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葫芦科蔬菜作物单倍体材料创制的研究进展



全 文 :中国蔬菜
★专题综述★            CHINAVEGETABLES           2006(1):33 ~ 36
雷 春 ,女 ,硕士 ,作物改良创新国家重点实验室 ,南京农业大学园艺
学院 ,南京卫岗 210095
陈劲枫(通讯作者), 通讯地址同第 1作者 , E-mail:jfchen@njau.
edu.cn
收稿日期:2005-01-24;修回日期:2005-09-12
基金项目:国家高技术研究发展计划专项经费(2004A241120), 国家
自然科学基金(30470120),教育部跨世纪优秀人才培养计划
葫芦科蔬菜作物单倍体材料
创制的研究进展
雷 春 陈劲枫
摘 要 葫芦科作物单倍体诱导有离体雄核发育和雌核发育两种途径。其中离体雄核发育途径(即花药或花
粉培养)创制单倍体较为困难 ,雌核发育途径中的离体未授粉子房或胚珠培养及辐射花粉授粉技术诱导单倍体有
较多成功的报道。本文综述了葫芦科蔬菜作物单倍体创制的研究进展 ,并简要地展望了应用前景。
关键词 葫芦科 单倍体 诱导
  单倍体材料具有重要的遗传研究价值和育种实践意义。
首先 , 单倍体的每种基因都只有 1个 , 是研究基因性质及其
作用的良好材料;其次 ,单倍体可直接表达隐性基因的性状 ,
更适于在细胞水平筛选突变体 , 进行植物基因克隆筛选;同
时 , 单倍体材料可查明其原始亲本的染色体组构成 , 用于物
种之间亲缘关系和物种进化的研究。由单倍体加倍获得的
双单倍体(DH)即为纯系 , 可直接用于育种 , 极大地缩短育种
周期;此外 , DH群体也是构建连锁图的优良群体。
在葫芦科蔬菜作物中 , 自发产生单倍体的频率极低 〔1〕。
为了获得单倍体 , 研究者尝试通过离体雄核发育途径(花药
或花粉培养)、雌核发育途径(未授粉子房或胚珠离体培养 ,
外源化学药剂 、正常花粉或辐射过的花粉授粉诱导的孤雌生
殖)等手段诱导单倍体。目前葫芦科蔬菜作物 9个属中除了
4个属(丝瓜属 、冬瓜属 、佛手瓜属和栝楼属)未见有获得单
倍体的报道外 , 南瓜属 、葫芦属 、西瓜属 、甜瓜属和苦瓜属等
5个属均已获得了单倍体。
1 离体雄核发生途径
总的来讲 , 瓜类蔬菜作物通过离体雄核发育途径生产单
倍体难度较大(表 1), 只有西瓜的花药培养较为成功。 Xue
等 〔2〕于 1981年利用琼酥西瓜品种 , 通过培养单核靠边期的
花药在国际上首次获得了西瓜单倍体植株 ,并从其加倍后代
中直接选育出了优良的新品种。 1983年 , 他们又在周至红
这一品种上获得了成功 ,但同时发现愈伤组织易褐变且诱导
率不高 〔3〕。随后 ,袁万良等 〔4〕通过研究解决了愈伤组织褐
变死亡问题 ,将分化阶段愈伤组织的诱导率从 0.5 %提高到
94.4 %, 并快速诱导出了绿色组织。魏英 〔5〕在 4 ℃和 10 ℃
的低温条件下进行预处理 ,降低了花药壁愈伤组织的形成 ,
提高了花药愈伤组织的诱导率。
在南瓜的花药培养上也有人做过一些尝试。 Shail等 〔6〕
培养花药但没有获得单倍体植株。 Kurtar等 〔7〕对 4个南瓜
品种花粉母细胞处于单核期的花药进行培养 , 并摸索了蔗糖
浓度和 2, 4-D浓度对培养效果的影响 , 但最后得到的 3棵
植株均为二倍体。直到 1998年 , Metwally等 〔8〕才成功地得
到了 10棵单倍体植株 , 并对培养基进行了筛选 ,发现单核中
期和单核晚期的南瓜小孢子接种在 MS+15 %的蔗糖 +5
mg· L-1 2, 4-D上培养的效果最好 , 每块愈伤组织植株再
生频率可达 19.2 %。
在甜瓜的花药培养上 , Dryanovska等 〔9〕曾作过尝试 , 结
果以失败告终。在黄瓜上 , 早在 1982年 , Lazarte等 〔10〕就取
黄瓜处于四分体 、小孢子 、成熟期 3个时期的花粉进行花药
培养 ,并从中得到了再生植株 , 但直到目前没有进一步报道 ,
所得植株是否起源于小孢子还未可知。 直到 2003年 , Ashok
等 〔11〕才成功获得了黄瓜单倍体植株 , 但诱导频率仍然很低 ,
难以用于育种实践。
2 雌核发育途径
葫芦科蔬菜作物通过花药培养的途径诱导单倍体非常
困难 ,鉴于大孢子也是单倍性的 , 研究者又尝试着用雌核发
育途径来生产单倍体 ,取得了一定成功。雌核发育主要包括
离体条件下的雌核发育和活体条件下的雌核发育两个方面。
在葫芦科蔬菜作物中 , 主要通过对未授粉子房(胚珠)和辐
射花粉授粉后的子房进行离体培养这两种离体雌核发育方
—33—
表 1 葫芦科蔬菜作物通过不同手段创制单倍体的情况
物种 获得途径 参考文献
黄瓜 离体雄核发育 Lazarteetal, 1982;AshokKumaretal, 2003
离体雌核发育 辐射花粉授粉 TruongAndre, 1988
未授粉子房(胚珠) Gémesné etal, 1997, 2002;杜胜利 , 2001
活体雌核发育 自发 Aalders, 1958
外源正常花粉授粉诱导 Nikolovaetal, 2001
辐射花粉授粉诱导 NiemirowiczSzczytetal, 1989;Sauton, 1989;Przyborowskietal, 1992, 1994;Caglaretal, 1996,
1999;Lotfietal, 1999;Farisetal, 1999;Nikolovaetal, 2001;杜胜利等 , 2001
甜瓜 离体雄核发育 Dryanovskaetal, 1983
离体雌核发育 辐射花粉授粉 Ogawaetal, 2002
未授粉子房(胚珠) Ficcadentietal, 1999
活体雌核发育 外源正常花粉授粉诱导 DumasdeVaulx, 1979
辐射花粉授粉诱导 Sautonetal, 1987;Sauton, 1988a, 1988;Sarietal, 1992;Cunyetal, 1991, 1992, 1993;Ficcadentiet
al, 1995;Abaketal, 1996;Yanmazetal, 1999;Ogawaetal, 2002;ZhaDingshi, 2002;Lotfietal,
2003
西瓜 离体雄核发育 Xueetal, 1983;薛光荣等 , 1988;袁万良等 , 1995;魏英 , 1999
活体雌核发育 辐射花粉授粉诱导 Gursozetal, 1991;Sarietal, 1994
南瓜 离体雄核发育 Shailetal, 1987;Metwalyetal, 1998;Kurtaretal, 1999
离体雌核发育 未授粉子房(胚珠) Chambonnetetal, 1985, 1986;Gémesné etal, 1997;Metwalyetal, 1998;陈学军等 , 2000
活体雌核发育 外源正常花粉授粉诱导 Hayase, 1954;Kurtaretal, 2000
辐射花粉授粉诱导 Kurtaretal, 1999, 2002
式获得了单倍体植株;活体雌核发育主要是通过外源正常花
粉或辐射花粉授粉诱导方式进行(表 1)。其中离体子房(胚
珠)培养和辐射花粉授粉诱导这两种途径创制单倍体的效
果较好。
2.1 未授粉子房(胚珠)离体培养诱导的雌核发育
 对未授粉的子房或胚珠进行离体培养诱导雌核发育创制
单倍体在葫芦科的黄瓜 、甜瓜 、南瓜属上均已见成功报道
(表 1)。
对黄瓜子房(胚珠)培养的条件进行过很多探索。
Gémesné等 〔12〕取 0.5 ~ 1.0 cm长的黄瓜子房通过离体培养
首次在黄瓜上获得了单倍体植株 ,可能由于诱导条件和取材
大小的原因 , 诱导频率很低。 2002年 ,他们 〔13〕对 6种不同基
因型的黄瓜进行了取材时期和预处理方式的研究 ,发现雌花
开放前 6 h时胚囊刚好形成 , 胚的诱导频率最高 ,同时发现
热处理可以提高最适发育阶段雌配子雌核发育的频率 。杜
胜利等 〔14 , 15〕研究了黄瓜离体雌核发育时的解剖特征和培养
早期外植体的生理生化变化 ,结果表明 , 在子房培养的前 6
d,外植体的各种酶都发生了与对照明显不同的变化 ,解剖学
观察发现此时雌核发育即已开始。培养 24 d胚状体开始形
成 , 40 d形成成熟的胚状体 。
在南瓜属中 , Chambonnet等 〔16〕、DumasdeVaulx等 〔17〕、
Metwaly等 〔18〕和陈学军等 〔19〕利用未授粉胚珠培养 , Gémesné
等 〔12〕利用子房培养均成功地获得了单倍体植株。同时 ,
Metwaly等 〔18〕对 4℃低温预处理效果进行了研究 , 发现植株
再生频率在不进行低温处理时最好。
甜瓜子房培养的报道相对较少。 Gémesné等 〔12〕曾对培
养条件进行过摸索 ,并得到了单倍体植株。 Ficcadenti等 〔20〕
采用了与 Gémesné等 〔12〕相似的培养方法获得了甜瓜的单倍
体植株 ,最高胚发生频率可达 36.4%, 再生植株中单倍体发
生频率为 15.4 %。
2.2 外源正常花粉授粉诱导的雌核发育 通过外源
正常花粉授粉也可诱导瓜类的雌核发育。早在 1954年 , Ha-
yase〔21〕就从笋瓜(CucurbitamaximaL.)×中国南瓜(Cucurb-
itamoschataL.)的杂交果实中得到了单倍体植株。 Dumas
deVaulx〔22〕用 CucumisficifoliusL.给甜瓜(CucumismeloL.)
授粉得到了甜瓜的单倍体植株。 Nikolova等 〔23〕用 1个二倍
体的黄瓜株系给 1个双单倍体的黄瓜株系授粉 ,从其后代中
筛选出了 5棵单倍体植株。 Kurtar等 〔24〕曾用西瓜 〔Citrulus
lanatus(Thunb.)MatsumetNakai〕、甜瓜(Cucumismelovar.
cantalupensisNaud.、Cucumismelovar.flexuosusNaud.)、黄瓜
(CucumissativusL.)、南瓜(CucurbitamaximaDuch.exLam.
andCucurbitamoschataDuch.exPoir.)、丝瓜(Luffaacutangu-
laL.)、瓠瓜〔Lagenariasiceraria(Molina)Standl.〕和黑籽南
瓜(CucumisficifoliliaBouchè)分别给 4种不同基因型的南瓜
(CucurbitapepoL.)授粉试图诱导单倍体 , 结果只有 Cucurbi-
tapepoL.×CucurbitamoschataDuch.exPoir.这一组合的果
实中有种子和胚 ,但最后所得的再生植株全为二倍体。可见
这一途径单倍体发生频率低且不稳定。
2.3 辐射花粉授粉诱导的雌核发育 Sauton等 〔25〕通
过辐射花粉授粉结合胚胎拯救技术从甜瓜作物中成功地获
得了单倍体植株 ,随后人们对基因型 、辐射剂量等影响因素
进行了系统的研究并将其应用于甜瓜和葫芦科其他蔬菜作
物 ,取得了很大成功(表 1、2)。
2.3.1 基因型对单倍体诱导的影响 基因型对单倍体产生
的影响因作物不同有些差异。 Ficcadenti等 〔26〕对甜瓜进行
研究发现 ,不同的正反交组合对单倍体的诱导有显著影响。
—34—
但 Caglar等 〔27〕对 27种不同的黄瓜母本进行研究证明不同
的基因型对单倍体的诱导率没有很大差别。此后 , Faris
等 〔28〕用 8种不同基因型的黄瓜进行试验也证明 ,同一剂量
下的单倍体发生频率同基因型无关。
2.3.2 辐射剂量对单倍体诱导的影响 Co60产生的 γ射线
是辐射花粉授粉技术诱导葫芦科蔬菜作物单倍体的有效辐
射源。辐射剂量的选择是诱导单倍体的关键因素之一 。实
践中大多以临界剂量或半致死剂量作为适宜剂量的标准 , 同
时也有研究 〔29 , 30〕认为辐射剂量同植物的倍性及花粉粒大小
有关 , 倍性越高或花粉粒越小越耐辐射。此外 , 辐射剂量与
作物的种类 、辐射的器官和植株的生长状态等有关。黄瓜选
用的剂量为 100 ~ 900 Gy〔31, 32〕 ,其中 200 ~ 300 Gy辐射时单
倍体的诱导率较高 〔32, 33〕 , 西瓜的常用剂量也为 200 ~ 300
Gy〔33 , 34〕;甜瓜的辐射剂量 150 ~ 4 000 Gy都有人试验过 , 但
较常用的是 500 ~ 2 500 Gy〔25, 35〕;南瓜的有效辐射剂量普遍
较低 , 通常为 25 ~ 50 Gy〔36〕。
2.3.3 其他因素的影响 亲本植株良好的生长状态直接影
响到单倍体的发生频率 ,因此植株生长在适宜的温湿环境很
重要。花粉管到达胚囊的数量越多 , 越能有效地促进雌核发
育 〔25 , 37〕 , 从而提高单倍体的诱导率 , 因此辐射授粉前后花粉
活力的保持和授粉量的多少也是影响诱导率的关键因素。
此外 , 辐射花粉诱导雌核发生产生的胚大都不能发育完全 ,
败育胚的比例很高 , 可能与发育不全的胚乳营养供应不足有
关 〔38〕 ,因此适时进行胚拯救也非常重要。一般认为授粉后
3 ~ 4周进行胚培养较为合适 〔36〕。
表 2 葫芦科蔬菜作物辐射花粉技术诱导单倍体的情况 1)
作物 辐射剂量 /Gy 最高胚产率 /% 参考文献
黄瓜 300, 900 13 NiemirowiczSzczytetal,
1989
- 0.3 Sauton, 1989
300 1.34 Przyborowskietal, 1994
300, 450, 600 1.7 Caglaretal, 1996
200, 300 6 Caglaretal, 1999
100, 200, 300, 400 2.6 Lotfietal, 1999
50, 100, 200, 300 — Farisetal, 1999
300, 500 — Nikolovaetal, 2001
甜瓜 - 3 Sautonetal, 1987;Sau-
ton, 1988a, 1988
300 1.1~ 2.3 Sarietal, 1992
150, 500, 1 600,
2 500, 3 600, 4 000
— Cunyetal, 1992, 1993
600, 1 200, 2 400 0.3 Ficcadentietal, 1995
250, 300, 350 — Yanmazetal, 1999
650(X射线) — ZhaDingshi, 2002
250 — Lotfietal, 2003
西瓜 200, 300 4.7~ 14.2 Sarietal, 1994
南瓜 0, 25, 50, 75, 100,
200
— Kurtaretal, 1999
25, 50, 75, 100, 200,
300, 400
8.2~ 10.5 Kurtaretal, 2002
  注:1)没有特殊说明的为 γ射线处理;-表明不知道具体数值
3 应用前景
葫芦科中的大多数作物都是中国重要的园艺作物 , 生产
上迫切需要适应特殊生态条件和抗病高产的优良品种 , 因此
急切需要快速创制出一批优异的育种材料。但葫芦科各属
的蔬菜作物大多遗传基础狭窄 ,同时又存在远缘及近缘杂交
障碍 ,所以利用常规育种手段周期长 、变异小 ,并且不易捕捉
目标性状。单倍体技术的研究和应用将会极大地缩短育种
周期 ,提高育种效率。同时 , 单倍体重要的遗传价值也将为
葫芦科蔬菜作物的遗传研究开辟广阔的前景。
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·会讯 ·
关于召开全国茄子育种工作交流会的通知
中国园艺学会蔬菜专业委员会定于 2006年 3月在海南省海口市召开全国茄子育种工作交流会。会议由海南省农业科学
院瓜菜研究所承办 , 中国农业科学院蔬菜花卉研究所协办。届时将邀请有关专家作茄子育种进展及生物技术在茄子育种上
的应用等专题报告。欢迎从事茄子科研 、教学 、种子推广人员及生产单位参加会议。现将会议有关事项通知如下:
会议内容:①交流茄子育种和材料创新技术 , 研讨今后茄子育种研究协作事宜。 ② 探讨茄子育种和新品种推广工作现
状 、存在问题及解决方法。 ③参观考察全国茄子新品种 、新品系种植展示现场。 ④探讨针对 “十一五”茄子科研协作 、项目申
请等事宜。
会议时间 、地点:会议将于 2006年 3月中旬在海南省海口市召开 , 会期 3天。 报名截止日期 2006年 2月 1日 , 2006年 2
月中旬发出第二轮通知。会议费用:会议费每人 800元 , 交通 、食宿费用自理。交流材料:会议代表应准备近年茄子育种技术
和材料创新技术等方面的交流材料 ,会议将编纂论文集(非正式出版)。
会议联系人:陈贻诵 联系电话:0898-65314959, 13307572790 E-mail:YISONG.CHEN@126.com
通讯地址:海南省海口市流芳路 9号 ,海南省农业科学院瓜菜研究所 邮政编码:571100
中国园艺学会蔬菜专业委员会
海南省农业科学院瓜菜研究所
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