全 文 ：广 西 植 物 Guihaia Jun．2015，35(3)：384—292 http：／／journa1．gxzw．gxib．cn
D0I：10．11931／guihaia．gxzw201312041
陈琪，江雪梅，孟祥宇，等．茶树茶氨酸合成酶基因的酶活性验证与蛋白三维结构分析EJ2．广西植物，2015，35(3)：384—292
Chen Q，Jiang XM，Meng XY，et a1．Enzymatic activity verification and protein three-dimensional structural analysis of theanine synthetase gene in Camel
ha sinensis[J]．Guihaia，2015，35(3)：384—292
茶树茶氨酸合成酶基因的酶活性
验证与蛋白三维结构分析
陈 琪 ，江雪梅，孟祥宇，张正竹，宛晓春
(安徽农业大学 茶与食 品科技学院，茶树生物学与资源利用国家重点实验室 ，合肥 230036)
摘 要：针对 NCBI上已登录的茶氨酸合成酶与谷氨酰胺合成酶基因序列进行克隆、原核表达与酶活性验证，
利用多种生物信息学数据库和软件 ，对 CsTS与 CsGS基因进行结构、性质和功能预测，采用同源建模法对蛋
白三维结构进行预测 ，比较并预测催化作用位点的差异 ；用系统进化树分析从裸子植物到高等被子植物的谷
氨酰胺合成酶基因序列 ，推测其进化的演变过程；通过对原核表达的基因T程菌提取粗酶液进行酶活性测定。
结果表明：尽管茶树 TS与 GS序列高度同源，但是原核表达后的融合蛋白仍然显示 了不同的催化能力，蛋 白
一
、二级结构分析显示 TS与 CsGS差异不大，但是通过同源建模形成的蛋 白三级结构分析显示，CsTS与
CsGS存在 3个催化位点上的差异，这可能是导致其酶活性差异的关键。系统进化分析结果首次确定茶氨酸
合成酶应为谷氨酰胺合成酶基因家族成员，按照其细胞定位预测应为胞质型 GS，其亲缘关系与 同为双子叶植
物的葡萄 、陆地棉、巴西橡胶树、拟南芥较接近。
关键词：茶氨酸合成酶；谷氨酰胺合成酶 ；蛋 白二三维结构；同源性分析
中图分类号：Q949；$571．1 文献标识码：A 文章编号：1000—3142(2015)03—0384—09
-一 ·- · ●· ⋯ ·· l J ● · 1● ‘ l Enzym atic activity veritlcation and DI。0Iteln tllI．ee．-dlm enStona
structural analysis 0f theanine synthetase
● ，、- ■ ■ ● ● ●
Rene in camel lta SIS
CHEN Qj，JIANG Xue-Mei，M[ENG Xiang-Yu，ZHANG Zheng-Zhu，Ⅵ N Xiao-Chun
(State Key Laboratory oj Tea Plant Biology and Utilization，College oJ Food Science
and Technology，Anhui Agricultural University，Hefei 230036，China)
Abstract：The aim of this study was to analyze the highly homologous sequences of theanine synthetase genes and
glutamine synthetase genes of tea plant，speculate their evolutionary relationship，predict their structures，natures，
functions and differences of enzyme active sites，and then to provide a basis for CsTS genes function studies of
tea．Two gene sequences logged on NCB1 were cloned，the expression of enzymes activities was verificated through
HPLC and LC-MS and phylogenetic analysis was implemented within the searching result．The expression of en—
zymes in E．coli suggested CsTS and CsGS had different catalytic activities although their high homology．The pri
mary and secondary protein structures of CsTS and CsGS were analyzed and the result showed that there was no sig
nificant difference between them，but the third protein structure analysis by homology modeling in the catalytic sites
收稿日期：
基金 项 目：
作者简介：
通讯 作者 ：
2014 04—28 修 回日期 ：2014—06 1 5
国家 自然科学基金重点项目(31170283)；安徽省教育厅 自然科学重点项 目(KJ2Ol 3A11 2)。
陈琪(1980一)，女，贵州贵阳人 ，博士，讲师，主要从事茶树生物技术研究，(E—mail)chenqi@ahau．edu．cn。
宛晓春，博士，教授，主要从事茶树次生代谢研究，(E mail)xcwan@ahau．edu．cn。
3期 陈琪等 ：茶树茶氨酸合成酶基 因的酶活性验证与蛋 白三维结构分析 385
showed three differences in the catalytic sites，which could lead to the difference of enzyme activity．In this research，
CsTS gene sequences were firstly identified as the members of GS gene family through phylogenetic analysis．Accord—
ing to celular localization prediction，CsTS should belong to cytoplasmic GS (GS1)，for its kinship close to grape，
upland cotton，rubber tree，arabidopsis etc．
Key words：theanine synthetase；glutamine synthetase；protein three-dimensional structure；homology analysis
茶氨酸(Theanine，N一乙基一丫一L一谷氨酰胺)是茶
树体内中唯一 的非蛋 白质氨基酸 ，目前仅在蕈 (Xe—
rocomus badius)和某些 山茶属植物 (Camellia a—
ponica，C．sasanqua)中有 报 道 (Casimir et a1．，
1960；Tsushida et a1．，1984)。茶氨酸在新梢芽叶中
约占游离氨基酸总量的 70 ，在鲜 叶中约 占茶 叶干
重的 1 9／6～2 ，是影响茶叶风味的重要次生代谢物
(宛晓春 ，2003)。茶树作为一种多年生的耐铵性经
济作物 ，具有与其它植物不 同的氮素代谢途径 ，即茶
树氮代谢 与茶氨酸代谢 紧密相联 (杨 贤强 ，1987)。
茶氨酸作为茶树氮储存 与氮转运载体功能 ，是茶树
之所 以耐胺 的重要因素。茶氨酸合成酶 (Theanine
synthetase，TS)的发现对于研究 茶树氮吸收与转运
机制具有重要意义 ，但对其基因序列研究表 明该酶
与植 物 谷 氨 酰胺 合成 酶 (Glutamine synthetase，
GS)基因高度 同源 ，可 以推 测它们极 有 可能是 GS
家族成员。多数研究者认为 GS是由 1个小 的基 因
家族编码 ，这些基 因至少编码 1种质体型和 3种(拟
南芥 中)到 5种(玉米 中)胞液型 GS多肽 (Masakazu
et a1．，2004；Martin et a1．，2006)。许多植 物的 GS
基因已被 克隆 ，如大麦、玉米 、水稻 、豌豆 等 (Free—
man et a1．，1990；Zhang et a1．，1997；Lin et a1．，
2000；Morey et a1．，2002)，但 目前只在 Camelia属
的部分植物中检测 到茶氨酸或克 隆出 TS基因，因
而研究 TS与 GS蛋 白催化结构的差异及进化关系
成为揭示 茶树特殊耐胺 性 的关键 。由于 已登录 的
TS与 CsGS 基 因 同源 性较 高，我 们 选 择 了在
0RF框 两 端 有 差 异 位 点 的 2条 基 因 序 列 TS
(DD410895)与 GS(AB115184)进行克 隆和原核表
达 ，并对它们的酶活性进行 比较与测定 ，验证它们在
功能上可能存在的相关性 ；同时利用生物信息学 的
手段分析二者在蛋 白结构上 的差异 ，以解析酶活性
差异 的机制 。
利用系统进化的分析手段可以为推测物种间在
基因组结构 的差 异、发 现未知基 因、预测 基 因的功
能 、进行功能基因的克隆 ，进而了解物种 间的进化关
系 ，提供重要 的参考 ，而对蛋 白的三维结构进行预测
有助于推断基因的功能 ，寻找其催化位点或 活性 中
心。通过对现存 的众多农作物生物信息数据的搜索
与分析，寻找主要的 GS基因，构建 了植物 GS基 因
的系统进化树 ，并利用此进化树分析茶树 TS基 因
与之的进化关系，同时利用 SWISS—MODEL中已有
的植 物 GS蛋 白模 板 ，运用 同源 建模 技术 构建 了
CsTS模型，并对其可能的催化位点进行了预测，为
进一步针对其基因功能的研究提供借鉴 。
1 材料与方法
1．1材料与试剂
茶叶品种农井 43采 自大杨店实验茶园；DH5 ，
Rosseta good大肠杆菌菌株 (E．coli)由本实验室保
存 。工具酶与试剂 ：各种限制性 内切酶、dNTP、Taq
plus DNA聚合酶、PMD-19T克隆载体、DNA mak—
er等购自TaKaRa公司；Oligo(dT)、M—MLV逆转
录酶购 自Promega公司；pMAL—C2X载体购 自 Bi—
olab公 司；In—Fusion Dry—Down PCR Cloning Kit
购 自Clontech公司；氨苄青霉素 、j3一巯基 乙醇及其它
常规试剂均 为 国产试剂 。PCR引物 合成 与测 序：
PCR引物 由上海生工生物工程服务有限公司合成；
测序由上海 Invitrogen公司完成 。
1．2茶树 CsTS1与CsGS1基因原核表达载体的构建
与功能验证
1．2．1茶树叶 片总 RNA 的提取及 eDNA 第一链的
获得 取一芽二 叶的龙井 43嫩 叶，在液氮 中速冻，
采用史成颖等 (2007)的方法 ，提取茶叶的总 RNA。
以 Oligo(dT)为引物 ，取总 RNA 5 g，逆转录合成
cDNA第一链 。
1．2．2 cDNA特异片段的 RT—PCR扩增 根据 Gen—
Bank已 登 录 的 TS(Theanine synthetase，Acces—
sion：DD410895)与 GS(Glutamine synthetase，Ac—
cession：AB115184)序列 ORF部分 ，设计两对引物 ：
TS—F1：5『_GCCAGA TCT ATG TCTCTTCTTTC—
CGA一3 ，TS—R1：5 一TTGTCGACTTACGGTTTC—
CA GAGG一3 以 及 GS—F1：5，_GACGATA丁CATG—
GCTCAGCTTTCAGATCTC一3 ，GS—R1：5 一GCA—
GAA TTC TCATGGTTTCCACAGGATGGT一3
386 广 西 植 物 35卷
建立 3O I 反应体系：cDNA 1．6 L(1．6 g)，3 L
1o×PCR缓冲液 ，1．8 L 10／amol·L primer up，
1．8 L 10 ／amol· L primer down，2．4 L 25
mmol·L MgC12，0．6 I 10 mmol·L dNTP，0．3
／xL TaqDNA聚合酶。扩增程序为 94℃ 5 min后 ，
94℃ 1 min，56℃ 1 min，72℃ 1 min 2O S，3O个循
环 ；72℃延伸 10 min。循环结束后用 1．5 琼脂糖
进行凝胶电泳鉴定，随后切胶 回收 ，与 PMD一19T载
体连接后转大肠杆菌 DH5a，挑取 阳性克隆测序 。
1．2．3构建 pMAL—C2X表 达载体 用 pMAL—C2X
表达载体进行 目的片段 的原核表达 。由于使用 In—
Fusion Kit进行连接反应 ，只需用带有载体两端各
15个碱基的特定 目的 DNA引物进行 PCR，便可将
PCR产物与载体直接连接。设计特异引物 ：TS—F2：
5 一GAGGGAAGGATTTCAGAA TCT CTT CTT
TCC GAT CTT TAC一3 和 TS—R2：5 一ACGACG—
GCCAGTGCCAAG TTA CGG TTT CCA GAG
GAT GG一3 以 及 GS—F2：5 一GAGGGAAGGA
TTTCAGAA GCT CAG CTT TCA GAT CTC
AT一3 和 GS—R2：5 一TACTCTAGAGGATCCGAA
TCA TGG TTT CCA CAG GAT GG一3 。以 PMD—
TS／GS质粒 DNA为模板，采用高保真 Taq DNA
聚合酶进行 PCR扩增 ，扩增及 PCR纯化过程同上，
转入 Rosseta Good菌株中进行诱导表达 。
1．2．4 pMAL—TS诱导蛋 白上清液进行 酶促反 应
将已加入 0．1 mmol／L IPTG于 32℃诱导表达 4 h
后的菌液于 4℃ ，5 000 r·min。离心 10 min，去上
清后用灭菌水洗涤菌泥，洗去残留的培养液后，将湿
菌泥重悬于超声缓 冲液 (100 mmol／L Tris醋酸缓
冲液 ，PH7．5，10 mmol／I EDTA，5 mmol／L DTT)
中，配制成 100 mg·mI 菌液 ，冰浴下超声(超声 2
S一间隔 3 S，60次)后 4℃，12 000 r·min 离心 15
min，取上清作为粗酶液。
酶促反应 体系 ：0．4 mL反应 液 (100 mmol／L
Tris—HC1缓冲液 ，pH7．5，其 中含 25 mmol／I Tris，
25 mmol／L L—Gin，25 mmol／L EtNH 2·HCI，25
mmol／L MgC12，250／xmol／L J3一巯基乙醇)，0．2 mL
ATP(钠盐 ，10／amol／L)，0．4 mL粗酶液 ，总体积为
1．0 mL。该反应体系于 35℃水浴 反应 45 min后 ，
100℃煮沸 5 min终止酶反应 (对照 ：将粗酶提取液
预先于 100℃煮沸 5 min终止酶活后加 入反应体
系)。反应混合液 12 000 r·min。’离心 10 min，上清
液用于产物 L一茶氨酸检测 。
对照 1：取 pMAL—C2X 空 载 体 转 入 Rosseta
Good中，挑取单菌落按照上述方法诱导表达制备上
清蛋白，按照反应体系进行反应后检测茶氨酸含量。
对照 2：取 pMAL—GS表达载体 ，挑取单菌落按
照上述方法制备蛋白，按照反应体系进行反应后检
测茶氨酸含量。
1．2．5酶促反应测定的 HPLC分析条件 酶反应体
系的高效液相色谱检测条件为 Aglient 1200色谱系
统 ，Aglient ZORBAX Eclipse XDB C18柱 (4．6×
250 mmol／L，粒度 5 m)，流动相 为 0．05 (v／v)
甲酸(液质联用使用)或 0．05 9／6三氟乙酸(液相用)，
柱温 25℃ ，流速 l mI ·min ，进样量 ：5 L，检测
波长 199 nm。分析历时 55 min，其中柱分离时间为
15 min，然后逐 步切换为纯 乙腈冲柱 25 min，再切
换为流动相平衡 5 min(其间流动相 与乙腈 两相切
换过渡时间均为 5 rain)。
1．2．6酶促反应结果的质谱验证 采用 电喷雾质谱
(ESI—MS)对酶促反应 的产物进行鉴定 ，在研究氨基
酸碎裂的过程中采用质谱的 EPI(Enhanced product
ion scan)模式 ，在正离子模式下所选择 的离子喷雾
电压和入 口电压分别为 4 500和 1O V，在负离子模
式下二者分别为 3 200和一1O V，电喷雾质谱 (ESI—
MS)离子化参数 ：毛细管 电压 15 v。毛细 管温度
200，气流速 2O个单位，辅气流速 1O个单位；质谱图
m／z扫描 区间为 50～400。
1．2．7 pMAL GS的酶活性测定 对构建的 pMAL—
GS表达载体按上述方法进行 诱导表达 ，并 对表达
的融合蛋白直接进行 酶活性测定 ，酶反应参见乔 富
廉(2002)的方法。对照 1：取 pMAL—C2X空载体转
入 E．coli Rosseta Good中，挑取单菌落按照上述
方法制备粗酶液进行反应后 ，检测吸光值。对照 2：
取 pMAL—TS表达载体 ，按照上述方法进行检测 。
1．3茶树 CsTS1与 CsGS1基因的生物信息学分析
1．3．1基本理化性质分析 利用 ExPASy的 Prot—
Param工 具 包 在 线 分 析 蛋 白的 主 要 理 化 特 性 ，
DNAstar 7．0分析蛋 白分子 的结构特 点，NetPhos
2．0 server在线分析蛋白中可能存在的磷酸化位点 。
1．3．2蛋 白 3一D结构分析 利用 Inter ProScan，(ht—
tp：／／www．ebi．ac．uk／Tools／pfa／iprscan／)网 站 工
具 预 测 CsTS1与 CsGS1蛋 白 的 结 构 域 ，通 过
Swiss—Model(http：／／swissmode1．expasy．org)，对
蛋 白质三级结构进行分析 ，并且通过 Meta pocket
(http：／／sysbio．Zju．edu．cn／metapocket／)进行 同源




3期 陈琪等 ：茶树茶氨酸合成酶基因的酶活性验证与蛋 白三维结构分析 391
图 9 植物 GS基 因序列的进化树分析
Fig．9 Phylogenetic relationships with plant GS proteins
点，但其所能结合的氨基酸位点有着细微的差别，这
也许就是二者催化反应差异 的原 因所在，但需通过
点突变等反向实验予以证实。
2．7 GS蛋 白系统进化树构建
利用 NCBI数据库中的 Blast软件将 目的基 因
编码的氨基酸序列与 GeneBank中的氨基酸序列进
行 比对和相似性搜索 ，并下载为 Fasta文件 ，将来 自
山茶属、葡萄、拟南芥 、水稻、小麦、大豆、苜蓿、樟子
松 、北美云松、小立碗藓等 17个 GS家族成员 的共
61条序列进行多序列连配分析(图 9)。收集了从苔
藓类 ，裸子植物，被子植物等 17种具有代表性 的 GS
基因序列 ，从图 9可 以看 出，序列大致分为三大类 ，
其中苔藓类与裸子植物归为一类，被子植物中的单
子叶植物与双子叶植物分别为一类 。对 以水稻为代
表 的单子叶植物进行分析可知，稻属的 16条序列按
照 GS组织特异性与功能分为三类 ，即叶部胞液型
(GS1)、叶部质体型 (GS2)与根部胞液 型(GSr)，其
他单子叶植物的聚类与水稻相似 。双子叶植物的聚
类较为复杂，以拟南芥为代表的双子叶植 物 GS基
因可分为胞液 型(GS1)与质体 型(GS2)两 大类 ，可
与大豆 、甘蓝型油菜等植物中的 GS聚类 ，但 由于双
子叶植物的复杂性，不同植物中GS基因多为单独
分化。如山茶属中的GS基因与葡萄、陆地棉等物
种同源性较高，由于偏木本的特性仍可单独划分为
1 j ]j
，_ -_、 ，-- ，-_●●--、
392 广 西 植 物 35卷
三类 ，对 山茶属 GS基因进一步分析可知 ，两条茶氨
酸合成酶基 因序列分别 与不 同的 CsGS序列 聚类 ，
而与 CsGS(AB115184)距离较远 ，由此可初步推论
茶氨酸合成酶基因为 GS基因家族成员 ，在进化过
程 中由于突变导致蛋 白结构的变化从而改变 了其催
化 的活性中心，形成新的酶功能 。
3 讨论
在蛋 白质的分析 比较 中，我们发现茶树茶 氨酸
合成酶与谷氨酰胺合成酶的高度同源性 ，谷氨酰胺
合成酶(glutamine synthetase，GS，EC6．3．1．2)是高
等植物氨同化过程 的关键酶，而茶 氨酸合成酶同样
在茶树氮素同化和转运过程中起重要作用。植物中
几种不 同类 型的谷氨酰胺 合成酶 (glutamine syn—
thetase，GS，EC6．3．1．2)的主要功能在于：Gs1参与
萌发种子 中储存氮源的转运以及衰老叶片中氮源的
再转移 ；GS2主要定 位于叶绿体 ，参与光呼吸 中释
放的氨的重新 同化 ；部分植物根部存在的 GSr主要
与根部氨同化相关，起到减弱胞液中氨浓度增加的
作用(Miflin et a1．，2002；李常健等，2001)。对比茶
氨酸合成酶的功能，茶树可通过将多余的氮源转为
酰胺类的“氨”(主要为茶氨酸)储存 ，从而减缓过量
氮肥对茶树的伤害，而储存 的茶氨酸主要输送至新
梢，提供嫩叶中旺盛的氮代谢需求，表明 CsTS的功
能与 GS有很多共同之处 ，针对 CsTS组织特异性
的研究表 明(Deng et a1．，2009)，CsTS在茶树各器
官中均有表达 ，其 中 Cs丁S1在 叶部表达量较高，而
CsTS2在根部表达量较高 ，其表达均受到外源氮素
营养 的调 控，结 合 系统进 化树 的结果 分析 表 明 ，
CsTS的特性与胞液型 GS相近 。
对于为何只在山茶属部分植物中发现存在茶氨
酸?为何 CsTS与 GS序列如此相近 ，而在别 的植
物中却未发现相类似的 GS基 因具有合成茶氨酸 的
功能?我们推测可能是由于茶树进化过程 中存在正
选择的作用 ，使得碱基突变导致氨基酸结合位点 的
变化从而改变了酶反应的结合底物，利用同源建模
方式预测 了 3个置信度最高的底物结合位点，可见
CsTS1与 GS的底物结 合位点在空间上很接近 ，但
氨基酸位点有细微 的差异 ，可能导致结合小分子构
象产生差别 ，这可能是由于它们具有不 同的酶催 化
功能 ，但还需要进行点突变试验予 以证实。Takashi
et a1．(1998)在细 菌 中发现有 一类 假单 胞菌 属 的
Glutaminase具有非特异性 的转 7一谷氨酰基功 能，
能催化 甲胺 或乙胺 与谷氨酰胺一起合成 一谷氨酰
甲胺或 7一谷氨酰 乙胺 (茶氨酸 )，而 CsGS与 CsTS
酶均具有转氨基的功能 ，差别只在于前者是将氨基
转移到谷氨酸 5一羧基上形成酰胺键 ，而后者是将乙
胺基转移到同一位点形成酰 乙胺 。我们据此推测 ，
在茶树的进化过程 中很可能还存在一类 GS，能同时
催化氨基与乙胺基形成不 同的产物，由于茶树基 因
组 测 序 工 作 尚未 完 成 ，我 们 还 未 能获 得 所 有 的
CsGS序列 ，因此，相关研究工作还有待进行。
4 结论
本研 究 针对 茶树 中同源性 较高 的 CsTS1与
CsGS1基 因进行 克隆与原 核表达 ，利 用 HPLC和
LC—MS等方法证实 了表达得到的融合蛋 白的催化
功能 ，证实茶树中的 TS可以利用谷氨酰胺 与乙胺
合成茶氨酸，而尽管序列同源性较高的 CsGS1却并
不具备这一功能。随后运用生物信息学的手段针对
茶树茶氨酸合成酶基因 CsTS的蛋白结构进行分
析 ，通过运用同源建模的方法构建蛋白=三维模型 ，推
测其催化活性位点，找到 3个与谷氨酰胺合成酶的
差异位点 。同时在生物信息数据库 中筛选了从苔藓
到被子植物 17个物种 的 63个具有 CDS全长的谷
氨酰胺合成酶基因，通过构建系统进化树分析，结果
表明 ，茶树茶氨酸合成酶应属于植物谷氨酰胺合成
酶基因家族成员。
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