全 文 ：广 西 植 物 Guihaia　Jul．２０１４,３４(４):５４８－５５１　　　　　　　　　　 http://journal．gxzw．gxib．cn　
DOI:１０．３９６９/j．issn．１０００Ｇ３１４２．２０１４．０４．０２３
傅翠娜,肖远辉,甘海峰,等．倍性分析和AFLP标记相结合鉴定金柑新种质[J]．广西植物,２０１４,３４(４):５４８－５５１
FuCN,XiaoYH,GanHF,etal．IdentificationofKumquats(Fortunellacrassifolia)newvarietiesbyploidyanalysisandAFLP[J]．Guihaia,２０１４,３４
(４):
５４８－５５１
倍性分析和AFLP标记相结合鉴定金柑新种质
傅翠娜,肖远辉,甘海峰∗,雷新南
(广西特色 作物研究院,广西 桂林５４１００４)
摘　要:采用倍性分析和AFLP标记相结合,对滑皮金桔和变异单株金柑Ⅱ进行遗传鉴定分析.结果表明:
滑皮金桔是２倍体,金柑Ⅱ是４倍体;选用１２对AFLP引物组合,就８份金柑资源进行遗传多样性分析及分
类研究,共获得清晰可见的标记３４１,其中多态性标记９５,占２７．８％,供试材料相似系数在０．８６７~０．９８５之间,
能将８个品种区分开,滑皮金桔与普通金柑相似性系数为９６．８％,金柑Ⅱ与普通金柑相似性系数为９５．８％,滑
皮金桔与金柑Ⅱ相似性系数为９５．７％.表明滑皮金桔和金柑Ⅱ是不同于普通金柑的变异新种质,可以直接作
为品种资源加以利用.
关键词:金柑;新种质;倍性分析;遗传鉴定;AFLP
中图分类号:S６６６．９　　文献标识码:A　　文章编号:１０００Ｇ３１４２(２０１４)０４Ｇ０５４８Ｇ０４
IdentificationofKumquats(Fortunelacrassifolia)
newvarietiesbyploidyanalysisandAFLP
FUCuiＧNa,XIAOYuanＧHui,GANHaiＧFeng∗,LEIXinＧNan
(GuangxiAcademyofSepcialtyCrops,Guilin５４１００４,China)
Abstract:TodeterminethegeneticdiversityofKumquatsnewvarieties．Weemployedploidyanalysisand１２pairsof
AFLPprimercombinationson８Kumquatsvarieties．PloidyanalysisconfirmedthatHuapijinganwasadiploid,Jingan
Ⅱwasatetraploid．AFLPresultsshowedthat:Atotalof３４１majorAFLPbandswereobserved,and９５bandwere
polymorphism．Geneticsimilaritiesamongaltaxarangedfrom０．８６７to０．９８５．８varietiescouldbedivided．Phenetic
treesbasedongeneticsimilarities(UPGMA,NＧJ)weresimilartoknowntaxonomicrelationships．thegeneticsimilarＧ
itycoeficientbetweenHuapijinganandJinganwas９６．８％,thegeneticsimilaritycoeficientbetweenJinganⅡandJinＧ
ganwas９５．８％,thegeneticsimilaritycoefficientbetweenJinganⅡandHuapijinganwas９５．７％．JinganⅡandHuapiＧ
jingancouldbeusedasnewcultivar．
Keywords:Kumquats;newvarieties;ploidyanalysis;geneticidentification;AFLP
　　金柑果实芳香四溢,营养丰富,品质优良,风味
好.食之有顺气润肺、化痰止咳、促进消化、强壮身
体之功效.对治疗支气管炎和哮喘病有良好效果,
深受消费者欢迎.广西是我国金柑主产区之一,栽
培面积接近３０万亩,在主产区金柑已成为农民发家
致富的主导产业.人们在生产过程中发现不少优良
变异金柑单株,由于变异后代与亲本在遗传物质构
成上差异微小,传统的形态学方法很难进行区分.
Zabeauetal．(１９９３)年创立了 AFLP(Amplified
fragmentlengthpolymorphism)技术,AFLP结合
收稿日期:２０１４Ｇ０１Ｇ０９　　修回日期:２０１４Ｇ０３Ｇ１９
基金项目:广西自然科学基金(桂科自０９９１１８６);广西科技攻关项目(桂科攻１１２３００３Ｇ３D).
作者简介:傅翠娜(１９７９Ｇ),女,山东莱州人,硕士,助理研究员,主要从事柑桔栽培、育种方面的研究,(EＧmail)fucuina９９＠１６３．com.
∗通讯作者:甘海峰,研究员,主要从事柑桔栽培技术研究工作,(EＧmail)ganhf６９１９＠１２６．com.
了RFLP和RAPD各自的优点,方便快速,只需极
少量DNA材料,不需Southen杂交,能检测整个基
因组的遗传变异,在后代的遗传和分离中遵循孟德
尔定律.被广泛应用于果树遗传多样性研究和品系
鉴定,如粉蕉、大蕉和龙牙蕉(易干军等,２００２)、龙眼
品种(系)(易干军等,２００２,２００３;彭宏祥等,２００８)、
荔枝(易干军等,２００３)、猕猴桃(陈华等,２００７)、沙田
柚(肖远辉等,２０１２).本研究在相关研究的基础上,
拟采用倍性分析和AFLP相结合,对滑皮金桔和变
异单株金柑Ⅱ进行遗传鉴定分析,为金柑新资源的
合理利用、品种的选育提供理论依据.
１　材料与方法
１．１材料
试验用品种材料为罗浮(FortunellamargariＧ
ta)、罗纹(F．japonica)、长寿金柑(F．obovata)、大
果金豆、金豆(F．hindsii),采自中国柑桔研究所以
及金弹(F．crassifolia)、滑皮金桔、金柑Ⅱ采自广
西柑桔研究所.
１．２研究方法
１．２．１倍性分析　倍性检测采用细胞流式仪(型号
PAＧI,Partec公司,德国)参照张俊娥等(２００３)的方
法.分析“滑皮金桔”和“金柑Ⅱ”的叶片,以二倍体
普通金柑叶片作对照.取约０．５cm２的幼嫩叶片于
小塑料皿里,加入４００μLHRＧA核裂解液(Partec
HighResolutionStainingKit);用刀片切碎叶片放
置３０s,通过２０~５０μm 的微孔滤膜将样品过滤到
小试管里;加入１．６mLHRＧBDAPI染色液(Partec
HighResolutionStainingKit),染色３０~６０s;上样
检测.Partec倍性分析仪测定样品中单个细胞核的
DNA总量.DNA含量的分布曲线由仪器自动生成.
１．２．２AFLP分子标记　DNA提取参照母洪娜等
(２００７)改进的CTAB法进行;DNA酶切及人工接
头的连接:双酶切目的DNA,选用PstI/MseI这两
种酶,再用T４DNA连接酶,酶切和连接在一步完
成.在０．５mL离心管中加入混合液按DNA模板４
μL,Adapter１μL,EcoRI/MseI(４U/μL)２μL,１０
×Reactionbuffer２．５μL,１０mmol/LATP２．５μL,
T４Ligase(４U/μL)１μL,AFLPＧWater７μL.混匀
离心数秒,３７℃保温５h,８℃保温４h,４℃过夜;在
０．５mL离心管中加入预扩增的混合液按模板DNA
２μL,PreＧampmix１μL,dNTPs０．５μL,１０×PCR
buffer２．５μL,TaqDNApolymease(２U/μL)０．５
μL,AFLPＧWater１８．５μL.混匀,按下列参数进行
PCR扩增循环３０轮:９４℃２min,９４℃３０s,５６℃
３０s,７２℃８０s,７２℃５min;在０．５mL离心管中,
加入预扩增稀释样品２μL,dNTPs０．５μL,１０×
PCRbuffer２．５μL,EcoRI引物１μL,MseI引物１
μL,TaqDNApolymease(２ U/μL)１μL,AFLPＧ
Water１７μL.以上混匀,离心数秒,按下列参数
PCR循环:首先９４℃２min①一轮扩增参数:９４℃
３０s,６５℃３０s,７２℃８０s;② 以后每轮循环退火温
度递减０．７℃或１℃,扩增１２或１０轮(递减０．７℃,
则扩增１２轮,递减１℃,则扩增１０轮);③接着按下
列参数扩增２３轮:９４℃３０s,５５℃３０s,７２℃８０
s;最后延伸７２℃５min.电泳检测荧光照相获得
指纹图谱,以NTSYSＧpc２．１０e数据分析软件进行,
采用Dice相似系数进行计算,得到Dice相似系数
矩 阵. 采 用 UPGMA (Unweighted pairＧgroup
method,arithmeticaverage非加权平均法)进行聚
类,用图表算法(Graphics)中的树状绘图(Tree
plot)得到金柑亲缘关系树状图.
２　结果与分析
２．１倍性分析结果
流式细胞仪分析普通金柑、“滑皮金桔”和变异单
株叶片的倍性,结果表明普通金柑和“滑皮金桔”(图
１)是二倍体,变异单株“金柑Ⅱ”(图２)为４倍体.
图１　滑皮金柑的倍性分析
Fig．１　PloidyanalysisofHuapijingan
　　利用从６４对AFLP引物中筛选出的１２对扩增
产物多态性好、谱带清晰的引物,对８份金柑材料的
基因组DNA进行扩增片段长度多态性分析,获得
９４５４期　　　　　　　　 傅翠娜等:倍性分析和AFLP标记相结合鉴定金柑新种质
图２　金柑Ⅱ的倍性分析
Fig．２　PloidyanalysisofJinganⅡ
图３　３对引物组合对金柑的AFLP扩增图谱
Fig．３　KumquatsAFLPfingerprintingmapby３primers
了较好的扩增结果(图３).１２对引物组合在８个材
料中扩增出３４１条清晰的带,引物扩增条带数２１~
４４条(表２),平均每对引物扩增２８．４２条,其中多态
性带共有９５条,多态性比例为２７．９％,１２对引物能
将８个金柑材料区分出来.从聚类图可以看出滑皮
金桔(J５)、金柑Ⅱ(J６)与普通金柑(J４)亲缘关系最
近(图４).滑皮金柑与普通金柑相似性系数为
９６．８％,金柑Ⅱ与普通金柑相似性系数为９５．８％,滑
皮金桔与金柑Ⅱ相似性系数为９５．７％(表３).
表２　１２对AFLP引物选择性扩增结果及条带多态性
Table２　PolymorphismofAFLPbands
onthe１２selectedprimers
引物组合
Primer
总扩增带数
Totalband
number
多态性带数
Polymorphic
bandnumber
多态性带
百分率 (％)
Polymorphic
bandpercentage
EＧAAC/MＧCAC ２４ ９ ３７．５
EＧAAC/MＧCAG ２５ ７ ２８．０
EＧAAG/MＧCAA ４４ １３ ２９．５
EＧAAG/MＧCAT ２２ ８ ３６．４
EＧAAG/MＧCTA ２６ １０ ３８．５
EＧAAG/MＧCTT ２２ ８ ３６．４
EＧACA/MＧCTG ２１ ７ ３３．３
EＧACT/MＧCTG ３１ ９ ２９．０
EＧACT/MＧCTT ３８ ８ ２１．１
EＧAGC/MＧCAA ２８ ５ １７．９
EＧAGC/MＧCTA ３６ ６ １６．７
EＧAGC/MＧCTC ２４ ５ ２０．８
总计/平均 ３４１ ９５ ２７．９
表３　供试材料Dice相似系数
Table３　Dicesimilaritycoeficientsamong
Kumquatsmaterials
J１ J２ J３ J４ J５ J６ J７ J８
J１ １．０００
J２ ０．９６１ １．０００
J３ ０．８９７ ０．９０５ １．０００
J４ ０．９２６ ０．９３５ ０．９１０ １．０００
J５ ０．９３２ ０．９３７ ０．９０６ ０．９６８ １．０００
J６ ０．９０２ ０．９１１ ０．８８４ ０．９５８ ０．９５７ １．０００
J７ ０．８６７ ０．８７９ ０．８７４ ０．８８８ ０．８８３ ０．８７５ １．０００
J８ ０．８７３ ０．８８５ ０．８７３ ０．８９４ ０．８８６ ０．８７７ ０．９８５ １．０００
图４　金柑种质AFLP分析聚类图
Fig．４　DendrogramofKumquatsvarieties
basedonAFLPdata
３　讨论与结论
体细胞变异(芽变)规律是果实等多年生作物重
要的科学问题.芽变是体细胞突变的表现,体细胞
０５５ 广　西　植　物　　　 　　　　　　　　　　　　　　３４卷
发生遗传变异的可能来源是点突变、体细胞重组、
DNA 甲基化或转座子活性高低等(刘庆,２００８;
Asinsetal．,１９９９;Bernetetal．,２００３).根据遗传
物质基础改变的来源不同,可以将芽变分为染色体
畸变和基因突变.染色体畸变又可以分为染色体结
构改变和数目改变两种.张俊娥等(２００３)使用倍性
分析仪对４８种培养多年不同基因型的柑桔愈伤组
织进行测定,发现９３．８％的组织出现了DNA含量
加倍的细胞.本研究应用倍性分析仪发现一染色体
加倍金柑单株,证明了柑桔染色体数目的改变不仅
在愈伤组织中发生,在自然条件下同样存在.
利用AFLP分子标记技术检测柑桔芽变品种,
是芽变分子分析的一条有效途径.罗才安等(２００３)
利用 AFLP分析了奉节脐橙的低酸和晚熟芽变株
系基因组 DNA 的遗传差异.本研究结果显示
AFLP技术能有效的区分８个金柑资源.
本研究采用倍性分析和AFLP相结合,对滑皮
金桔和变异单株金柑Ⅱ进行遗传鉴定分析.结果表
明:滑皮金桔是２倍体,金柑Ⅱ是４倍体;滑皮金桔
与普通金柑相似性系数为９６．８％,金柑Ⅱ与普通金
柑相似性系数为９５．８％,滑皮金桔与金柑Ⅱ相似性
系数为９５．７％,表明滑皮金桔和金柑Ⅱ是不同于普
通金柑的变异新种质,可以直接作为品种资源加以
利用.金柑Ⅱ为４倍体,其不但品质优良,还是一个
关键的无核金柑育种材料,３倍体无核金柑育种尚
待进一步试验研究.
参考文献:
AsinsMJ,MonforteAJ,MestrePF,etal．１９９９．CitrusandPrunus
copiaＧlikeretrotransposons[J]．TheorApplGenet,９９(３－４):
５０３－５１０
BernetGP,AsinsMJ．２００３．Identificationandgenomicdistribution
ofgypsylikeretrotransposonsinCitrusandPoncirus[J]．Theor
ApplGenet,１０８(１):１２１－１３０
ChenH,YiGJ,XuXB,etal．２００７．IdentificationoftheKiwifruit
GermplasmsinJiangxiProvincebyAFLPandItsClassification
Significance[J]．ChinaJBiochem& MolBiol(中国生物化学
与分子生物学报),２３(２):１２２－１２９
LiuQ(刘庆)．２００８．Molecularmechanismforthealteredtraitsof
theredfleshbudsportof‘Anliu’sweetorange(“暗柳”甜橙红
色突变体性状形成的分子机理研究)[D]．Wuhan(武汉):
HuazhongAgriculturalUniversity(华中农业大学),１－１５１
LuoAC(罗安才)．２００３．ResearchesontheorganicacidsmetaboＧ
lismincitrusfruitsandtheAFLPanalysisoftheFengjienavel
orangemutants(柑桔果实有机酸代谢生理和奉节脐橙芽变株
系的AFLP分析研究)[D]．Chongqing(重庆):SouthwestAgＧ
ricultureUniversity(西南农业大学):１－９９
MuHN(母洪娜),ZengJW(曾继吾),YiGJ(易干军),etal．
２００７．AsimpleandeffectiveDNAextraction methodfor
AFLPanalysiscitrus(一种快速高效适于柑桔AFLP分析的
DNA提取方法)[J]．GuangdongAgricSci(广东农业科
学),(３):２５－２６
PengHX(彭宏祥),LiDB (李冬波),ZhuJH(朱建华),etal．
２００８．GeneticdiversityoflonganinGuangxiassessedbyAFLP
markers(用AFLP标记分析广西龙眼种质遗传多样性)[J]．
ActaHorticSin(园艺学报),３５(１０):１５１１－１５１６
XiaoYH(肖远辉),MaiSQ(麦适秋),FuCN(傅翠娜),etal．
２０１２．Identificationofshatianyoupummelos(Citrusgrandis)
newvarietiesbyAFLP(利用AFLP鉴定沙田柚新种质)[J]．
JSouthernAgric(南方农业学报),４３(１１):１６４２－１６４５
YiGJ(易干军),YuXY (余晓英),HuoHQ(霍合强),etal．
２００２．StudiesonthecertificationofMusaABBgroupDajiao,M．
AABgroupFenjiaoandM．AABgroupLongyajiaobyAFLP(粉
蕉、大蕉和龙牙蕉的 AFLP分类研究)[J]．ActaHorticSin
(园艺学报),２９(５):４１３－４１７
YiGJ(易干军),HuoHQ(霍合强),ChenDC(陈大成),etal．
２００３．StudiesongeneticrelationshipamonglitchivarietiesbyuＧ
singAFLP(荔枝品种亲缘关系的AFLP分析)[J]．ActaHorＧ
ticSin(园艺学报),３０(４):３９９－４０３
YiGJ(易干军),Tan WP(谭卫萍),HuoHQ(霍合强),etal．
２００３．Studiesonthegeneticdiversityandrelationshipoflongan
cultivarsbyAFLPanalysis(龙眼品种(系)遗传多样性及亲缘
关系的AFLP分析)[J]．ActaHorticSin(园艺学报),３０(３):
２７２－２７６
ZabeauM,etal．１９９３．EurpeanPatent[P]．０５３５８５８A１,(３):３１
ZhangJE(张俊娥),LiuJH(刘继红),DengXX(邓秀新),etal．
２００３．GeneticvariationofcitruscalirevealedbytheploidyanaＧ
lyser(采用倍性分析仪鉴定柑桔愈伤组织的遗传变异)[J]．
ActaGenetSin(遗传学报),３０(２):１６９－１７４
􀤔􀤔􀤔􀤔􀤔􀤔􀤔􀤔􀤔􀤔􀤔􀤔􀤔􀤔􀤔􀤔􀤔􀤔􀤔􀤔􀤔􀤔􀤔􀤔􀤔􀤔􀤔􀤔􀤔􀤔􀤔􀤔􀤔􀤔􀤔􀤔􀤔􀤔􀤔􀤔􀤔􀤔􀤔􀤔􀤔􀤔􀤔􀤔􀤔􀤔
(上接第４７７页Continuefrompage４７７)
VonHoleB．２０１３．EnvironmentalstressaltersnativeＧnonnativerelaＧ
tionshipsatthecommunityscale[J]．BiolInva,１５:４１７－４２７
WalckJL,HidayatiS,DixonKW,etal．２０１１．Climatechange
andplantregenerationfromseed[J]．GlobalChangeBiol,
１７:２１４５－２１６１
WalkerS,WilsonJB,LeeWG．２００５．Doesfluctuatingresource
availabilityincreaseinvasibility? EvidencefromfieldexperiＧ
mentsinNewZealandshorttussockgrassland[J]．BiolInＧ
va,７:１９５－２１１
WilseyBJ,PoleyHW．２００２．ReductionsingrasslandspeciesevenＧ
nessincreasedicotseedlinginvasionandspittlebuginfestation
[J]．EcolLet,５:６７６－６８４
ZarnetskePL,GouhierTC,HackerSD,etal．２０１３．Indirecteffects
andfacilitationamongnativeandnonＧnativespeciespromoteinＧ
vasionsuccessalonganenvironmentalstressgradient[J]．J
Ecol,１０１:９０５－９１５
ZeiterM,StampfliA．２０１２．PositivediversityＧinvasibilityrelationＧ
shipinspeciesＧrichsemiＧnaturalgrasslandattheneighbourhood
scale[J]．AnnBot,１１０:１３８５－１３９３
１５５４期　　　　　　　　 傅翠娜等:倍性分析和AFLP标记相结合鉴定金柑新种质