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4种葫芦科植物病毒复合胶体金免疫层析试纸条的研制



全 文 :光性的淬灭基因(淬灭基团吸收报告基团的能量后
并不发光,大大降低了本底信号的干扰) ,原则上只
要有一个碱基突变,MGB 探针就会检测到,不产生
荧光信号,克服了普通 Taqman 探针假阳性较高的
缺点。本研究通过选取与冬生疫霉的近似、近缘的
22 株疫霉菌进行特异性检测,并进行大量实验验
证,建立的实时荧光 PCR 检测方法可以更加稳定、
高效的检测出冬生疫霉,相对于之前的 2 种 PCR检
测方法,检测冬生疫霉的稳定性、特异性、灵敏度和
时效性都极大提高。以后我们将利用该方法对冬
生疫霉的多种带病寄主材料直接提取核酸进行快
速检测研究,摸索出最佳的核酸提取技术,克服样
品前处理的难点,为口岸检疫该病菌提供稳定、高
效的检测技术。
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4 种葫芦科植物病毒复合胶体金免疫层
析试纸条的研制
梁新苗1 边 勇1 李建光1 周 琦1 李桂芬2 郑春生1 骆卫峰1 邓丛良1*
(1.北京出入境检验检疫局 北京 101312;2.中国检验检疫科学研究院动植物检疫研究所)
基金项目:国家质检总局科技计划项目(2008IK234,2009IK249)
* 通讯作者:E - mail:dengcl@ bjciq. gov. cn
收稿日期:2012 - 08 - 27
Gold immunochromatography assay for rapid detection of four cucurbitaceous viruses. Liang Xinmiao1,Bi-
an Yong1,Li Jianguang1,Zhou Qi1,Li Guifen2,Zheng Chunsheng1,Luo Weifeng1,Deng Congliang1* (1. Beijing
Entry - Exit Inspection and Quarantine Bureau,Beijing 101312,China;2. Institute of Animaland Plant Quaran-
tine,CAIQ)
Abstract Tri - sodium citrate with aqueous gold chloride were warmed up and mixed to make 25 nm colloidal
gold particle with the situation of pH 7. 6 and 10 ~ 15μg /mL protein. Two viruses test lines and one control line
on nitrocellulose filter were spread to assemble bidirectional compound immustrip for simultaneous detection of four
viruses of Cucurbitaceae. The results indicated that four viruses could be tested simultaneously with high specifici-
ty on immunostrip within 10 minutes,the sensitivity was a dilution of 103 fold purified viruses.
Key words cucurbitaceous virus;gold immunochromatography assay;compound immunostrip
摘要 使用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,在 pH值 7. 6,蛋白用量 10 ~ 15μg /mL条件下,制备形
成 4 种葫芦科植物病毒多克隆抗体的稳定胶体金蛋白复合物;设计了双向复合试纸条,使用微定量喷头在
试纸条两侧的硝酸纤维素膜上分别喷 2 条病毒检测线和 1 条质控线,组装制成免疫层析检测试纸条。结果
表明经过条件优化后制备的双向复合试纸条特异性好,可在 10min 内同时检测 4 种葫芦科植物病毒,且对
不同病毒阳性材料的检测灵敏度可达到稀释 103 倍以上。
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关键词 葫芦科植物病毒;胶体金免疫层析;复合型检测试纸条
中图分类号 S41
葫芦科(Cucurbitaceae)植物包括 118 属 825
种,主要分布于热带、亚热带地区。其中黄瓜属
(Cucumis)、南瓜属(Cucurbita)、西瓜属(Citrullus)、
葫芦属(Lagenaria)、丝瓜属(Luffa)、冬瓜属(Benin-
casa)等种类具有重要的经济意义,但研究表明,葫
芦科植物容易受到植物病毒侵害,造成严重损失。
Lovisolo于 1980 年首次总结了 25 种危害葫芦科植
物的病毒。目前经 ICTV承认的能侵染葫芦科植物
的病毒包括 38 个病毒确定种、9 个暂定种。其中小
西葫芦黄花叶病毒(Zucchini yellow mosaic virus,
ZYMV)、黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mot-
tle mosaic virus,CGMMV)、西瓜花叶病毒(Water-
melon mosaic virus,WMV)、南瓜花叶病毒(Squash
mosaic virus,SqMV)等为世界性分布和危害最严重
的病毒。
在对葫芦科植物病毒的防治过程中,既需要进
行准确检测,又需要田间快速诊断。本文以此为出
发点,利用胶体金免疫层析试纸条检测技术,制备
了具有简便、快速、灵敏度高等特点,且能同时检测
4 种常见的葫芦科植物病毒的试纸条,以适应基层
工作的实际需求[1]。
1 材料与方法
1. 1 病毒来源
黄瓜绿斑驳花叶病毒:分离自辽宁省盖州市郊
区感染的西瓜病叶;西瓜花叶病毒:购自 ATCC,编
号 PV -27;南瓜花叶病毒:北京检疫局从进口种子
中截获并保存;小西葫芦黄花叶病毒:中国农科院
郑州果树所惠赠;4 种病毒使用相同方法进行繁
殖、抗体制备,胶体金复合物制备,详见 1. 2 ~ 1. 5。
1. 2 病毒繁殖
取 1 g病毒阳性材料加入适量接种缓冲液后,
在研钵中磨碎,取研磨液,于西葫芦幼苗的两片子
叶完全展开时进行摩擦接种,接种完毕后用蒸馏水
冲洗。待出现明显危害症状后,取显症状叶片
备用。
1. 3 病毒抗体制备
用纯化病毒制剂免疫家兔,共免疫 4 次,每次
0. 25 mg 病毒,后腿肌肉注射。第 1 次免疫用弗氏
完全佐剂乳化,第 2、3、4 次免疫用弗氏不完全佐剂
乳化。每次免疫间隔 1 周。第 4 次免疫后 1 周耳
静脉采血测效价[2]。
1. 4 胶体金的制备[3 - 6]
采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,具体
操作方法参见文献[3]~[6]。
1. 5 金标抗体的条件优化及制备[7 - 8]
1. 5. 1 最适 pH值的确定
取 1. 5 mL 离心管若干个,均加入 1 mL 所制备
的胶体金;再向管中分别加入 10μ L,20 μL……100
μL等不同体积的 0. 1mol /L 的 K2CO3溶液,以调节
获得不同 pH值的胶体金溶液;将上述胶体金溶液
各取 100μL,按 pH值从低到高顺序依次加入 96 孔
板中,再向每个孔中加入 3μL 浓度为 1 mg /mL 的
抗体,充分混合后室温下放置 10 ~ 15 min,其后再
向每孔中加入 20μL浓度为 10%NaCl溶液,室温下
再放置 2h后,记录仍保持红色的最低 pH,在此 pH
值基础上增加 0. 5 即为最适 pH值。以上实验重复
3 次。
1. 5. 2 胶体金与抗体配比量的确定
取一 96 孔滴定板,分别加入最适 pH 的胶体金
100μL,再向各孔依次加入不同量的蛋白(浓度为
0. 1 mg /mL)1 ~ 20μL,混匀,室温下放置 15min 后,
再加入 20μL 10% NaCl,室温下放置 2h 后,颜色仍
保持红色的最小蛋白用量即最小蛋白浓度;确定最
小浓度后,按照最小浓度的 130%为最佳浓度。以
上实验重复 3 次。
1. 5. 3 金标抗体的制备
分别制备 4 种病毒的胶体金———抗体结合物。
加入最适浓度的抗体,具体操作方法参见文献
[4]。
1. 6 检测试纸条的制作
1. 6. 1 金标垫的制备
取黄瓜绿斑驳花叶病毒和西瓜花叶病毒胶体
金———抗体结合物 3mL,与等量稀释液混匀。放入
经过剪裁的玻璃纤维素纸浸泡 10 min,取出置 37℃
烤箱中烤干,热合封口,置 4℃冰箱备用[5],标记为
金标垫 AB。取另 2 种病毒胶体金———抗体结合物
使用相同方法制作金标垫,标记为金标垫 CD。
1. 6. 2 NC膜的制备
将病毒抗体 A、病毒抗体 B 和羊抗兔抗体用固
相缓冲液分别稀释,终浓度为 2mg /mL;在三维喷点
平台上,将 2 种病毒抗体和羊抗兔均匀的平行喷在
硝酸纤维素膜上,从左至右分别为 TA 线、TB 和 CAB
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线,各抗体线宽约 2mm,各线间隔 5mm 距离,记为
NC膜AB;将病毒抗体 C、病毒抗体 D 和羊抗兔抗体
按照相同方法喷制到另一条 NC 膜上,记为 NC
膜CD;室温条件下自然风干所制备的 NC 膜后,使用
O. 1%BSA封闭液封闭 1h;洗涤液中洗涤 2 次,每
次 5min,室温条件下自然风干。
1. 6. 3 试纸条的组装
在双面胶塑料板中央粘附样品垫;在样品垫两
侧粘附金标垫 AB和金标垫 CD,两垫与样品垫重叠
2mm左右,样品垫在上层;在金标垫 AB 外侧,粘附
NC膜 AB;在金标垫 CD 外侧粘附 NC 膜 CD,与金
标垫重叠 2mm,NC膜在金标垫下;在 NC 膜外侧粘
附吸水纸,与 NC 膜重合 2mm;用切条机切成 5mm
宽的试纸条,将试纸条压入测试卡模内,即为可同
时检测 4 种病毒的双向复合型测试卡。
1. 6. 4 试纸条功能示意图及制作模型
图 1 试纸条功能示意图
图 2 试纸条制作模型
1. 7 试纸条的检测方法
将检测样品液滴于检测试纸条中心的检测孔
下的样品垫上,样品溶液不少于 100μL,10 min 左
右判断结果。若试纸条仅质控 C 线出现紫红色线
而检测 T线未显色,结果为阴性;若试纸条上 C 线
和 T线均出现紫红色,结果为阳性;若试纸条 C 线
和 T线都没有显色,则说明此试纸条已经失效,结
果无效。
1. 8 试纸条的质量检测
1. 8. 1 特异性实验
分别取携带南瓜花叶病毒、西瓜花叶病毒、黄
瓜绿斑驳花叶病毒、小西葫芦黄花叶病毒的发病叶
片按 1:10(W/V)加入 PBS 缓冲液,用研钵研磨成
浆,2000 rpm离心 10 min,上清即为制备好的检测
样品。将上述溶液取 100μL滴于试纸条中央,按照
1. 7 的方法进行判断。每种病毒 3 个重复。
复合检测时将以上 4 种病毒溶液按照不同组
合等比例混合进行检测。相应的检测线显色,其他
检测线不显色,说明其特异性好,试纸条有效。
1. 8. 2 灵敏度试验
取检测样品,分别稀释 101 倍、102 倍、103 倍、
104 倍、105 倍,进行灵敏度比较,测试方法同1. 8. 1。
1. 8. 3 稳定性试验
将包被了抗原抗体的免疫胶体金层析条用塑
料袋密封,加入干燥剂,分别置于 4℃、37℃、室温
(20 ~ 25℃)条件下,其中置于 4℃和室温条件的试
纸条每隔 7d取出 3 条,置于 37℃的每天取出 3 条,
分别检测阴性样本和阳性样本。观察检测线的有
无、颜色深浅及玻璃纤维素膜上金标抗体的释放程
度。4℃和室温条件下的保存试验持续 4 周,37℃
条件下保存试验持续 7d。
2 结果
2. 1 最适 pH值
在 96 孔板上依次加入 NaCl 后,在 1 号 ~ 4 号
孔为兰色,5 号、6 号孔为过渡色,7 号 ~ 9 号孔为红
色,因此最低 pH 值为 7 号管,使用精密试纸测量
pH值为 7. 1,因此最适 pH值为 7. 6。
2. 2 胶体金与抗体配比量
由于胶体金为带负电的疏水性颗粒,在未结合
蛋白或结合不足时,加入 NaCl 后,由于盐离子效
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应,使胶体金颗粒的性质发生变化,从而出现由红
变蓝的聚沉现象。因此可以通过加入不同量的抗
体蛋白,来确定最小抗体配比量,进而确定最适抗
体用量。经检测最适抗体量如下,黄瓜绿斑驳花叶
病毒:10μg /mL;西瓜花叶病毒:13μg /mL;南瓜花
叶病毒:13μg /mL;小西葫芦黄花叶病毒:15μg /mL。
2. 3 试纸条特异性
经过与南瓜花叶病毒、西瓜花叶病毒、黄瓜绿
斑驳花叶病毒、小西葫芦黄花叶病毒的阳性材料测
试比较,仅滴加一种病毒阳性材料时其检测线及质
控线均出现明显条带,其他阳性材料仅质控线出现
条带,检测线未出现条带,复合滴加时,相应检测线
及质控线出现色带,其他检测线未出现色带,因此
本试纸条具有特异性。
2. 4 试纸条灵敏度
在不同稀释倍数下,分别稀释 101 倍、102 倍、
103 倍、104 倍、105 倍,检测不同病毒灵敏度,经过
检测灵敏度如下,黄瓜绿斑驳花叶病毒:104 倍;西
瓜花叶病毒:103 倍;南瓜花叶病毒:104 倍;小西葫
芦黄花叶病毒:103 倍。
2. 5 试纸条稳定性
从试纸条的测试结果来看,将试纸条放在内放
干燥剂的封口塑料袋中,仅室温下保存 4 周后和
37℃下保存 7d后的测试中,检测线的颜色略减弱,
其他测试中,颜色均无明显变化,说明在恰当条件
下保存,本试纸条具有较好的稳定性。
3 讨论
本文旨在建立一种简便、灵敏,适合现场快速
检测的方法,因此直接选取田间呈现一定症状的叶
片为阳性材料,有针对性的研制了检测试纸卡,其
适用于田间病害的早期普查,但考虑到自然条件下
植物病毒发病部位、病毒浓度的多变性,有必要对
不同发病时期、植株不同部位的病毒浓度变化情况
进行深入研究,以进一步优化本检测卡。此外,由
于目前 NC膜的规格以及层析距离等条件的限制,
为保证检测质量,现有 NC 膜只能容纳 2 条检测线
和 1 条质控线,国内、外已有一些可以同时检测 2
种病毒的商品化试纸条。本文在汲取单向双病毒
检测试纸条制备方法的基础上,采用双向模式,经
过优化,进一步节约了材料,并实现了对 4 种常见
葫芦科病毒的同时检测,虽然这种方式较单向检测
卡增加了样品的使用量,但与使用两条单向检测卡
分别检测相比较又可降低样品使用量。
由于传统的实验室检测方法程序较为复杂,分
析费用较高且耗时等因素,并不适宜大田病害检测
时的普遍应用,如何建立植物病害简便、快速、灵
敏,适合现场快速检测的方法,则是植物病害检测
工作发展的方向。本实验使用自制的高特异性金
标抗体,通过对试纸条的条件优化,制作 4 种病毒
复合胶体金免疫层析检测试纸条。该检测方法最
大的优点是无需借助检测仪器,检测快速、简便,10
~ 15min内即可检测出结果,且具有特异性好、灵敏
度高等优点。作为一种快速筛查的手段,既可节省
检测成本,又可用于广大基层单位开展葫芦科病毒
的检测和防控工作中,具有重要的经济价值和社会
价值。
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