全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 26(3)：300—303 2006年 5月
大白菜细胞质雄性不育保持系341 1⋯7
RAPD特异扩增片段的克隆测序
王永飞1，马三梅1，张鲁刚2
(1．暨南大学 生物工程学系，广东 广州 510632；2．西北农林科技大学园艺学院 ，陕西 杨陵 712100)
摘 要：利用 RAPD技术从大 白菜细胞质雄性不育保持系 3411-7的 DNA中得到一个特异扩增片段
MOPB046oo。回收该特异扩增片段并将其克隆到pGEM T Easy载体上进行序列测定。结果表明该片段全长
600bp，其碱基组成为 A+T一72．33 通过与 GenBank+EMBL+DDBJ+PDB中的455，972个序列进行同源
性比较，同源性均小于30 ，表明该片段为一新发现的序列。并对该特异片段的来源及其可能的作用进行探讨。
关键词：大白菜；细胞质雄性不育；RAPD 克隆；测序
中图分类号：Q943．2 文献标识码：A 文章编号：1000—3142(2006)03—0300—04
lonlng antl seq uenclng ot a speci[IC am pli[1ed · 1 ● n ‘n● _-^● 1
DNA fragment from cytoplasmic male sterility
maintainer line 341 1-7 0f Chinese cabbage
W ANG Yong～feil，MA San—meil，ZH ANG Lu～gang
(1．Department of B 。 耳，Jinan University，Guangzhou 510632，China}2．Colege of Horticulture，
Northwest Science and Technology University of Agriculture and Forestry，Yangling 712100，China)
Abstract：A specific amplified DNA fragment was obtained from cytoplasmic male sterility maintainer line
“341卜7”of Chinese cabbage by RAPD technique．This specific fragment was cloned into pGEM—T Easy vector
and DNA sequence was determined．The result showed that it was consisted of 6OObp and the base component
of A+T was 72．33 ．Comparison between MOPB046o0 and 455，972 sequences from GenBank+EMBL-+-
DDBJ+PPB revealed that the homology were low(1ess than 30 o,4)．This implied that it was a newly found
DNA sequence．The origin of MOPB046oo and its possible effects were discussed．
Key words：Chinese cabbage(Brassica campestris ssp．pekinensis)；CMS；RAPD；cloning；sequencing
植物细胞质雄性不育(cytoplasmic male sterili—
ty，CMS)是一种不能产生有活力或可育花粉的母性
遗传现象(Hanson，1991)。自 1 921年 Bateson和
Gairdant在亚麻中发现第一例 CMS以来，人们对
CMS从形态学、组织学、遗传学和分子生物学等方
面进行深入研究，为揭示 CMS的机制和选育 CMS
系奠定了理论基础(Budar等，2003)。植物 CMS由
胞质遗传物质和细胞核遗传物质的共同作用控制
(Schnable等，1998)。不育系(A系)的育成和保持
均依赖于其相应的保持系(B系)。A系的育成通常
是由亲缘关系较远的两个亲本杂交和多代回交，将
一 个亲本的核置换到另一个亲本的细胞质中引起核
质不亲和性即核质互作而产生的(Pearson，1981)。
例如大白菜细胞质雄性不育系 CMS341卜7就是由
甘蓝型油菜波里马(Polima)不育系和大白菜自交系
3411—7杂交后，以3411 7为轮回亲本经多代回交选
收稿 日期：2005一O1—1 7 修回 日期：2005—07—22
基金项目；暨南大学引进人才启动基金(692017)[Supported by the Initial Foundation to Ph．D．of Jinan University(692017)]
作者简介；王永飞(1972一)，男，山西壶关县人，博士，副教授，主要从事植物遗传育种与分子生物学的研究，(E mail)wyfmsm@
163，Corn
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3期 王永飞等：大白菜细胞质雄性不育保持系 3411—7一～RAPD特异扩增片段的克隆测序 301
育得到的，341卜7就为其相应的保持系(柯桂兰等，
1992)。故认为 A系和 B系的细胞核在遗传上完全
一 致，育性的差别是由于二者在胞质基因的差异引
起的。因此，在 CMS的机理研究中，A系和 B系间
胞质 DNA的差异倍受关注(Schnable等，1998)。
二十世纪 8O年代以来，分子生物学的快速发展
为比较A系和B系的 DNA差异提供了有力的技术
手段和工具。尤其是 RAPD技术诞生后，因其快
速、经济、有效而得到了广泛应用，从而促进了对
CMS分子机理的研究(王永飞等，2001)。在以 A
系和B系的线粒体DNA(mitochondrial DNA)为模
板的RAPD扩增反应中，已发现了许多扩增片段在
A系和 B系之间表现出差异，并找到了一些两系的
特异片段(许仁林等，1995)。大量的实验结果表明，
利用 RAPD技术，检测 mtDNA在不育系和保持系
之间的多态性，并进一步探讨这些多态性的分子基
础，有助于揭示CMS的形成机制(Budar等，2003)。
但是，A系和B系的细胞质大多分别来自完全
不同的种属，甚至更为远缘，也就是说，A系和 B系
的胞质 DNA在遗传上是完全异质的。尽管 A系和
B系间的育性差别可能是由于胞质的差别引起的，
但对遗传上远缘且无交流的两个系统进行比较，会
发现二者的差异太多，而很难找出真正导致 CMS
的DNA片段(范昌发等，2001)。同时，恢复系(C
系)核恢复基因(nuclear restorer gene)的引入，会导
致 A系育性的恢复，认为这是由于 C系的核恢复基
因会“弥补或矫正”A系胞质基因的“缺陷”，从而导
致花粉育性的恢复；并且 A系的保持也必须在 B系
核基因的作用下才能保持。显然，核基因组在 CMS
中是起重要作用的(徐秉芳，2000)。那么，A系和 B
系间在核基因组上会不会有差异?范昌发等(2001)
以高粱 CMS不育系和其保持系为材料，利用
RAPD技术对总 DNA、mtDNA 及 叶绿体 DNA
(chloroplast DNA，cp DNA)进行分析比较，结果发
现，A系和 B系的核 DNA上存在差异。郭骁才
(2001)对核基因组在 CMS中作用进行了综述。
利用 RAPD技术对大白菜细胞质雄性不育系
CMS3411—7和其保持系3411—7的DNA进行扩增，通
过对扩增图谱的比较研究，证实不育系和保持系的
DNA组织结构存在一定差异，并检测到不育系和保
持系的特异扩增片段 CMS0PLo16 。和MOPB046。(王
永飞等，2003)。本研究将 MOPB046。片段克隆到
pGEM-T Easy载体上进行序列测定。并对该特异片
段的来源及其可能的作用进行探讨。
1 材料和方法
1．1材料
植物材料：所用的植物材料为大白菜细胞质雄
性不育系CMS3411—7和其保持系 3411—7。菌株和
质粒：转化 受 体 菌 为 E．Coli DH 克 隆载 体
pGEM-T Easy购自Promega公司。主要生化试剂
及酶类：限制性核 酸内切酶、修饰酶、dNTPs和
DNA分子量参照物购自华美生物工程公司；随机引
物购自Operon公司；X—Gal、IPTG购自Promega公
司；PEG8000购自Sigma公司。
1．2方法
1．2．1 DNA的制备 采用改良SDS法(王永飞等，
2000)进行大白菜总DNA提取。
1．2．2 RAPD扩增及扩增产物的检测方法 RAPD
扩增反应在 PE公司生产的 DNA Thermal Cycler
480型PCR仪上进行，具体反应条件以我们优化的
体系进行(iE永飞等，2OO2)，即在25 L反应体系中
含有 i0 mmol／L Tris-HC1(pH8．3)，50 mmol／L
KC1，1．5 mmol／L MgC12，0．001 明 胶，0．15
mmol／L dNTPs，1．0 gmol／L随机引物，2O～6O ng
的基因组 DNA，1．0U的 Taq DNA聚合酶(华美生
物工程公司产品)。反应程序：94℃预变性 5 rain后
执行 94℃变性 1 min，37℃复性 1 rain，72℃延伸 2
min，35个循环，最后 72℃再延伸 5 min。
1．2．3特异扩增片段的回收和克隆测序 特异扩增
片段经低熔点琼脂糖凝胶电泳回收，克隆到 pGEM—
T Easy载体上，并转化 E．coli DH ，具体方法参考
文献 (Sambrool等，1898)。DNA序 列测定采用
ABI公司的PRISM州Ready Reaction Dye Dco xy
Terminator Cycle Sequencing试 剂盒反应，通过
ABI全自动序列分析仪进行测序分析。
1．2．4 DNA序列的计算机分析 用PC gene程序分
析 DNA序列中的碱基组成和开放阅读框架，并通过
查询与 GenBank+EMBL+DDBJ+PDB中的 455，
972个序列(Altschul等，1997)进行同源性比较。
2 结果与分析
2．1大白菜细胞质雄性不育保持系3411—7的RAPD
我们共用 269个随机引物对 CMS3411—7和
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3O2 广 西 植 物 26卷
3411—7的DNA进行 RAPD扩增。通过对扩增图谱
的比较研究，发现有 79个引物的扩增结果在不育系
和保持系之问存在差异。进一步对这 79个引物进
行筛选，筛选得到了引物 OPB04。用 OPB04作引
物时，扩增出了一条保持系 341l一7所特有的条带，
其大小约为600bp(图 1)，记为 MOPB04 。。
2．2 MOPB04Ⅲ片段的克隆测序
特异扩增 片段经 回收纯 化后，将其 克隆到
pOEM—T Easy载体上并转化大肠杆菌 DH。 §蓝白
斑选择，酶切鉴定，筛选出含有插入片断的重组质粒
pGEMOPB04。重组质粒经 PEG 8000纯化后 ，以
T7和 SP6为通用引物，在 ABI全 自动序列分析仪
上进行正反向测序，结果如图 2。
图 2中的GGACTGGAGT和ACTCCAGTCC
O0 1 GGACTGGAGI
O6 1 T1 AAAACC FT
l 2 l FGACAGTCAC
18l GCGTCATCAA
24 l CAAGATM、AT
301
361
42l
48l
54l
GATTGT从 AC
R L ：}：
AAAGAT FAAA
AAAATATTAA
K N T K
( I rCAA G
AAAI AGGAG J1
GAAACI、GGAC
¨．CT r，r( I”r
CAACTAGATT
AGTAGCT FTA
TTTI”rAGAAA
Cq、AACATAAC
TTrGTAI、T ’
GGC FCGGAAT
、CCAACTTT
AAAAGT 门、GT
l543bp一
994bp -
695bp——-
5I5hp—-．
：{77hp一
图 i 引物 OPBO4扩增的 a411_7的特异片段
Fig．1 The specific fragment of 3411 7
amplified by primer OPB04
M ：PCR Markers；1：CMS341l_7l 2：a41卜7．
GTGT rAGGTT
CATq、AGAAAC
GCTATAATGG
TTCI、ATTACA
CTCGTA FI、Cr
TTGTTAGGTA
(；GTAAA(；AAA
ACGI、AAAGCG
AAT I1A FTACA
TT I GT(；q 1、
|rTCAAAAq AA T⋯i AATTAA_rT TTATTGAATI ACTAq、．rOAf T
AAr rAAAGGA AA rGATATG(
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AGACTGA(；TA
Q S E Y
AACAAq、AACA
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TTq ATTTq、CI、
TCCGTTCCAr
TCTATGAAAA
M K
AAAAG，I、-rACT
A rAq、GCATGA
M
T从 AAGAATT
CI、AAI’C FA FI、
ACTCCAGTCC
图 2 大白菜细胞质雄性不育保持系341l一7 DNA特异片段 MOPB0％oo的核苷酸序列和推导的氨基酸序列
Fig．2 Nucleotide sequence and the deduced amino acid residues of the specific fragment of remain line 341卜7
表示引物 OPB04的碱基序列和其互补序列；*表示
终止密码子；起始密码子和终止密码子用黑体标出。
从图 2中看出，MOPB046。。的 DNA序列全长 为
600bp。两 端 有 随 机 引 物 OPB04的 序 列 (5
GGACTGGAGT3 )和 其 互 补 序 列 (5 ACTC—
CAGTCC3 )，其碱基组成为 206个 A，72个 C，94
个 G，228个 T，A+T==72．33 ，A+G=5O 9，6。通
过查询发现它与 GenBank+EBML+DDB]+PDB
中已报道的455，972个序列的同源性均低于 3O ，
表现该片段为一新发现的大白菜 DNA序列。该序
列中不包含有长度在 200bp以上的开放阅读框架
(open reading frame，ORF)，但在十4l7～+473的
区域内，含有一个以 ATG为起始密码子，TAA为
终止密码子，可编码 l8个氨基酸残基的编码区。从
推断的氨基酸序列来看，这个短肽富含赖氨酸、异亮
氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸等氨基酸。另外在+294～
+308和 387～398的区域内，有两个以 ATG为起
始密码子，TAA为终止密码子的编码区，分别编码
4和 3个氨基酸残基小肽。
3 讨论
我们利用 RAPD技术对大 白菜细胞质雄性不
育系 CMS341l一7和其保 持系 34ll一7的基 因组
DNA进行比较分析，共使用了 269个随机引物，其
中有 163个引物在两系问都得到扩增产物，79个引
物扩增结果在两系间表现出遗传多态性。并找到了
保持系的特异扩增片段 MOPB04。∞。
因为用改良SDS法提取的基因组 DNA是由核
DNA、mtDNA和 cpDNA组成的，所以MOPB0460c
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3期 王永飞等：大白菜细胞质雄性不育保持系3411—7一一RAPD特异扩增片段的克隆测序 303
特异片段有可能来自核 DNA，也有可能来 自mtD—
NA和 cpDNA。MOPB046∞特异片段的测序结果
和序列同源性比较表明，该特异片段的序列和已发
表基因序列的同源性都较小，相比较而言，和已发表
的叶绿体和线粒体基因序列的同源性更小，因此我们
推测该特异片段很可能来自核 DNA。如是这样，也
就证实了范昌发等(2001)的观点，即 A系和 B系的
核DNA上存在差异。这些差异也许在 A系和 B系
的育性差异的形成过程中有重要的作用(郭骁才等，
2001)。但该特异片段是否与大白菜细胞质雄性不育
系 cMS3411—7和其保持系 3411—7的育性有关，还是
与其他的性状有关，这有待于进一步的深入研究。
参考文献：
Ahschul SE，Thomas L． 1997． Gapped BI AST AND PSI-
BI AST a new generation of protein database search program
EJ]．NucleicAcids Res。25：3 389—3 402．
Budar F，Touzet P，De Paepe R．2003．The nucleo-mitochondrial
conflict in cytoplasmic male sterilities revisitedEJ]．Genetica，
117：3— 16．
Fan CF(范昌发)，Sun CY(孙 春昀)。Guo XC(郭 骁才)。et a1．
200 1．Diference in nuclear DNA between cytoplasmic male
sterile line Aa V4 and its maintainer V4 of sorghum(Az型高梁
细胞质雄性不育系与其保持系的胞质DNA和核 DNA差异)
EJ]．Chin．，Appl Environ Biol(应用与环境生物学报)，7(3)：
291—296．
Guo XC(郭骁才)．2001．How to understand nuclear DNA in
Cytoplasmic male sterlity(核基因组在细胞质雄性不育中的作
用研究：背景与性状)EJ]．Chin．，Appl Environ Biol(应用与
环境生物学报)，7(3)：297—301．
Hanson MR．1991．Plant mitOch0ndrial mutations and male ste—
rility[J~．AnnuRevGenet，25：461-486．
Ke GI (柯桂兰)，Zhao ZY(赵稚雅)，Song YZ(宋胭脂)，et a1．
1992．Breeding of aloplasmic male sterile line CMS3411—7 in
Chinese cabbage(Brassica campestris L．ssp．pekinensis)and
its application(大白菜异源胞质不育系CMS341147的选育及
应用)EJ]．Acta Hort Sin(园艺学报)，19(4)：333-340．
Pearson OH．1 981．Nature and mechanisms of cytoplasmic male
sterility in plant[J]．Hort Sci，16：482—484．
Sambrool J，Fritsch EF。Maniatis T．1 989．Molecular Cloning A
laboratory manual[M]．(2nd ed)．Cold Spring Harbor I,abo—
ratory Press，756— 783．
Schnable PS，Wise RP．1998．The molecular basis of cytoplasmic
male sterility and fertility restoration[J]．Trends Plant Sci，3：
175— 18O．
Wang YF(王永 飞)，Ma SM(马三梅)，Liu CP(刘翠萍)，et a1．
2001．Application of molecular markers in plant genetics and
breeding(分子标记 在植 物遗传 育种 中的应 用原理及现状 )
EJ]．J Northwest Sci—Tech Univ Agri For(Nat Sci Ed)(西北
农林科技大学学报)(自然科学版)。29(Supp1)：1O6 l】3．
Wang YF(王永飞)，Ma SM(马三梅)，Zhang I。G(张鲁刚)，et a1．
2003．Cloning and sequencing analysis of a specific DNA frag—
ment related to cytoplasmic male sterility line of Chinese cab—
bage(Brassica campestris ssp．pekinensis)(大白菜细胞质雄性
不育系RAPD特异片段的克隆及序列分析)EJ]．Acta Bot Bo—
real—Occident Sin(西北植物学报)。23(1)：49—53．
Wang YF(王永飞)，Wang M(王 鸣)。Zheng XQ(郑学勤)，et
a1．2000．Comparison of genomic DNA extraction methods of
Chinese cabbage(Brassica campestris L．ssp．pekinensis)(提取
大白菜基因组 DNA的几种方法比较)EJ]．Acta Univ Agri
Boreal—Occident(NatSciEdi)(西北农业大学学报)(自然科学
版)，28(4)：85—88．
WangYF(王永 飞)。Wang M(王 鸣)，Zheng XQ(郑 学勤)．
2002． The mlecular biology of cytoplasmic male sterility in
Chinese cabbage(Brassica campestris I。．ssp．pekinensis)(大白
菜细胞质雄性不育的分子生物学研究)EJ3．Hereditas(Bei
jing)(遗传)。24(4)：63—64．
Xu BF(徐秉芳)．2000．Nuclear restorer gene for fertility(核编
码的育性恢复基因)EJ]．Plant Physiol Commun(植物生理学
通讯)，36(6)：573—580．
Xu RI (许仁林)。Xle D(谢 东)。Shi SY(师索云)．1995．Clo
ning and sequence analysis of a specific mitochondrial DNA
fragment related to wild abo~ive type cytoplasmic ImIe sterility in
flee(水稻线粒体 DNA雄性不肯有关特异片段的克隆及序列分
析)EJ]．Acta Bot Sin(植物学报)。37(7)：501-506．
(上接第 316页 Continue ftom page 316)
参考文献：
EJ]．广东林业科技，(1)；46．
Makino H，Nakano T，Mac T．1994．Response of Rubisco，cytf and
sucrose synthesis in rice leaves to leaf nitrogen and their relation—
ships to photosynthesis[J]．Plant Physiol，105：173—179．
Osmond CB．1994．Photoinh．bition molecular mechanism to the
field[c]／／Baker NR，Boyer JR．What photoinhibition Some
insights from comparison of sun and shade plants．Oxford：Bi—
os Scientific Publications．1一Z4．
Su PX(苏培玺)，Zhang LX(张立新)，Du MW(杜 明武 )，et a1．
2003．Photosynthetic character and water use eficiency of dif—
ferent leaf shapes of Populus euphratica and their response to
C02 enrichment(胡杨不同叶形光合特性、水分利用效率及其
对加富 C02的响应)EJ]．Acta Phytoecol Sin(植物生态学
报)，27(1)：34—4O．
UNEP Worid Conservation Monitoring Centre(UNEp-WCMC)．
1997．Biodiversity profile of the Socialist Republic of Viet Nam：
Appendix 5-Threatened Plant Species(online)(htp：／／www．we-
me．org．uk／infoserv／countryp／vietnam／app5．htm1)．
Wen DZ(温达志)，Ye WH(叶万 辉)，Feng HI (冯 惠玲)，et a1．
2000．Co mparison of basic photosynthetic characteristics between
exotic invader weed Mikanla micrantha and its companion species
(外来人侵杂草薇甘菊及其伴生种基本光合特性的比较)EJ]．J
Trop Subtrop Bot(热带亚热带植物学报)。8(z)：139—146．
Zhang LY。Ye W H，Cao HI ，eta1．2004．Mikania micrantha H．
B．K．in China—an overview[J]． e Res，44；42-49．
维普资讯 http://www.cqvip.com