全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 23(5)：425— 428 2003年 9月
苔藓植物 DNA提取方法研 究
侯义龙1，2，3，曹 同l”，蔡丽娜2，孙志刚2，崔 琳
(1．中国科学院沈阳应用生态研究所 ，辽宁沈 阳 110016；2．大连大学生物工程学院 ，辽 宁大连 116622；3-大
连大学 生命科学 工作 室 ，辽宁大连 116622；4．上海师范大学生命 与环境科学学 院，上海 200234)
摘 要 ：提取高质量 的 DNA是对苔藓植物遗传 多样性进行 研究的基 础 。该文 以苔 藓植 物为试材 ，用 5种方
法 ，即快速提取法 、改 良CTAB法 、CTAB法 、SDS法及高盐法(第 一种为 自行设 计 ，第 二种 是对原有方 法的改
进)对苔藓植物 DNA提取方法进行了比较研究。结果表明，快速提取法和改良 CTAB法是 2种适合于苔藓
植物 DNA提取的方法。这 2种方法提取的 DNA浓度和纯度均比较高，凝胶电泳显示无明显降解现象，适宜
作为 PCR扩增 的模板 ，并成 功地进行了 RAPD扩增 。
关键词 ：苔藓植 物 ；DNA 提取 ；RAPD扩增
中图分类号 ：Q781 文献标识码 ：A 文章编号 ：1000-3142(2003)05-0425—04
Study on extraction methods of
bryophytes genomic DNA
HOU Yi—longI， 3，CAO Tong ， ，CAI Li—ila ，
SUN Zhi—gang ，CUI Lin
(1．Institute ofApplied Ecology，CAS，Shenyang 110016，China；2．BioengineeringColege，Dalian University
Dalian 116622，China；3．Laboratory of Life Science，Dalian University，Dalian 116622，China；4．College
D，L fe and E t， rD ，lP f口Z Science，Shanghai Normal University，Shanghai 200234，China)
Abstract：The extraction of high quality DNA was the basis of the study for genetic diversity of Bryophytes．
The results of 5 kinds of method for extracting DNA were compared using Bryophytes species as materials．
The results showed that the fast extraction method which was designed by our research group and improved
CTAB method were 2 kinds of method suitable to the high quality DNA for Bryophytes．The purity of extrac-
ted DNA by the two methods was high and their fragment was clearly shown by agarose gel electrophoresis．
DNA extracted by the two methods was ready to be used as templates for PCR amplification．
Key words：bryophytes；DNA extraction；RAPD amplification
中国是世界上苔藓植物多样性最丰富的国家之
一
，具有较多的中国和东亚特有属种(曹同，2000)。
这些特有类群反映了中国及东亚植物区系的特征，
对深入阐明我国苔藓植物区系起源和在全球植物区
系中的地位有特殊的重要科学研究价值。因此 ，开
展苔藓植物我国和东亚特有属种的遗传多样性研究
十分必要。制备高质量苔藓植物基因组 DNA并可
用于 PCR扩增，是在 DNA水平上开展苔藓植物遗
传多样性研究的基础。目前关于植物 DNA的提取
有许多方法 ，主要的有氯化铯密度梯度离心法(傅
荣昭，1994)、CTAB法 (米 景 九 ，1990；刘 学 春，
1995)、SDS法(刘育乐，1990；戴思兰，1996)及高盐
收稿 日期 ：2002—12—16 修 订 日期 ：2003—03—12
基金项目：国家自然科学基金(3O170O76)；上海市高等学校科学技术发展基金(O1DO3 2和 02D2—47)。
作者简介；侯义龙(1963一)，男 ，辽宁盏州市人 ，教授 ，博士，从事植物基因工程研究工作 。
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法(邹喻苹，1994；Dirlewanger，1994)等，有关苔藓
植物分子生物学方面 的研究较多 (Stenoien，2000；
So，2000；Shaw，2000；Boisselier—Dubayle，1995；王
艇 ，2000)，但 有关 苔 藓植 物 基 因组 DNA 提 取方 法
的研究还未见专门报道 。本研究采取 5种不同的方
法提取苔藓植物基因组 DNA，探讨了各种方法的提
取效果 ，确定了适合苔藓植物基 因组 DNA提取 的
方法 ，并将它们用于 RAPD扩增 ，建立了苔藓植物
RAPD扩增的优化体系 ，为苔藓植物 中国和东亚特
有属种在 DNA水平上进行遗传多样性的研究奠定
基础 。
1 稿料 与方法
1．1材料
本研究在大连大学生物工程学院分子生物学实
验室和大连大学生命科学工作室进行 。试验所用苔
藓植物均采 自吉林省长 白山 自然保护 区暗针 叶林
区 ，有 毛 梳 藓 (Ptilium crista-castrensis)、万 年 藓
(Climacium dendroides)、树藓 Girgensohnia rath—
enica)、塔 藓 (Hylocomium splendens)、垂 枝 藓
(Rhytidium rugosum)、木 藓 (Thamnium alopecu—
rum)、扁枝藓 (Homalia trichomanoides)。
1．2 DNA提取方 法
1．2．1快速提取法 (1)取苔藓植物 100～200 mg，
加入液氮将其研磨成粉末 ，将粉末加入 1．5 mL离
心管中，再加入 600 L改 良 CTAB缓冲液，充分研
成匀浆，加入 3％的 p一巯基乙醇 ，震荡混匀，13 000
rpm，i0 min。(2)取上清液 ，加入等体积 CI，抽提 2
～ 3次 ，13 000 rpm，3 min，至蛋 白层无 明显 出现 。
(3)取上清液，加 0．3倍 的 NH Ac和 2．5倍冷无水
乙醇 13 000 rpm，3 min。(4)弃上清液，用 70％乙
醇 400 L洗 2次，室温干燥 DNA，加入 100 L 3
dHzO溶解 ，再加入 2 L 10 mg／mL的 RNA酶 A，
37℃ ，1 h。(5)力Ⅱ入 400 L 3 dH2O，再力Ⅱ入 500
L CI抽提 ，13 000 rpm，3 min，至蛋 白层无 明显 出
现。(6)弃去上清液 ，以 70％乙醇洗 DNA，离心 5
rain，室温干燥 DNA。(7)加 入 3 dH：O 30 L，一2O
℃备用 。
1．2．2改 良 CTAB法 (1)取苔藓植物 100～200
mg，加入液氮将其研磨成粉末 ，将粉末加入到 1．5
mL离心管中，每管中加入 600 L改 良CTAB缓冲
液 ，再加入 3％ p一巯 基 乙醇 ，混匀 ，6O℃ 水浴 ，1 h。
(2)加入等体 积 CI抽 提 2～3次，13 000 rpm，3
min，至蛋 白层 无 明 显 出现 。(3)取 上 清液 ，加 入 2
倍 体积 的无水 乙醇 ，混匀 ，一2O℃ 60 min沉淀 DNA。
(4)取 出，13 000 rpm，i0 min。(5)弃去上清液，以
70％乙醇 洗 DNA 2次 ，离 心 2 min，室 温干 燥
DNA。(6)加入 100 L 3 dH O溶解 ，再加入 2 L
10 mg／ml的 RNA酶 A，37℃ ，1 h。(7)加 入 400
L 3 dH2O，再加入 500 L CI抽 提 ，13 000 rpm，3
min，至蛋白层无明显 出现。(8)弃去上清液，以 7O
％乙醇洗 DNA，离心 5 min，室温干燥 DNA。(9)加
入 4O～50 L 3 dH2O，一20℃备 用 。
1．2．3 CTAB法 (略)，具 体参照文献 (米景九，
1990；刘学春 ，1995)。
1．2．4 SDS法 (略)，具体参照文献(刘育乐 ，1990；
戴思兰，1996)。
1．2．5高盐法 (略)，具体参照文献(邹喻苹 ，1994；
Dirlewanger，1994)。
1．3 DNA鉴定方 法
1．3．1紫外检 测 将 所得 的 DNA提取 液稀 释 100
倍于 DU一70紫外可见光分光光度计上测定波长 260
nm、280 nm处的吸光度。根据 A26O／A28O值判断
DNA纯度 。
1．3．2电泳检 测 将 提取 的 DNA 于 0．7 琼脂糖
凝胶中电泳 ，电压 3～5 V／cm，电泳时间 1～1．5 h，
EB染色。以 XDNA 为对 照在紫外透射仪上观察
DNA谱带的完整性 ，并照相记录。
1．3．3 RAPD扩增 以所提取的DNA为模板 ，进行
RAPD扩增 。RAPD扩增产物用 1．2％的琼脂糖凝
胶电泳进行分离，EB染色，透射式紫外灯下观察并
照相 。
2 结果与分析
2．1五种方法对苔藓植物 DNA的提取结果
本研究采用了五种方法提取参试苔藓植物基因
组 DNA。其中，快速提取法为本研究 自行设计 ，改
良 CTAB法是在 CTAB法基 础上 加 以改进后形 成
的，主要是在缓冲液中加入 PVP和 p一巯基乙醇。
从试验结果看出：快速提取法和改良 CTAB法
提取 的基 因组 DNA 的纯度较大 (分别为 1．74～
1．85和 1．72～1．82)，浓度较高 (分别达到 247～
289 ng／>L)，而且提取的稳定性好，基因组 DNA的
完整性都比较高(表 1，图 1：A、B)。而 CTAB法提
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5期 侯义龙等 ：苔藓植 物 DNA 提取方法研究 427
取的基 因组 DNA 虽然 完 整 性 较好 ，浓 度较 大 (226
～ 268 ng／uL)，但 纯度较 低 (1．52～ 1．60)。SDS法
和高盐法提 取 的基 因组 DNA 纯度 较低 (分别 为
1．45～1．6O和 1．38～ 1．50)，浓度也较低(分别为
1O7～132 ng／uL和 104～ 126 ng／／~L)。 因此 ，在 实
验 的初期 ，研究 小 组 即决 定 淘 汰 CTAB法 、SDS法
和高盐法 ，而保 留快 速提 取法 和 改 良 CTAB法 ，并
以之建立 RAPD扩增体系。值得指出的是，快速提
取法 比较适 合新 鲜样 品以及 干燥 保存 时间在半 年以
内的样 品的 DNA 提取 ，干燥保 存 超过 半年 以上 ，则
使用该方法的提取浓度下降，改 良 CTAB法则可弥
补快 速提取方 法 在这方 面 的不 足 。 因此 ，本 研究认
为提 取苔藓 植 物 DNA 时 ，采 用快 速 提取 法 和改 良
CTAB法为好，两方法可以配合使用，对于新鲜的苔
藓植物材料以及干燥保存时间半年以内的样品可采
用快速提取法，这样既能保证提取效果，又可缩短提
取时间，提高基因组 DNA提取效率，如果参试材料
干燥保 存时间太长 ，最好采用 改 良 CTAB法 。
2．2 RAPD扩增体 系优化
对影响 RAPD反应体系的主要因子(Mg抖浓
度、dNTP浓度、引物浓度 、Taq DNA聚合酶浓度和
DNA模板浓度)的用量设计不同的梯度 ，以经济实
用为原则 ，能扩增 出清晰 、可重复的谱带为 目的，进
行摸索。经过多次研究 ，建立了苔藓植物 RAPD扩
表 1 五种方法提 取的苔藓植物 DNA的纯度与浓度
Table 1 The quality and concentration of DNA extracted by 5 methods
_
1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7
图 1 苔藓植物 DNA电泳结果
Fig． 1 The agarose gel electrophoresis of loryophytes DNA extracted by fast extraction and improred CTAB
A．快速提取法(fast extraction)提取 DNA电泳结果；B．改良CTAB(improved CTAB)法提取 DNA电泳结果 。
泳道 1～7．毛梳藓、万年藓、树藓 、塔藓、垂枝藓、木藓 、扁枝藓。
Lane1 tO Lane7：Ptilium crista—castrensis，Climacium dendroides，Girgensohnia rathenica，Hylocomium Splendens，
Rhytidium rugosum ，Thamnium alopecurum ，Homall口tr chomanoidPs
．
增的优化体 系，反应体系 为：MgC1：1．5 mmol／L；
dNTP 200 umol／L；模 板 DNA 0．4 ng／／~L；TaqD—
NA聚合酶 1 U；随机引物 0．5 umol／L。反应程序
为 ：94℃预变性 3 min，94 oC 1 min，36 oC 45 s，72
℃ 1 min，进行 45个循 环，最后 一次延伸 72℃ 5
min，冷却至 4℃保存。RAPD扩增结果见图 2。
从图 2可以看 出：苔藓植物 RAPD扩增结果稳
定、清晰，表明 RAPD扩增体系已建立起来 ，这为苔
藓植物 中国和东 亚特有属 种在 DNA水平 上进行遗
传多样性的研究奠定了基础。
3 讨 论
DNA的质量是决定分子生物学实验成败的主
要因素之一。近年来 ，有关基 因组 DNA提取方法
的应用 已有许 多文 献 报道 (曹 同，2000；傅荣 昭，
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1 2 3 4 5 6 7 8 9 1O 1 1 12
图 2 RAPD扩增后 电泳结果
Fig． 2 The agarose gel eIectrophoresis of
bryophytes RAPD amplification
泳道(Lane)1～2、5～6、9～10：快速提取法(Fast extraction)
泳道 (Lane)3～4、7～ 8、l1～12：改 良(Improved)CTAB法 ；
泳道(Lane)1～4：引物(primer)为 S105；泳道(Lane)5～8：
引物(primer)为 S115；泳道(Lane)9～12：引物(primer)为
Sl19；DNA模板均为混合模板 Template is mixture．
1994；米景九 ，1990；刘学春，1995；刘育乐，1990；戴
思兰 ，1996；邹 喻 苹 ，1994；Dirlewanger，1994；Ste—
noien，2000； So，2000； Shaw ， 2000； Boisselier-
Dubayle，1995；王 艇 ，2000；周 永 红 ，2000；Kim，
1997；Dolyle，1987；Zouhair，2000；Wei，1997)。但
是，由于不同植物及同一植物不同组织的结构及生
化成分各不相 同，而这些 结构和成 分上的差异对
DNA的不同提取方法往往会造成不同程度的影响，
导致了不同提取方法所得的 DNA在纯度和质量上
的差异 。因此 ，在实际工作 中 ，应 根据 实验材料 的生
化成分以及取材时间和材料保存时间长短的特点 ，
筛选或建立适当的提取方法。苔藓植物是一种富含
多酚类物质的植物(吴鹏程 ，1998)，由于酚类物质的
干扰，使得苔藓植物 DNA提取较其它植物 DNA的
提取难度大，从本实验结果来看，不同方法提取苔藓
植物基因组 DNA的质量和纯度明显不 同。我们在
实验 中所采用 的快 速提取 法 和改 良 CTAB法取 得
了比较满意的效果 ，是 因为在 CTAB法 的缓 冲液 中
加入 了 PVP和 p一巯基 乙醇 。PVP对 于抑 制多 酚
氧化酶和细胞 色素 氧化 酶 的活性 ，能起 到很 好的效
果 。PVP是一种重 要的稳定 剂和 抗氧 化剂 ，能有效
地减轻杂质的干扰。若提取液 中不加 PVP，则难以
获得纯白色的 DNA。p一巯基 乙醇具有抗氧化的作
用，适当增加其浓度，可以防止氧化褐变，获得较好
的 DNA提取效果。正是这两种物质的作用 ，才使
快速提取法和改良 CTAB法提取的 DNA纯度比较
高且 DNA的颜色为纯白色。而在提取缓冲液中未
加入这两种试剂 的 SDS法和高 盐法提取 的 DNA不
同程度地发生 了褐变 ，这 是 因为 在实 验过 程 中苔藓
—————’ ‘ ’’ ’ 。’1 ’。 。‘‘’。___一 一
植物的内源酚类物质被氧化的缘故。从 DNA纯
度、浓度 、完整性以及 RAPD扩增结果来看，快速提
取法和改良 CTAB法是苔藓植物基因组 DNA提取
的适宜方法 。
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