全 文 ：书桑树（川桑Ｍｏｒｕｓ　ｎｏｔａｂｉｌｉｓ）全基因组测序
＊
桑树基因组研究团队
（家蚕基因组生物学国家重点实验室，重庆　４００７１６）
摘　要　　人类栽桑养蚕起始于５０００年之前，所开创的丝绸之路极大地影响了世界历史的进程。
家蚕的基因组已经被解析，与之相辅，我们在此描述了桑树（川桑）的基因组。经过组装之后的桑
树基因组大小为３３０Ｍｂ，含有１２８Ｍｂ的重复序列，编码了２９　３３８个基因，转录组数据支持了其中
６０．８％的基因。分析桑树基因组发现，桑树基因的进化速度是蔷薇目其他物种的大约３倍，这一
特征可能促进了其在地球上的传播和分布。桑树在过去的１亿年中没有经历基因组加倍事件，这
一现象只在除了几个蔷薇目物种的少数真双子叶植物中出现。然而，在桑树及其他树种中却发现
了一系列新的多倍体类型，这一种新型的加倍事件可能对其更加有利。在家蚕的血淋巴和丝腺中
鉴定到了５个预测的桑树来源的 ｍｉＲＮＡ，暗示了植物和植食性昆虫之间在分子水平上存在相互
作用。除此之外，对桑树中与分化选择、抗性和乳汁中表达的蛋白酶抑制子等相关的编码基因的
鉴定和分析将推进桑树改良的研究进程。
桑树为落叶乔木，对家蚕而言是一种重要经济饲料作物。桑叶饲养家蚕用于生产贵重蚕
丝的过程至少起始于５　０００年以前［１］，通过“丝绸之路”塑造了世界历史。
桑科包含了３７个属，约１　１００个种，其中包括大家熟知的桑树、面包树、无花果树、榕树、
见血封喉树等［２］。桑树属于桑属，桑属包含了１０到１３个公认的种，超过１　０００个栽培品
种［３］。这些栽培品种广泛的种植于欧亚大陆、非洲以及美国。在中国和印度，分别有约
６２６　０００、２８０　０００ｈｍ２的土地用来栽桑养蚕［４］。由于美味的桑椹、造纸用的桑皮及其在东方传
统医学方面的多种用途等特性，桑树的栽植对农民具有很强的吸引力［５－６］。
家蚕是一个专食桑叶的昆虫，为鳞翅目的模式昆虫。目前已知的大多数鳞翅目昆虫都是
农业及林业上的害虫，因此对经济具有重要的影响。促摄食物质对理解植物－昆虫相互之间
关系具有关键的作用，家蚕成功驯化使得深入研究这些促摄食物质成为可能，这对理解植物与
昆虫之间关系是非常关键的。家蚕基因组精细图已于２００８年测序完成［７－８］。然而，桑属中物
种几乎没有任何基因组信息。桑树基因组测序完成不仅能够促进桑树改良，而且通过对桑树
与家蚕基因组的分析将进一步加深我们对植物－植食性昆虫之间适应性进化的理解。
本文我们报道了桑树（川桑）基因组测序草图。桑树基因组估算为３５７ＭＢ，包含了７对染
色体，通过Ｉｌｕｍｉｎａ技术测序覆盖深度达到２３６倍。基于组装完成的３３０ＭＢ基因组，鉴定到
１２８ＭＢ的重复序列以及２９　３３８个蛋白编码基因。比较基因组分析表明相较于其他已测序的
蔷薇目植物而言，桑树进化速度更快。对桑树抗性基因的鉴定及分析将加速桑树品种改良。
另外，我们在家蚕两个组织中发现了桑树的ｍｉＲＮＡ，这个结果从分子水平上暗示了植物－植
食性昆虫之间可能的相互关系。
１　结　果
１．１　基因组测序和组装
川桑体细胞包含７对不同的染色体（图１），我们通过全基因组鸟枪法策略对川桑进行测
１
第３３卷　第４期
２０１３年　１２月
　　　　　　　
蚕　学　通　讯
Ｎｅｗｓｌｅｔｔｅｒ　ｏｆ　Ｓｅｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ
＊ 资助项目：国家高技术研究发展计划（Ｎｏ．２０１３ＡＡ１００６０５－３）
序。合计７８．３４ｂｉｌｉｏｎ高质量的碱基（覆盖深度２３６倍）组装成３３０．７９ＭＢ的桑树基因组。
Ｓｃａｆｆｏｌｄ　Ｎ５０长度为３９０　１１５ｂｐ，重叠群Ｎ５０长度为３４　４７６ｂｐ（表１、附表１和附表２）。组装
完成的基因组中包含１６　２８１ｋｂ（４．９％）的ｇａｐｓ以及３１４　５１０ｋｂ（９５．１％）的无缺口连续序列。
我们从５００ｂｐ插入片段文库中选择了１０．４６Ｇｂ的高质量ｒｅａｄｓ用来计算Ｋ－ｍｅｒ深度（此处选
择１７ｂｐ）的分布。总共得到８　５７７　６７４　３０９的１７－ｍｅｒ，据此估计川桑的基因组为３５７．４ＭＢ（附
方法、附图１和附表３）。６８１个ｓｃａｆｆｏｌｄｓ覆盖了超过８０％的组装序列，其中最长的ｓｃａｆｆｏｌｄ
为３　４７７　３６７ｂｐ，９３．９６％的碱基覆盖深度超过２０ｒｅａｄｓ（附图２），在随机选择的１０　０００个表达
序列标签中，９７％的表达序列标签长度的９０％被一个ｓｃａｆｆｏｌｄ覆盖（附图４）。桑树基因组ＧＣ
含量为３５．０２％，与其他双子叶植物ＧＣ含量类似（附方法和附图３）。
图１　川桑（Ｍ．ｎｏｔａｂｉｌｉｓ）染色体细胞学分析
（ａ）川桑染色体细胞学检测。（ｂ）川桑染色体核型分析。
表１　桑树基因组测序及组装数据统计
组装过程
片段长度
（ｂｐ）
Ｒｅａｄ长
度（ｂｐ）
原始数据量
（ＭＢ）
有效数据量
（ＭＢ）
覆盖度 Ｎ５０＊（ｂｐ） 总计（ｂｐ）
Ｃｏｎｔｉｇ和
ｓｃａｆｆｏｌｄ
１７０－８００　 １００　 ７６　８８４．４０　 ５４　６２５．６０　 １６５．１４　 ５　７１９　 ２８０　７８７　２５７
Ｓｃａｆｆｏｌｄ　 ２　０００－２０　０００　 ４９　 ４９　８０３．５０　 ２３　７１３．７３　 ７１．６９　 ３９４　２２１　 ３３２　１０２　０２５
Ｇａｐ拼接 １７０－８００　 １００　 ７６　８８４．４０　 ５４　６２５．６０ － －
总计 － － １２６　６８７．９０　７８　３３９．３３　 ２３６．８２　 ３９０　１１５　 ３３０　７９１　０８７
　　注：＊Ｎ５０指将拼接的序列按长度从大到小进行相加，当累加的长度达到总长度的一半时，所对应的序列
的大小。
１．２　重复序列
在无缺口的桑树基因组中结合从头预测以及基于Ｒｅｐｂａｓｅ文库同源搜索的方法共得到了
１２７．９８ＭＢ的重复序列（附表５）。由于从头测序技术在处理重复序列方面固有的限制，桑树
基因组中转座元件的含量有可能被低估。在桑树基因组中根据平均覆盖深度、总ｒｅａｄｓ所覆
盖到重复序列（约１２７．７ＭＢ）以及非重复序列区域（约１６６．０ＭＢ），排除未测出的碱基（Ｎ）后，
我们估计在未组装完的序列中约有１８．４８ＭＢ的重复序列。因此，在桑树基因组中存在约有
４７％的重复序列。这个比例与苹果中重复序列的比例（４２％）比较接近，略高于杨树（３５％）。
２ 蚕　学　通　讯 　 　　　　　　　　　　　　　　　３３卷
超过５０％的桑树重复序列可以划分到已知的类别中，如Ｇｙｐｓｙ－ｌｉｋｅ（６．５８％）以及Ｃｏｐｉａ－ｌｉｋｅ
（６．８４％）ＬＴＲ型（长末端重复）转座元件。大约９９．１１％的转座元件有超过１０％的分化度，这
个结果暗示了大多数的桑树转座元件是比较古老的（附图４）。
１．３　基因预测及功能注释
结合５个组织共计２１ＧＢ的转录组数据以及５　８３３个唯一的表达序列标签对基因模型进
行预测及验证，我们在桑树基因组中鉴定到２７　０８５个高置信度、具有完整基因结构的蛋白编
码基因（附方法及附表６）。在这２７　０８５个基因中，从头基因预测支持其中９９．９３％的基因，转
录组测序及表达序列标签支持其中５８．３８％（１５　８１１）的基因，基于同源方法搜索支持其中
６９．９６％（１８　９４３）的基因。这三种方法同时支持的有超过一半（５２．１９％）的基因。包括２　２５３
个通过转录组测序以及表达序列标签注释得到的基因在内，我们共预测到２９　３３８个基因（附
表７）。这些基因的平均ｍＲＮＡ长度为２　８４９ｂｐ，平均编码基因长度为１　１５６ｂｐ，平均有４．６个
外显子（附表８）。在这些基因中，转录组测序支持其中６０．８％的基因，７６．９２％（２２５６６／２９３３８）
的基因在功能数据库中具有同源的靶基因，如 ＮＣＢＩ　Ｎｒ（ＮＣＢＩ非冗余蛋白质数据库），Ｓｗｉｓ－
ｓｐｒｏｔ，ＩｎｔｅｒＰｒｏ，ＫＥＧＧ（京都基因和基因组百科全书）和ＣＯＧ（直系同源基因蔟）等数据库（附
表９）。
基于转录组数据，我们计算了组织特异性指数τ以筛选组织特异性基因和看家基因。我
们发现２４１、２１３、２８５、３６０和４０４个在根、皮、冬芽、雄花和叶中特异表达基因。同时，我们发现
１　８０５个基因在这５个组织当中持续表达，其中包括１１６个编码核糖体蛋白和２６个编码转录
起始因子的基因（附图５）。
１．４　基因组进化
通过比较桑树与蔷薇目（大麻［９］、苹果［１０］和草莓［１１］）基因组序列，可以为了解这一重要种
群ＤＮＡ水平上的差异性提供深刻见解。通过对桑树和１２个已测序的植物（图２）单拷贝基因
的系统发生分析表明桑科与蔷薇科的亲缘关系最近［１２－１３］。这个结果同时表明桑树和大麻两
个物种的分化是在６３．５百万年前，桑树和苹果两个物种的分化是在８８．２百万年前，桑树和苜
蓿的分化则是在１０１．６百万年前［１４］。同义替换分布说明桑树（桑科）与大麻的分化时间比桑
树与蔷薇科中苹果和草莓的分化时间晚（图３）。
我们用几种植物中不同的基因群来构建了３个系统发生树。首先，桑树中的单拷贝基因
以及这些单拷贝基因在其他物种中最佳匹配的基因用来构建系统发生树（图４ａ）。其次，用
ｇｅｎｅｗｉｓｅ预测的单拷贝基因构建系统发生树（图４ｂ）。再次，用不同基因组中共线性位置中的
最佳匹配的序列构建系统发生树。在所有构建的系统发生树中，桑树分支比其他物种的分支
长，这个结果表明桑树比其他蔷薇目物种的进化速度约快３倍。
在没有可用的遗传图谱的情况下，我们使用基于计算机的基因标记及基因组组装方法来
比较桑树与草莓基因组的共线性及进化关系［１５］。桑树和草莓保守共线性区域基因的分布密
度是依据滑动窗口的方法计算并且以热度图的方式进行可视化（图５，附数据集１）。
最初通过对葡萄基因组的分析发现了双子叶植物普遍存在三倍化事件［１６］，这里我们将桑
树ｓｃａｆｆｏｌｄｓ与桑树和葡萄最佳匹配的染色体区域进行比对可以发现另外两个不太明显的同
源区域，这个结果暗示桑树同样经历了双子叶植物常见的三倍化事件。草莓和大麻中也发现
一个主要的和两个次要的与葡萄具有同源性的区域（图６ｂ，ｃ）。草莓中的这个结果与早期报
道草莓中无古多倍化事件的结果相反。基因组内和基因组间共线性区域内同源基因的同义核
３４期　　　　　　　　　　何宁佳等：桑树（川桑Ｍｏｒｕｓ　ｎｏｔａｂｉｌｉｓ）全基因组测序
苷酸替换率分布进一步证明桑树、草莓和大麻经历了泛双子叶植物的六倍化事件（图６ｄ，ｃ）。
图２　１３种植物的系统发生关系分析
分别为：川桑（Ｍ．ｎｏｔａｂｉｌｉｓ），可可（Ｔ．ｃａｃａｏ），拟南芥（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ），毛果杨（Ｐ．ｔｒｉｃｈｏ－
ｃａｒｐａ），番茄（Ｓ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ），葡萄（Ｖ．ｖｉｎｉｆｅｒａ），白梨（Ｐ．ｂｒｅｔｓｃｈｎｅｉｄｅｒｉ），苹果（Ｍ．
ｄｏｍｅｓｔｉｃａ），桃（Ｐ．ｐｅｒｓｉｃａ），草莓（Ｆ．ｖｅｓｃａ），大麻（Ｃ．ｓａｔｉｖａ），苜蓿（Ｍ．ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ）和水
稻（Ｏ．ｓａｔｉｖａ），比例尺代表７５０万年。分支点的数值评价分化的时间，置信区间为９５％。
图３　Ｋｓ分布图
１、２、３、４基因对的Ｋｓ分布，基因对来自川桑－大麻，川桑－草莓，川桑－苹果以及川桑－苜蓿。
４ 蚕　学　通　讯 　 　　　　　　　　　　　　　　　３３卷
图４　川桑与其他植物的系统发生树
（ａ）基于１３６个桑树的单拷贝基因及其同源基因构建的系统发生树。（ｂ）来自１０个植物
的Ｇｅｎｅｗｉｓｅ预测的６２个单拷贝基因构建的系统发生树。（ｃ）利用６种植物基因组中，最
佳匹配的３１８个共线性基因构建的系统发生树。比例尺标注在每个系统发生树的下方，
数字表示每个位点的氨基酸替换速率。
图５　基于草莓基因组，利用电脑模拟了川桑的基因模型
利用一个５００ｋｂ的滑动窗口，计算了川桑染色体上总体基因密度（上）和直向同源基因的相对分布（下）。
５４期　　　　　　　　　　何宁佳等：桑树（川桑Ｍｏｒｕｓ　ｎｏｔａｂｉｌｉｓ）全基因组测序
图６　物种之间的点图和Ｋｓ分布
川桑－葡萄（ａ），草莓－葡萄（ｂ），大麻－葡萄（ｃ），同种植物内的同源基因Ｋｓ分布（ｄ），以及不同植
物之间的共线性同源基因的Ｋｓ分布（ｅ）。基于葡萄的ＣＤＳ序列，利用ＢＬＡＳＴＮ程序检索川桑和
大麻的基因组，获得了匹配的位点。这一ＢＬＡＳＴＮ的结果用于构建点图。根据与葡萄的基因组最
佳匹配的区域比对，未锚定的川桑和大麻的ｓｃａｆｆｏｌｄ连接在一起，构建了川桑和大麻的假定的伪染
色体区域。草莓与葡萄之间的蛋白质序列利用ＢＬＡＳＴＰ程序进行比对以得到假定的同源基因，这
一结果用于制作点图。以基因在染色体上的位置顺序作为作图的坐标。
１．５　分化选择
多种蔷薇目栽培种中不同的形态和植物化学性质可能反映了同源基因的分化选择。通过
对ω（非同义核苷酸替换率（Ｋａ）对同义核苷酸替换率（Ｋｓ）的比值（Ｋａ／Ｋｓ））和 Ｋｓ值的回归分
析，在桑树－大麻、桑树－草莓、桑树－苹果和桑树－苜蓿之间鉴定出３０７、３３８、３５３和１９７个
分化性选择基因对（附数据集２），其ω显著高于平均值。有趣的是，用更加严格的Ｆｉｓｈｅｒ精确
性检验进行分析发现，桑树－大麻的２２２对分化性选择基因（附图６和附表１０）主要集中在老
龄化和压力应答相关方面，这可能与植物间生命期长短不同有关。桑树－草莓，桑树－苹果的
２２８和２５８对分化性选择的同源基因可能与不同的功能相关，例如 Ｍｏｒｕｓ０００７５４（桑树）－
ＭＤＰ００００２５２１６８（苹果）和Ｍｏｒｕｓ００９４８６（桑树）－ＭＤＰ００００２９０３５７（苹果）涉及角皮质的合成
过程，可能与苹果表皮厚度有关（尽管表皮生物合成机制尚不清楚）。在桑树－蔷薇目（苹果，
６ 蚕　学　通　讯 　 　　　　　　　　　　　　　　　３３卷
草莓）中受到分化性选择特别突出的基因对是与质体构成有关的（附数据集３和４），推测核酮
糖二磷酸羟化酶和许多质体基因受到正向的分化选择。
１．６　抗性基因
桑树基因组有１４２个具有核苷酸结合位点（ＮＢＳ）的抗性基因，占桑树所有基因的０．５３％，
与拟南芥（０．５２％）和草莓（０．５８％）中所占比例相当，但是低于杨树（０．８６％）和苹果（１．４９％）
（附数据集５，附表１１）。所有的Ｒ基因分成６个类群：ＴＩＲ－ＮＢＳ－ＬＲＲ、ＣＣ－ＮＢＳ－ＬＲＲ、ＮＢＳ－
ＬＲＲ、ＮＢＳ、ＣＣ－ＮＢＳ以及ＴＩＲ－ＮＢＳ，其中数目最多的类群为ＣＣ－ＮＢＳ－ＬＲＲ，包括４６个基因。
桑树基因组中含有１２７个半胱氨酸蛋白酶（ＣＰ；０．４７％）以及１２９个天冬氨酸蛋白酶（ＡＰ；
０．４８％）的编码基因，与苹果（０．５９％，０．３７％）和草莓（０．４９％，０．５３％）基因组中其所占比例相
当（附数据集６，７和附表１２）。其中很突出的一点是有１３个ＣＰ和４个ＡＰ基因在桑树的乳
汁管中表达（附表１３）。有趣的是，四个ＡＰ基因中的一个（Ｍｏｒｕｓ００８０６７）相对苹果中其同源
基因（ＭＤＰ００００２０１０７６；附数据集２）而言受到分化性选择。
１．７　蛋白酶抑制子基因
为了减轻昆虫的侵袭损害，植物进化出了一种通过表达植物蛋白酶抑制子（ＰＩｓ）干涉昆虫
消化系统的防御机制。在已知的ＰＩ序列和它们的保守结构域的基础上，我们在桑树中鉴定了
７９个ＰＩｓ（附表４）。在桑树基因组中注释出２２个Ｃ１家族的半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因和１９
个Ａ１／Ｃ１家族的丝氨酸蛋白酶抑制剂基因，占被鉴定的蛋白酶抑制剂基因的一半。
１．８　家蚕中鉴定到的桑树ｍｉＲＮＡｓ
家蚕对桑叶季节性生长的适应可能涉及跨界的分子信号。通过桑树基因组与多个植物
ｓｍａｌ　ＲＮＡ数据库的比对，我们预测得到３１１个小核ＲＮＡｓ和２３３个ｍｉＲＮＡｓ（附表１５）。其
中有５个在桑树基因组中存在，但在家蚕基因组中不存在的ｍｉＲＮＡｓ，出现在家蚕幼虫血淋巴
（２），前中部丝腺（２）和后部丝腺（１）（附表１６）。采用另一批家蚕血淋巴对其进行重复测序，验
证了家蚕血淋巴中存在桑树来源的ｍｉＲＮＡｓ。
２　讨　论
早期的研究推测桑树的基础染色体数目是１４１９，尽管之后对两种印度桑的细胞学实验表
明桑树的染色体基数有可能是７［２０］，但是人们一直认为桑树的染色体基数是１４［１９］，并在大量
文章引用该观点。该属植物的多倍性反映在其染色体数目的广泛性上：如川桑（Ｍ．ｎｏｔａｂｉｌｉｓ）
１４条［２１］，印度桑（Ｍ．ｉｎｄｉｃａ）、白桑（Ｍ．ａｌｂａ）２８条，山桑（Ｍ．ｂｏｍｂｙｃｉｓ）４２条，黑桑（Ｍ．
ｎｉｇｒａ）３０８条［２２］。由于多倍体基因组的复杂度高，所以选用１４条染色体的川桑进行全基因组
测序分析。为了证实川桑染色体数目，对处于有丝分裂中期的顶芽细胞进行细胞学分析，确认
了川桑染色体数目为１４条。染色体核型分析表明，川桑的１４条染色体能清晰地组成７对，该
结果支持印度桑关于桑树染色体基数为７的观点［２０］。
系统进化分析法表明桑树与其它蔷薇目的物种聚为一个进化支。桑科按照惯例认为是属
于荨麻目，而荨麻目被认为是与蔷薇目进化关系最近的一个目。然而最近的一个研究认为榆
科、大麻科、桑科和荨麻科属于单一的进化支［２３］，将其命名为ｕｒｔｉｃａｌｅａｎ　ｒｏｓｉｄｓ［２４］。随后被子
植物种系发生群ＩＩＩ将桑科归属为蔷薇目［１３］，本研究也支持这种重新分类的结果。
桑树在核酸水平上进化速度很快，其快速进化的基因可能使桑树不仅对本地环境有很好
的适应性，还能促进其传播到欧洲，非洲和美国。与桑树快速变化的核酸水平相比，蔷薇目的
倍性进化则非常保守。桑树，草莓，大麻，番木瓜和葡萄都经历过最近的泛双子叶植物六倍化
７４期　　　　　　　　　　何宁佳等：桑树（川桑Ｍｏｒｕｓ　ｎｏｔａｂｉｌｉｓ）全基因组测序
事件。桑树的染色体数目高达３０８条（４４×）［２２］，草莓高达７０条，广泛存在的高倍数性揭示了
这些谱系能接受新一轮多倍化带来的益处。
桑树是一种多年生的木本植物，对桑树持续剪伐不仅能采集桑叶养蚕，还能提高桑叶产
量，但是剪伐会增加桑树受到害虫侵扰和病原菌侵染的风险，因此，桑树需要强大的防御系统
抵挡剪伐带来的生物胁迫。Ｒ基因编码的蛋白能识别病原菌的效应子，比如其相应的无病毒
的基因产物［２５］。关于植物Ｒ基因的研究大多数集中在包含ＮＢＳ结构域的Ｒ基因上［２６］。在
桑树基因组中我们共鉴定到１４２个含ＮＢＳ结构域的Ｒ基因。桑树是一种含有乳汁的植物，乳
汁中的蛋白组分，比如几丁质酶样蛋白涉及抵御微生物或植食性昆虫的侵扰［２７－２９］。番木瓜乳
汁管中的半胱氨酸蛋白酶和猪笼草的天门冬氨酸蛋白酶对植食性昆虫均有毒性［３０－３１］。通过
全基因组分析发现桑树有１２７个半胱氨酸蛋白酶编码基因和１２９个天冬氨酸蛋白酶编码基
因，这些基因的功能研究将会扩展我们对桑树防御机制的理解。
植物防御机制能干扰昆虫的消化系统，关于寡食性家蚕是如何绕过桑树的防御机制，这个
问题至今为止仍不清楚。植物蛋白酶抑制剂能降低植食性昆虫中肠消化酶的活性，从而导致
昆虫发育严重畸形，死亡，生殖率降低［３２－３３］。早期研究报道了植物产生的多结构域、多聚体结
构的蛋白酶抑制剂对斜纹夜蛾具有抗营养作用［３４］。昆虫可以通过诱导产生一些对蛋白酶抑
制剂不敏感的蛋白酶以及用体内特殊的蛋白酶降解植物的蛋白酶抑制剂等方法来避开植物蛋
白酶抑制剂的作用［３５－３６］。一种对十字花科有害的著名鳞翅目昆虫—小菜蛾能使芥末的胰蛋
白酶抑制剂２失活，从而打破宿主植物的抵御［３７］。受益于家蚕和桑树的基因组序列，对其转
录组的比较分析能够推进我们对植物－植食性昆虫相互适应关系的理解。
在家蚕三个组织的小ＲＮＡ测序数据中发现五个来源于桑树而非家蚕的 ｍｉＲＮＡ，其中的
ＭＩＲ１５６在水稻营养生长期的老叶中高量表达，该ｍｉＲＮＡ在植物从幼态向成熟态的转变中起
主要作用［３８－４０］。同时我们注意到水稻的 ＭＩＲ１６８ａ能转运到人体内，并调节低密度脂蛋白受
体衔接蛋白１的表达水平［４１］，那么存在家蚕丝腺中的桑树 ＭＩＲ１５６是否向家蚕发出桑叶衰老
的信号，促进家蚕吐丝成茧，亦或是家蚕组织特异存在的其它桑树 ｍｉＲＮＡ在家蚕的发育中是
否起作用，这些问题至今仍不清楚。
综上所诉，基因组信息对现代桑树遗传研究是十分重要的资源。桑树基因组的特点，如基
因家族，片段重复，共线性区域等不仅丰富了植物比较基因组可用的数据，并且促进了与桑科
密切相关物种靶基因的鉴定。基于基因组序列发展的遗传标记可以用于构建遗传图谱，定位
克隆，品系鉴定以及标记辅助的筛选。这些分子工具和基因组技术的应用将会有效促进农业
的发展。桑树和家蚕作为植物－植食性动物相互作用的模式系统，二者的基因组序列对于更
深层次解析普遍存在大多数陆生环境中的生物学合伙关系提供了一个独一无二的机会。
３　研究方法
３．１　川桑核型分析
川桑嫩叶用２ｍＭ　８－羟基喹啉在室温下处理３ｈ，之后用３：１的甲醇：冰醋酸在４℃固定
２ｈ。固定好的叶片用１／１５ＭＫＣｌ溶液处理３０ｍｉｎ，随后用２．５％（Ｗ／Ｖ）的纤维素酶和２．５％
（Ｗ／Ｖ）的果胶酶（ＹａＫｕｌｔ　Ｃｏ．，日本）在３７℃消化１．５ｈ。消化后的叶片用ｄｄＨ２Ｏ 处理
１０ｍｉｎ，之后再用３：１的甲醇：冰醋酸在室温下固定３０ｍｉｎ。再固定的叶片打碎后滴两滴悬浮
液在载玻片上，室温下用吉姆萨染液染色６小时，随后在显微镜下进行观察（Ｏｌｙｍｐｕｓ，日本）。
８ 蚕　学　通　讯 　 　　　　　　　　　　　　　　　３３卷
３．２　ＤＮＡ和ＲＮＡ制备
测序用桑树品种为野生桑种川桑，其含有１４条染色体。川桑冬芽的基因组 ＤＮＡ 用
ＣＴＡＢ法进行提取并用于测序文库的构建。五个组织（根、一年生皮、冬芽、雄花和叶）的总
ＲＮＡ参照 Ｗａｎ和 Ｗｉｌｈｉｎｓ等的方法进行提取［４２］，并用不含ＲＮＡ酶的ＤＮＡ酶Ⅰ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇ－
ｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂｓ）在３７℃下消化３０ｍｉｎ以去除剩余的ＤＮＡ。用含有ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）的珠子分离含有
ｐｏｌｙ（Ａ）的ｍＲＮＡ。用随机的六聚引物和反转录酶（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）合成ｃＤＮＡ第一链。用ＤＮＡ
聚合酶（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂｓ）和ＲＮＡ酶 Ｈ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）合成ｃＤＮＡ第二链。
３．３　基因组测序
桑树基因组测序使用全基因组鸟枪法。测序文库根据制造商（Ｉｌｕｍｉｎａ，圣地亚哥，加拿
大）的说明进行制备。对于短插入片段的ＤＮＡ文库，将５μｇ基因组ＤＮＡ用压缩氮气喷雾法
进行片段化处理。片段化的ＤＮＡ末端用碱基Ａ进行钝化处理，然后将３’末端含有一个碱基
Ｔ的ＤＮＡ接头（Ｉｌｕｍｉｎａ）与ＤＮＡ片段进行连接。之后用２％琼脂糖凝胶将连接产物进行分
离，通过切胶纯化各个插入大小的ＤＮＡ片段。对于长的 ｍａｔｅ－ｐａｉｒｅｄ文库（大于等于２Ｋｂ），
将１０～３０μｇ基因组ＤＮＡ用压缩氮气喷雾法进行片段化处理，然后用生物素标记的ｄＮＴＰｓ
对片段进行处理，通过凝胶选择２Ｋｂ，５Ｋｂ和１０Ｋｂ的主要条带。之后ＤＮＡ片段通过自连而
环化。将ＤＮＡ片段的两端进行结合并用核酸外切酶对线性ＤＮＡ片段进行消化。消化之后
环化的ＤＮＡ片段重新进行片段化，随后利用生物素与抗生蛋白链菌素的相互作用，用磁珠富
集含有之前结合的末端的ＤＮＡ，之后将这些末端进行钝化并加上含有碱基 Ａ的接头。我们
根据制造商的说明进行了如下的ｐａｉｒｅｄ－ｅｎｄ（ＰＥ）测序流程：成蔟、模板杂交、等温扩增、线性
化、封闭以及测序引物的变性和杂交。测序完成后用ｂａｓｅ－ｃａｌｉｎｇ程序（ＳｏｌｅｘａＰｉｐｅｌｉｎｇ－０．３）
从最初的荧光图像中获得序列。
３．４　基因组组装
在进行从头组装之前，我们通过以下五个步骤对低质量的数据进行过滤：（１）根据
Ｈｉｓｅｑ２０００的测序质量报告去除５’和３’末端的低质量的碱基；（２）去除含有Ｎ大于１０％的序
列；（３）去除低质量碱基（Ｑ＜８）大于５０％的序列；（４）去除被接头污染的序列；（５）去除在文库
构建过程中因ＰＣＲ引起的重复的序列。ＳＯＡＰｄｅｎｏｖｏ是由深圳华大基因研发的一种基因组
组装软件，该软件采用基于图论的算法和分步组装的策略［４３］。我们首先用４９－ｋｍｅｒｓ对小插
入片段的文库（＜１ｋｂ）进行组装。然后我们用４１－ｋｍｅｒｓ将所有过滤得到的序列重新比对到组
装好的重叠群上并且将比对上的序列编译为可用的重叠群。根据ｐａｉｒｅｄ－ｅｎｄ信息，我们共采
用了七步，从１７０ｂｐ的插入文库到２０ｋｂ的插入文库，将重叠群组装成ｓｃａｆｆｏｌｄ。为了填补
ｓｃａｆｆｏｌｄ中的空隙，我们收集了ｐａｉｒｅｄ－ｅｎｄ的序列，如果其中一端比对到一个重叠群上而另一
端位于空隙中，则重复进行一次局部的组装。
３．５　转座元件（ＴＥ）和重复序列
为了预测桑树基因组中的ＴＥ，我们首先用ＲｅｐｅａｔＭｏｄｅｌｅｒ（ｖｅｒｓｉｏｎ　１．０．３，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．
ｒｅｐｅａｔｍａｓｋｅｒ．ｏｒｇ／ＲｅｐｅａｔＭｏｄｅｌｅｒ．ｈｔｍｌ），ＲｅｐｅａｔＳｃｏｕｔ［４４］（ｖｅｒｓｉｏｎ　１．０．５，ｈｔｔｐ：／／ｂｉｘ．ｕｃｓｄ．
ｅｄｕ／ｒｅｐｅａｔｓｃｏｕｔ／）和Ｐｉｌｅｒ［４５］（ｖｅｒｓｉｏｎ　１．０，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｒｉｖｅ５．ｃｏｍ／ｐｉｌｅｒ／）构建了一个ＴＥ
库，之后用ＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒ［４６］（ｖｅｒｓｉｏｎ　３．２．９，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｅｐｅａｔｍａｓｋｅｒ．ｏｒｇ／）对桑树基因组
中的ＴＥ进行了一个从头预测。我们同时也使用ＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒ和ＰｒｏｔｅｉｎＭａｓｋ（ｖｅｒｓｉｏｎ　３．０）
对已知类型的ＴＥ进行了预测，在预测过程中我们使用的ＴＥ库包括Ｒｅｐｂａｓｅ［４７］（ｖｅｒｓｉｏｎ　１５．
０２，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｉｒｉｎｓｔ．ｏｒｇ／ｒｅｐｂａｓｅ／）和ＴＩＧＲ中的双子叶植物ＴＥ库［４８］（ｖｅｒｓｉｏｎ　３．０，ｈｔ－
９４期　　　　　　　　　　何宁佳等：桑树（川桑Ｍｏｒｕｓ　ｎｏｔａｂｉｌｉｓ）全基因组测序
ｔｐ：／／ｐｌａｎｔｔａ．ｊｃｖｉ．ｏｒｇ）。串联重复序列使用Ｔａｎｄｅｍ　Ｒｅｐｅａｔｓ　Ｆｉｎｄｅｒ（ＴＲＦ，ｖｅｒｓｉｏｎ　４．０４，ｈｔ－
ｔｐ：／／ｔａｎｄｅｍ．ｂｕ．ｅｄｕ／ｔｒｆ／ｔｒｆ．ｈｔｍｌ）来进行预测。简单重复序列、微卫星序列和低复杂度重复
序列使用ＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒ进行预测（使用“－ｎｏｉｎｔ”选项）［４９］。将桑树基因组中已进行分类的ＴＥ
家族与Ｒｅｐｂａｓｅ（ｖ１５．０２）中的共有序列进行比对以确定这些ＴＥ的序列分化度。
３．６　基因预测和注释
桑树基因预测共使用了三种方法：基于同源性比较的方法、从头预测方法和基于表达序列
标签（ＥＳＴ）／转录组数据的方法。其中高置信度的基因是用前两种方法预测得到。为了注释
桑树中的蛋白编码基因，我们将其２７０８５个高置信度基因的核苷酸序列与 ＮＣＢＩ、ＫＥＧＧ、
ＣＯＧ和Ｓｗｉｓｓｐｏｒｔ等数据库进行比对，比对的阈值设为１ｅ－５。蛋白质结构域和功能预测在
Ｉｐｒｓｃａｎ（ｖ４．４．１）上进行注释。
３．７　ＲＮＡ和ＥＳＴ测序
ｃＤＮＡ文库的制备和测序参照Ｉｌｕｍｉｎａ的操作流程。用ＴｏｐＨａｔ（ｖ１．３．３）将ＲＮＡ测序
得到的序列与桑树基因组进行比对。通过计算每百万条ｒｅａｄｓ中覆盖到每ｋｂ上的ｒｅａｄｓ数来
衡量五个组织中的基因表达水平，并且通过计算组织特异性的指数τ来鉴定组织特异性表达
的基因。对于ＥＳＴ测序，将相同的五个组织的ＲＮＡ混合并用Ｃｒｅａｔｏｒ　ＳＭＡＲＴ　ｃＤＮＡ　Ｋｉｔ
（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）进行ｃＤＮＡ的合成。用 Ｔｒｉｍｍｅｒ－Ｄｉｒｅｃｔｏｒ　ｋｉｔ（Ｅｖｒｏｇｅｎ）构建标准化的ｃＤＮＡ文
库。从该文库中随机挑选１０　０００个克隆用ＡＢＩ３７３０（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）进行测序。
３．８　非编码ＲＮＡ基因
桑树基因组中的ｔＲＮＡ使用ｔＲＮＡｓｃａｎ－ＳＥ（ｖ１．２３）软件进行预测（使用“ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ”选
项）［５０］。用ＢＬＡＳＴＮ将桑树基因组与植物ｒＲＮＡ序列进行比对（阈值为１ｅ－５），序列一致性大
于８５％并且高分值片段对的长度大于５０ｂｐ的结果认为是桑树的ｒＲＮＡ。对于ｍｉｃｒｏＲＮＡ和
ｓｎＲＮＡ，首先用ＢＬＡＳＴＮ将桑树基因组与Ｒｆａｍ数据库（ｖ９．１）进行比对（阈值为１），比对结
果进一步用ＩＮＦＥＲＮＡＬ软件进行分析，该软件根据ＲＮＡ的结构和序列相似性对ｍｉｃｒｏＲＮＡ
和ｓｎＲＮＡ进行预测。
３．９　模拟基因染色
我们通过ＢＬＡＳＴＰ比对（阈值为１ｅ－５）鉴定桑树和草莓之间的直系同源基因对，得到的结
果进一步用 Ｍｃｓｃａｎ分析以鉴定两个物种间的共线性区域。通过使用Ｇｅｎｏｍｅ　Ｚｉｐｐｅｒ软件，
根据草莓的连锁群，将桑树中与之对用的共线性区域的ｓｃａｆｆｏｌｄ进行连接。计算每５００ｋｂ滑
动窗口内的基因密度和对应的直系同源基因的密度并将结果分布做热度图。
３．１０　在家蚕的组织中鉴定桑树的ｍｉＲＮＡｓ
用ｍｉｒＶａｎａ　ＰＡＲＩＳ　ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ，美国）从１２ｍｌ的家蚕血淋巴（取自五龄５天幼虫）中提取
小ＲＮＡ。提取的小ＲＮＡ测序参照Ｌｉｕ等人的操作流程进行［５１］。前中部和后部丝腺的小
ＲＮＡ数据从ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｄｓ？ｔｅｒｍ＝ＧＳＥ１７９６５上下载。这三个家蚕
组织的小ＲＮＡ序列通过ＢＬＡＳＴＮ与桑树预测的 ｍｉＲＮＡｓ进行比对（完全匹配）以鉴定家蚕
组织中存在的桑树来源的ｍｉＲＮＡｓ。
３．１１　系统发生树的构建和物种形成时间的确定
基于最大似然法，我们利用１３个植物物种的单拷贝基因构建了系统发生树。通过
ＢＬＡＳＴ比对（阈值为１ｅ－１０）确定物种间的直系同源基因对，它们之间的同义替换率（Ｋｓ）［５２］使
用ＰＡＭＬ软件包中的ｙｎ００程序进行计算［５３］。基于 Ｋｓ值的物种形成时间根据以下公式计
算：Ｔ＝ Ｋｓ／２λ（其中λ＝６．１×１０－９）［５４］。根据非同义替换率（Ｋａ）和 Ｋｓ之间的回归分析
０１ 蚕　学　通　讯 　 　　　　　　　　　　　　　　　３３卷
（９５％预测区间范围）［５５］推测桑树和其他四种植物间可能受到正选择的直系同源基因对。ω
值大于预测区间上限的基因对认为是受到正选择的。用ＢＬＡＳＴ２ＧＯ［５６］对具有高ω值的基因
对的基因本体论类群进行预测，其结果用Ｆｉｓｈｅｒ精确性检验进行验证（Ｐ值＜０．０５）。
３．１２　推测基因共线性
我们用 ＭＣＳＣＡＮ５７（一种多染色体比对工具）和ＣＯＬＩＮＥＡＲＳＣＡＮ５８（一种成对染色体比
对工具）相结合来推测共线性基因，这些共线性基因用于系统发生和进化分析。
３．１３　推测进化事件的时间
我们利用物种间的共线性基因和物种内高度可信的同源基因来推测进化事件。例如，桑
树ｓｃａｆｆｏｌｄ之间的共线性基因可能来源于祖先的多倍化事件（如果存在的话），而桑树和葡萄
之间的共线性基因可能来源于两个物种的分化。Ｋｓ使用ＰＡＭＬ［５３］中的 Ｎｅｉ－Ｇｏｊｏｂｏｒｉ方
法［５２］计算。通过描绘Ｋｓ值的分布来推测进化事件的相对时间。
３．１４　同源基因点图
在这一部分分析中我们使用之前介绍的预测基因集和 Ｇｅｎｅｗｉｓｅ［５９］预测的一个基因集。
葡萄、苹果、草莓和大麻的基因组序列和注释下载自在线数据库，所有的数据使用２０１２年１０
月之前的最新版本。在比较有可用的拟染色体的基因组时，我们用ＢＬＡＳＴＰ进行蛋白－蛋白
之间的比对，从而找到可能的同源基因，得到的结果用于作点图；作图过程中以基因在染色体
上的顺序为坐标。当比较没有可用的拟染色体的基因组时（例如桑树和大麻），我们选择一个
有可用的拟染色体物种（例如葡萄）的编码基因序列，用ＢＬＡＳＴＮ与桑树和大麻的基因组进
行比对，比对的结果用于作点图。为了推测基因组重复事件，没有锚定的ｓｃａｆｆｏｌｄ根据它们在
葡萄基因组上的最好匹配区域连接成假定的拟染色体，桑树和大麻假定的拟染色体就是用这
种方法构建。在点图中，相应的葡萄的基因区域将对应两个匹配的区域。
３．１５　本研究中所使用的数据
本研究中所使用的基因组数据从以下网址中下载，并列出了其在ＮＣＢＩ上的登录号。拟
南 芥 （ＴＡＩＲ９）：ｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．ｏｒｇ／Ｇｅｎｅｓ／ＴＡＩＲ９＿ｇｅｎｏｍｅ＿ｒｅｌｅａｓｅ／，ＧＣＡ ＿
０００００１７３５．１。大麻：ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｃｃｂｒ．ｕｔｏｒｏｎｔｏ．ｃａ／ｄｏｗｎｌｏａｄｓ．ｈｔｍｌ，ＧＣＡ＿０００２３０５７５．
１。番木瓜（ｖｅｒｓｉｏｎ　１ｔｈ）：ｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｊｇｉ－ｐｓｆ．ｏｒｇ／ｐｕｂ／ｃｏｍｐｇｅｎ／ｐｈｙｔｏｚｏｍｅ／ｖ５．０／Ｃｐａｐａｙａ／，
ＧＣＡ＿０００１５０５３５．１。黄瓜（ｖｅｒｓｉｏｎ　１ｔｈ）：ｈｔｔｐ：／／ｃｕｃｕｍｂｅｒ．ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ．ｃｎ／ｐａｇｅ／ｃｕｃｕｍ－
ｂｅｒ／ｄｏｗｎｌｏａｄ．ｊｓｐ，ＧＣＡ＿０００００４０７５．１。草莓（ｖｅｒｓｉｏｎ　１．１）：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｏｓａｃｅａｅ．ｏｒｇ／ｓｐｅ－
ｃｉｅｓ／ｆｒａｇａｒｉａ／ｆｒａｇａｒｉａ＿ｖｅｓｃａ／ｇｅｎｏｍｅ＿ｖ１．１，ＧＣＡ＿０００１８４１５５．１。大豆（ｖｅｒｓｉｏｎ　１．０）：ｆｔｐ：／／
ｆｔｐ．ｊｇｉ－ｐｓｆ．ｏｒｇ／ｐｕｂ／ｃｏｍｐｇｅｎ／ｐｈｙｔｏｚｏｍｅ／ｖ５．０／Ｇｍａｘ／，ＧＣＡ＿０００００４５１５．１。苹果（ｖｅｒｓｉｏｎ
１．０）：ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｒｅｓｅａｒｃｈ．ｉａｓｍａ．ｉｔ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ，ＧＣＡ＿０００１４８７６５．２。苜蓿：ｆｔｐ：／／ｆｔｐ．
ｊｇｉ－ｐｓｆ．ｏｒｇ／ｐｕｂ／ｃｏｍｐｇｅｎ／ｐｈｙｔｏｚｏｍｅ／ｖ８．０／Ｍｔｒｕｎｃａｔｕｌａ／，ＧＣＡ＿０００２１９４９５．１。杨树（ｖｅｒ－
ｓｉｏｎ　５．０）：ｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｊｇｉ－ｐｓｆ．ｏｒｇ／ｐｕｂ／ｃｏｍｐｇｅｎ／ｐｈｙｔｏｚｏｍｅ／ｖ５．０／Ｐｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ／，ＧＣＡ＿
０００００２７７５．１。桃：ｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｊｇｉ－ｐｓｆ．ｏｒｇ／ｐｕｂ／ｃｏｍｐｇｅｎ／ｐｈｙｔｏｚｏｍｅ／ｖ８．０／Ｐｐｅｒｓｉｃａ／，ＧＣＡ＿
０００３４６４６５．１。白梨：ｈｔｔｐ：／／ｐｅａｒｇｅｎｏｍｅ．ｎｊａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ：８００４／ｄｅｆａｕｌｔ．ａｓｐ？ｄ＝１＆ｍ＝１，ＧＣＡ
＿０００３１５２９５．１。可可（ｖｅｒｓｉｏｎ　１．０）：ｈｔｔｐ：／／ｃｏｃｏａｇｅｎｄｂ．ｃｉｒａｄ．ｆｒ／ｇｂｒｏｗｓｅ／ｄｏｗｎｌｏａｄ．ｈｔｍｌ，
ＧＣＡ＿０００４０３５３５．１。葡萄：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｓｃｏｐｅ．ｃｎｓ．ｆｒ／ｅｘｔｅｒｎｅ／Ｄｏｗｎｌｏａｄ／Ｐｒｏｊｅｔｓ／Ｐｒｏ－
ｊｅｔ＿ＭＬ／ｄａｔａ／１２Ｘ／，ＧＣＡ＿０００００３７４５．２。
论文 链 接：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎａｔｕｒｅ．ｃｏｍ／ｎｃｏｍｍｓ／２０１３／１３０９１９／ｎｃｏｍｍｓ３４４５／ｆｕｌ／ｎｃｏｍ－
ｍｓ３４４５．ｈｔｍｌ．
１１４期　　　　　　　　　　何宁佳等：桑树（川桑Ｍｏｒｕｓ　ｎｏｔａｂｉｌｉｓ）全基因组测序