全 文 ：广 西 植 物 Guihaia　Dec．２０１５,３５(６):７８６－７９１　　　　　　　　　　 http://journal．gxzw．gxib．cn　
DOI:１０．１１９３１/guihaia．gxzw２０１４０４０４１
唐其,马小军,莫长明,等．罗汉果全基因组Survey分析[J]．广西植物,２０１５,３５(６):７８６－７９１
TangQ,MaXJ,MoCM,etal．GenomesurveyanalysisinSiraitiagrosvenori[J]．Guihaia,２０１５,３５(６):７８６－７９１
罗汉果全基因组Survey分析
唐　其２,３,马小军１∗,莫长明３,潘丽梅３,韦荣昌３,赵　欢１
(１．中国医学科学院 药用植物研究所,北京１００１９３;２．湖南农业大学 园艺园林
学院,长沙４１０１２８;３．广西药用植物园,南宁５３００２３)
摘　要:罗汉果是广西特有药用及甜料植物,其主要成分之一甜苷V作为天然、非糖甜味剂,具有广阔的开发
前景,但罗汉果目前完全来自于栽培,适生区狭窄,连作障碍严重,加之含量低导致甜苷 V生产成本居高不
下,严重限制了其应用.为了减少盲目性,在大规模全基因组深度测序之前,先做低覆盖度的基因组Survey
测序,评价基因组的大小及复杂程度,以确定适合该植物全基因组的测序研究策略.该研究采用第二代高通
量测序技术(IluminaHiseqTM２０００)首次测定了罗汉果基因组大小,并利用生物信息学方法估计罗汉果杂合
率、重复序列和GC含量等基因组信息.结果表明:(１)获得了１８．１Gb罗汉果基因组测序数据,基因组大小估
计为３４４．９５Mb左右,测序深度为５２×;(２)从KＧmer分布曲线发现罗汉果基因组有明显的杂合峰,杂合率达
１．５％,基因组高杂合导致组装的结果中ContigN５０和ScaffoldN５０的长度比预期的要短很多,还造成GC平
均深度及含量分布明显异常,存在一个低深度分布区域.基因组主峰后面有微弱的重复峰,说明罗汉果存在
较多的重复序列;(３)由于罗汉果存在高杂合率和重复序列较多的特点,该基因组测序分析仅采用全基因组鸟
枪法(WGS)策略不合适,为了更好地对全基因组进行序列拼接和组装,可尝试结合采用FosmidＧtoＧFosmid或
BACＧtoＧBAC策略.该研究结果对于揭示罗汉果产量、有效成分含量、发育及抗病虫的分子机制,以及通过分
子育种来提高甜苷V含量和降低生产成本具有重要意义,为全基因组测序策略的选择提供了依据.
关键词:罗汉果;基因组测序;杂合率;GC含量;鸟枪法测序策略
中图分类号:Q９４３．２　　文献标识码:A　　文章编号:１０００Ｇ３１４２(２０１５)０６Ｇ０７８６Ｇ０６
GenomesurveyanalysisinSiraitiagrosvenori
TANG Qi２,３,MAXiaoＧJun１∗,MOChangＧMing３,
PANLiＧMei３,WEIRongＧChang３,ZHAOHuan１
(１．InstituteofMedicinalPlantDevelopment,ChineseAcademyofMedicalSciences,Beijing１００１９３,China;
２．HorticultrueandLandscapeCollege,HunanAgriculturalUniversity,Changsha４１０１２８,China;
３．GuangxiBotanicalGardenofMedicinalPlants,Nanning５３００２３,China)
Abstract:Siraitiagrosvenori (Luohanguo)isaherbaceousperennialmedicinalandsweetenerplantnativeinGuanＧ
gxiofChina．IthaslongbeenusedintraditionalChinesemedicineasanaturalsweetenerandalsoasafolkmedicine
forthetreatmentoflungcongestion,coldsandsorethroats．ManycucurbitaneＧtypetriterpeneglycosideshavebeeniＧ
solatedandcharacterizedfromS．grosvenori．TheactivecomponentsresponsibleforthesweetnessarethemogroＧ
sides,whicharemembersofthefamilyoftriterpeneglycosides．MogrosideVhasanimportantprospectasnatural
andlowcaloriesweetener,whichisnearly４２５timessweeterthansucrose．S．grosvenoricurrentlydependstotaly
收稿日期:２０１４Ｇ０５Ｇ２８　　修回日期:２０１４Ｇ０７Ｇ２２
基金项目:国家自然科学基金(８１３７３９１４,３１４００２７５);国家科技支撑计划项目(２０１１BAI０１B０３);广西农业科技成果转化项目(桂科转１１２３０１３Ｇ
１２);广西自然科学基金(２０１３GXNSFBA０１９１７０);湖南省科技计划重点项目(２０１４SK２００５);广西卫生厅中医药科技专项(GZPT１２３５).
作者简介:唐其(１９８１Ｇ),男,湖南株洲县人,博士,助理研究员,研究方向为药用植物分子生物学,(EＧmail)tangqi４２３＠sina．com.
∗通讯作者:马小军,博士,教授,从事药用植物生物技术研究,(EＧmail)mayixuan１０＠１６３．com.
oncultivationinChina．It’slimitedlyappliedbecausethenarrowdistribution,seriouscontinuouscroppingobstacle,
lowcontentandhighextractioncostsofmogrosideV．InordertoreduceblindnessresearchanddeterminetheapproＧ
priatesequencingstrategy,thegenomesurveybeforelargeＧscalegenomesequencingisneeded．ThissurveycanproＧ
videinformationaboutthesizeandcomplexityofthewholegenomeoftheS．grosvenori．ThenextgenerationseＧ
quencingtechnologywhichhasbeenemergedasacosteffectiveapproachforhighＧthroughＧputsequencedetermination
hasdramaticalyimprovedtheefficiencyandspeedofgenesdiscoveryandgenomeresearch．GenomesequencingofS．
grosvenori hasthevitalsignificancetorevealthemolecularmechanismofyield,content,growth,pestanddisease
resistance,andprovidesaneficientapproachtoimprovecontentandreducecostofmogrosideVbymolecularbreedＧ
ing．Inthisstudy,thegenomesizeofS．grosvenoriiwasdeterminedbynextＧgenerationsequencingtechnologies
(NGS,IluminaHiseqTM２０００)．Thehybriditypercentage,repeats,andGCdepthwerealsoestimatedbybioinforＧ
maticsanalysis．Theresultswereasfolows:(１)TwoDNAlibrariesof１７０bpand５００bpareconstructed．After
cleaningandqualitychecks,morethan１８．１Gbhighqualitydatafromthegenomeisgenerated,whichwereassemＧ
bledinto９４３２９６contigsand４３３３２５scafoldsbySOAPdenovosoftware．Thecontigandscafoldnumbersofthe
lengthmorethan２kbwere１７８５５and２７９９３separately．Thelongestlengthofcontigandscafoldwere２９kband
２６８kb．TheN５０lengthofcontigandscafoldwere４８４bpand２３３１bp．Theaveragegenomesizeandsequencing
coveragedepthofS．grosvenori wasabout３４４．９５Mband５２timesrespectively;(２)ThegenomeofS．grosvernri
hadobvioushybriditypeakbyKＧmermethod,thehybriditypercentageashighas１．５％．Theassemblyresults
showedthatthelengthofcontigN５０andscafoldN５０aremuchshorterthanexpected．Highhybriditypercentageof
thegenomeleadstoapparentlyunusualphenomenonbetweenaveragedepthandGCcontent,andhadalowdepth
distributionarea．Therewasaweakrepeatpeakbehindthemainpeak,whichdemonstratedthatS．grosvenori has
morerepetitivesequences;(３)WholeＧgenomeshotgunsequencing(WGS)shouldnotbeusedtoS．grosvenorigeＧ
nomesequencingseparately,andtheFosmidＧtoＧFosmidorBACＧtoＧBAClibrarycouldbecombinationalusedforbetＧ
terresults．Thisstudywouldnotonlyobtainthebasicresourcesofgenome,butalsoprovideatheoreticalbasisand
targetgenesforS．grosvenoriiintransgenicbreedingandgeneticengineering．
Keywords:Siraitiagrosvenori(Luohanguo);genomesequencing;hybriditypercentage;GCdepth;wholeＧgenome
shotgunsequencing
　　罗汉果甜苷Ⅴ目前无法通过化学合成而完全依
赖于栽培后提取获得,栽培品种含量为１％左右,甜
苷V仅存在于占果重不到１５％的果肉中(苏小建
等,２００６).此外,罗汉果适栽区狭小且存在严重的
连作障碍,导致了甜苷 V的生产成本居高不下,作
为甜味剂无法与蔗糖、木糖醇和甜菊糖RA９５竞争,
从而限制了其广泛应用.由于常规杂交育种对于甜
苷V含量的提高潜力有限且效率低,因此全面解析
罗汉果基因组,阐明甜苷V生物合成途径对于通过
分子育种手段提高甜苷V含量、降低生产成本具有
重要的研究价值.
罗汉果染色体数目和核型前人已有研究(庄伟
建等,１９９７;李琦等,２００７),罗汉果染色体数目为２n
＝２x＝２８,由６m＋１２sm＋６st＋４t构成,按核型分
类属于３A型(Fuetal．,２０１２).罗汉果甜苷V生
物合成途径已初获阐明(Tangetal．,２０１１),部分
基因如法呢基焦磷酸合酶(FPP)和葡萄糖基转移酶
(UDPG)已进行了克隆(蒙娇荣等,２０１１;邢爱佳等,
２０１３),罗汉果功能基因组研究处于起步阶段.然
而,有关罗汉果基因组大小和全基因组测序研究均
未见报道.常用的测定基因组大小的方法有FeulＧ
gen分光光度法(Duetal．,２００６)和流式细胞法
(王亚之等,２０１０;李秋实等,２０１３).新一代测序技
术 (NewＧGeneration Sequencing technologies,
NGS)的迅猛发展加速了植物全基因组的研究进
程,成为当前最新的测定基因组大小的手段(伍艳芳
等,２０１４).目前,有报道已完成８０余种植物的全基
因组测序,还有大量的植物正在测序,这为研究植物
的全基因组测序提供了大量的参考信息,特别是同
属葫芦科的黄瓜(Huangetal．,２００９;Qietal．,
２０１３)、西瓜(Guoetal．,２０１２)和甜瓜(GarciaＧMas
etal．,２０１２)全基因组草图的绘制完成,对于罗汉
果基因组的解析具有借鉴作用.
罗汉果栽培虽有４００多年历史,但由于罗汉果
属于异交作物,杂合性较高,基因组大小不明,而且
遗传背景复杂.为减少盲目性,在大规模全基因组
７８７６期　　　　　　　　　　　　唐其等:罗汉果全基因组Survey分析
深度测序之前,可以先做低覆盖度的初步测序,了解
基因组的大小及复杂程度,以确定适合该植物全基
因组的测序研究策略和拼接软件及技术(施季森等,
２０１２).本研究采用第二代Solexa高通量测序技术
(IluminaHiseqTM ２０００),对罗汉果全基因组大小
进行测定和评估,旨在为罗汉果全基因组测序方案
的制定提供依据.罗汉果的全基因组测序,将为掌
握和利用罗汉果潜在的基因资源,阐明甜苷V生物
合成途径及其调控机制,从而利用分子生物学手段
对罗汉果进行靶向遗传改良奠定基础.同时,对于
提高甜苷V含量,降低生产成本和拓宽应用范围也
具有促进作用.
１　材料与方法
１．１材料
所用材料为罗汉果青皮果品种“农院B６”组培
苗.黄化处理后,剪取顶端幼嫩叶片,液氮速冻后
置Ｇ７０℃超低温冰箱保存备用.
１．２方法
１．２．１样品提取及检测　采用改良CTAB法(Liuet
al．,２０１１)提取罗汉果叶片基因组DNA,紫外分光
光度计检测浓度,琼脂糖凝胶电泳检测完整性,检测
参数为胶浓度０．５％,电压３．５V,电泳时间９６０
min,以１kbDNALadder(Takara)和λＧHindⅢ
digest(Takara)作为 Marker.
１．２．２测序　将提取的 DNA 样品进行测序分析.
先将罗汉果的DNA样品进行随机打断,构建１７０
bp和５００bp的小片段测序文库,再用Ilumina
HiseqTM２０００平台进行双末端(PairＧEnd)测序,过
滤掉低质量数据,得到的高质量数据用于后续的基
因组大小、杂合度和GC含量等信息分析.结合罗
汉果的自身特性,按照３４５Mb左右的罗汉果基因
组大小来估算测序覆盖度.
１．２．３１７Ｇmer分析及基因组大小估计　在基因组组
装前,采用基于KＧmer的分析方法来估计基因组大
小和杂合率等,取 K为１７来进行分析(Huanget
al．,２００９).假设从reads中逐碱基取出的所有KＧ
mer能够遍历整个基因组,且KＧmer深度频率分布
服从泊松分布,即可从所有测序reads中统计 KＧ
mer频数分布,计算获得 KＧmer深度估计值,用于
估计基因组大小.KＧmer分布图用来判断基因组的
重复序列多少,如果这个基因组含有高比例的重复,
那么其分布图将显示出粗的拖尾现象.
１．２．４杂合率估计　采用模拟数据拟合的方式进行
基因组杂合率评估.选用酵母基因组序列,随机生
成５７×,１００bp读长的reads,读长错误率为０．
３５％.因为二倍体复杂基因组进一步分为微杂合基
因组(０．５％≤杂合率＜０．８％)、高杂合基因组(杂合
率≥０．８％)以及高重复基因组(重复序列比例≥
５０％),针对不同类型的基因组,采用的测序方法及
组装软件不同,因此分别加入杂合率为１．４％、１．５％
和１．６％的模拟数据进行拟合,将所得模拟数据分别
进行１７Ｇmer分析.测序物种真实曲线的主峰和杂
合峰与哪条模拟数据最接近,就可大致认为该物种
的杂合率处于相应的水平.
１．２．５GC含量及分布分析　利用高质量数据进行
SOAPdenovo组装(Lietal．,２００９),采用 K＝４１
构建Contig和Scaffold,得到Scaffold序列后没有
补洞,直接拼接组装获得原始基因组序列,这是一个
最初的组装版本.用SOAP将过滤后的reads比对
到该组装序列上,获得碱基深度.以１０kb为窗口,
在序列上无重复前进,计算每个窗口的平均深度与
GC含量,做出GC_depth点图.根据GC_depth分
布图测序是否有明显的GC偏向,可以判断是否存
在细菌污染等情况.同时,还可根据GC聚成块的
分层来判断基因组的杂合率和重复的分布情况.
２　结果与分析
２．１测序数据量统计
采用高通量测序技术进行本次测序,过滤掉低
质量数据后,得到的总测序量为１８．１Gb用于后续
分析,若罗汉果基因组大小如预计的３４５Mb,那么
测序深度为５２×(表１).
２．２１７Ｇmer分析以及基因组大小估计
使用罗汉果１８．１Gb的数据用于１７Ｇmer分析,
其频率分布如图１.横坐标表示１７Ｇmer出现的次
数,纵坐标表示出现的频率.图１显示,１７Ｇmer分
布曲线成峰情况较好.在４４附近有个主峰值,即
KＧmer的期望深度.表２显示,KＧmer的总数是
１５１７７Mb(约１５Gb),从而可以通过公式(基因组
大小＝KＧmer的总数/KＧmer的期望深度)估算基
因组大小为３４４．９５Mb.从图１还可看出,在期望
深度１/２处有一个明显的凸峰.据此可以判断罗汉
果基因组具有较高杂合率的可能性.KＧmer曲线呈
８８７ 广　西　植　物　　　 　　　　　　　　　　　　　　３５卷
现明显拖尾,说明罗汉果基因组重复序列含量较高.
表１　过滤数据量统计
Table１　Datastatistics
文库ID
LibID
读长
Read
length
(bp)
插入片段
大小
Insertsize
(bp)
数据量
Data
(Mb)
测序深度
Sequence
depth
(×)
SZAXPI００７８２３Ｇ３９ １００ １７０ １１８６０．３６ ３４
SZAXPI００７８２２Ｇ４１ １００ ５００ ６２２６．５３ １８
合计 Total １８０８６．９０ ５２
图１　１７Ｇmer分布曲线
Fig．１　Distributioncurveof１７Ｇmer
表２　１７Ｇmer分析数据统计
Table２　Datastatisticsandanalysisof１７Ｇmer
KＧmer总数
KＧmer
totalnumber
(Mb)
KＧmer
深度
KＧmer
depth
基因组
大小
Genome
size
(Mb)
所用碱
基数
Used
bases
(Mb)
所用读长
Used
reads
(Mb)
测序
深度
Sequence
depth
(×)
１５１７８ ４４ ３４４．９５ １８０６９ １８１ ５２．３８
２．３杂合率估计
选用酵母基因组序列作为模拟数据估计罗汉果
基因组的杂合率.由图２可以看出,罗汉果真实曲
线的主峰和杂合峰在杂合率１．５％时形成的峰与酵
母的模拟数据最接近,因此可大致认为罗汉果的杂
合率处于１．５％水平,说明罗汉果杂合率高,用普通
的建库方法和拼接软件可能影响组装效果.
２．４基因组初步组装结果
利用１８．１Gb高质量数据进行罗汉果基因组的
初步组装,K＝４１构建Contig和Scaffold,没有补
洞,获得原始基因组序列(表３).从表３可以看出,
由于罗汉果杂合率高达１．５％,组装的结果中ConＧ
tigN５０和ScaffoldN５０的长度比预期的要短很多.
因此,进一步说明全基因组鸟枪法不适合复杂的罗
汉果基因组的组装.
图２　１７Ｇmer杂合率估计图
Fig．２　Statementofhybriditypercentageof１７Ｇmer
表３　组装结果统计表
Table３　Statisticsofassemblyresults
inS．grosvenoriiGenome
项目
Item
Contig
大小
Size(bp)
数目
Number
Scaffold
大小
Size(bp)
数目
Number
N９０ １４４ ６８３０１１ ２３２ ２１４３６２
N８０ １７４ ４８３２１５ ５４１ １２３８９８
N７０ ２２５ ３２３１７５ ８５３ ７３８１３
N６０ ３１６ ２０３９１４ １３６９ ４２６１８
N５０ ４８４ １２２３７８ ２３３１ ２３６９０
最长 Thelongest(bp) ２９９４８ ２６７８７８
总大小 Totalsize(bp) ３１４５１９６４５ ３３２３８６６６０
总数 Totalnumber
(＞１００bp)
９４３２９６ ４３３３２５
总数 Totalnumber
(＞２kb)
１７８５５ ２７９３３
２．５GC含量及分布分析
GC_depth分析显示(图３),GC测序无明显偏
向,但罗汉果平均深度与 GC含量分布明显异常,
GC_depth深度分布被分成了２层,存在一个低深度
分布区域.取出低深度区域的序列与Nt核酸库进
行Blastn比对,未比对上细菌序列,而且细菌序列
一般GC含量较高,因此可以排除此区域为细菌污
染的可能性.GC聚成的块分成了２层,平均测序
深度为５２×,低深度分布区域的深度约为正常深度
分布的１/２,结合杂合模拟显示罗汉果高度杂合的
结果,由此我们推测是由杂合引起.因为杂合会使
两条同源染色体杂合的部位只装出了一条,或２条
都没有装出,同时该部位以上的read乘数是整个基
因组乘数的一半,导致GC含量图中出现较低的一
层.于是取出该区域对应窗口的序列,与正常深度
分布区域序列进行了Blastn比对.如果是由于杂
９８７６期　　　　　　　　　　　　唐其等:罗汉果全基因组Survey分析
合造成的,会比对出较多的高相似度区域,结果证实
了此推测.从低深度B区域取出来的２１．４２Mb序
列中,有１６．８２Mb(７８．５％)的序列相互间存在高相
似度.因此低深度分布B区域是由于罗汉果基因
组高杂合造成的.这不仅解释了图３中GC_depth
分布图的异常,也进一步验证了罗汉果的高杂合率
的特性.说明单纯的使用全基因组鸟枪法测序后不
能很好的进行基因组组装.
图３　GC_depth分布图
Fig．３　DistributionfigureofGC_depth
３　讨论与结论
基因组大小又称基因组含量或DNA１C值,是
指物种配子染色体组所含DNA的量.基因组大小
是比较和进化基因组学研究的基础,对不同物种基
因组大小进行比较分析,可以掌握基因组大小变化
规律.全基因组复制及基因组染色体翻倍现象已成
为热门的研究方向.本文对罗汉果基因组大小进行
测定,为葫芦科植物基因组大小变化规律提供参考.
据报道,葫芦科中的黄瓜(Cucumissativus)基因组
为３４５ Mb,西瓜(Citrulluslanatus)的基因组为
４２５Mb,甜瓜(Cucumismelo)的基因组为４５０Mb.
基于第二代高通量测序技术的罗汉果基因组大小为
３４４．９５Mb,与黄瓜的基因组大小相近,比西瓜和甜
瓜略小.其他３个物种由于经过长期的人工驯化,
杂合率比罗汉果的低.
流式细胞仪是目前应用较多的基因组大小测定
方法,在毛竹(李潞滨等,２００８)、五节芒(邓果特等,
２０１３)等植物和药用真菌如茯苓(李秋实等,２０１３)、
灵芝(王亚之等,２０１０)中都有广泛的应用.除此之
外,还有Feulgen分光光度法和脉冲场凝胶电泳法
等,高通量测序技术的快速发展为基因组评估提供
了更迅捷的方法.本文采用的 KＧmer分析法是基
于全基因组测序片段的 KＧmer深度分布估计物种
基因组大小的方法,得到了罗汉果基因组大小、杂合
度、GC含量等结果,为该物种的进一步精细全基因
组测序提供详细的遗传背景.测序技术在近几十年
得到飞跃发展,其中第一代如Sanger测序比较成
熟,但是通量低.第二代测序如Ilumina公司的
Solexa、ABI公司的SOliD和Roche公司的４５４测
序仪由于高通量、速度快等优点目前应用极为广泛,
成为测序主流.第三代测序技术Ｇ单分子测序正在
研制之中,虽已推出了第三代测序仪并有少量应用,
但是进入大规模应用还需时日.由于许多植物属于
高杂合、高重复的基因组,因此采用不同的测序技术
相结合,可以获得较好的结果,如Sanger＋Ilumina
(黄瓜)、Sanger＋４５４(甜瓜)、Iilumina(西瓜)等.两
种或多种测序方法的互补和联用进行测序研究,不
失为当前一种可取的策略.通过全基因组测序,一
般ContigN５０能达到２０kb以上,ScaffoldN５０能
在３００kb以上,这样才能满足后续的组装要求,拼
接出比较满意的基因组序列.二代测序技术中常用
的组装软件主要有SOAP,Velvet、ABySS、GSAsＧ
sembler等２０余种.实践证明,单个拼接软件在不
同物种测序结果的拼接中存在一定的局限性,多种
序列拼接软件的比较研究能够提高序列拼接的精确
度,对于非模式植物的全基因组测序研究具有重要
的指导意义.经过全基因组测序和生物信息学后获
得的大量全基因组测序结果,可以为该物种的分子
育种或分子标记辅助育种选择奠定坚实的基础.
本研究首次测定了罗汉果基因组大小,并对相
应的参数进行了初步评估,主要结论如下:(１)罗汉
果基因组大小粗略估计为３４５Mb左右;(２)罗汉果
基因组有较高的杂合度和一定的重复,属于复杂基
因组范畴,杂合率约为１．５％,对组装的效果影响较
大.用 WGS策略进行组装有一定的风险和难度;
(３)由于罗汉果基因组杂合率较高,全基因组鸟枪法
不适合该基因组分析.可尝试使用BACＧtoＧBAC
策略或FosmidＧtoＧFosmid策略对WGS策略进行补
充,联合进行组装,这种组装策略对杂合度较高的复
杂基因组拼接帮助较大.上述罗汉果全基因组surＧ
vey分析结果将对罗汉果全基因组精细图谱绘制方
案的制定提供重要的依据.
０９７ 广　西　植　物　　　 　　　　　　　　　　　　　　３５卷
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１９７６期　　　　　　　　　　　　唐其等:罗汉果全基因组Survey分析