了
BYDV在 YW642中的繁殖, TNBL1基因是抗黄矮病反应
中一个正向调控基因。接种带 BYDV-GAV毒蚜 40 d左右
(图 4-C), TNBL1 基因下调表达的 YW642 显示感病症状:
旗叶 1/4黄化, 旗叶下 2片叶黄化, 感病级别达到 5级; 感
病小麦对照中 8601 叶片表现感病症状: 旗叶和旗叶下 2
片叶黄化, 感病级别达到 6~7 级; 而未处理的 YW642 的
感病级别为 0级, 表现高抗黄矮病。TNBL1基因下调表达
的YW642和感病小麦中8601在植株成熟后, 结实子粒较少,
种子干瘪; 而未处理的 YW642 植株成熟后结实子粒较多,
种子圆润饱实。说明 TNBL1基因是抗黄矮病重要基因。
3 讨论
NBS-LRR家族是已知的 R基因产物中最为庞大的一
类, 通过基因间、基因内的重组、基因转换、基因的缺失


图 4 TNBL1沉默的 YW642及其对照的半定量 RT-PCR分析
(A)、荧光定量 RT-PCR分析(B)和表型分析(C)
Fig. 4 Results of semiquantitative RT-PCR (A), qRT-PCR (B),
and phenotypic (C) analyses in YW642 and control plants under
TNBL1 gene silence
R: 抗病; S: 感病; 误差线: 3个重复的标准误。
R: resistant; S: susceptible. Error bars: the standard error of three
repeats.

和插入等机制进行演化和进化 , 进而产生多种不同的特
异抗性, 以应对高速变异的病原菌和各种胁迫反应[21]。研
究侯选 NBS-LRR 基因的功能, 对发现新的与植物抗性相
关的基因具有十分重要的意义。我们从抗黄矮病小麦易位
系 YW642 中克隆了一个编码 NBS-LRR 蛋白的候选基因
TNBL1, 包括 P-loop、kinase2、kinase3a 和 GLPL, 预测
TNBL1 参与信号转导过程; 含有多个 LRR 结构域, 由此
预测 TNBL1的功能可能参与抗黄矮病反应。
本研究通过 VIGS 技术初步分析了 TNBL1 基因的抗
黄矮病功能。VIGS 技术解决了植物基因功能研究周期长
的问题 , 只要病毒载体能够侵染植物 , 在病毒侵染植株
2~3 周内就能引起靶基因沉默, 进而引起表型变异, 可快
速分析出靶基因的主要功能[13]。利用基于 BSMV 诱导的
2110 作 物 学 报 第 37卷

基因瞬时沉默技术降低了 TNBL1基因在YW642中的转录
本水平, 而 TNBL1基因沉默的YW642中BYDV大量积累,
其浓度与感黄矮病对照中 8601的相似, 然而 TNBL1基因
正常表达的 YW642中则检测不到 BYDV的积累。表型鉴
定结果也表明, TNBL1 基因表达沉默的 YW642 植株表现
出类似于中 8601的感黄矮病症状, 而 TNBL1基因正常表
达的 YW642植株则表现抗 BYDV, 证明 TNBL1基因是正
向调控小麦抗 BYDV 反应的 1 个重要基因。但是, VIGS
方法具有目标基因沉默的局限性 , 沉默持续的时间有限
且不能遗传等缺点 , 无法准确对一些特定生长时期现症
的相关基因功能进行研究。然而, 通过转基因技术创制可
以稳定遗传的目标基因过表达和基因沉默的转基因小麦,
进行 2 代以上的功能研究。因此, 转基因小麦的发展, 对
于深入了解该基因的功能和作用机制非常必要。
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