全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 27(2)：260— 264 2007年 3月
三叶半夏叶片一步成苗离体培养技术
罗成科 一，彭正松1*，蔡 鹏
(1．西华师范大学 生命科学学院，四川 南充 637002；2．宁夏大学 新技术应用研究开发 中心 ，银川 750021)
摘 要 ：以药用植物三叶半夏叶片为材料 ，通过比较直接和间接器官发生两种途径 ，建立了半夏一步成苗的
快速繁殖技术体系。结果表明，经过愈伤组织阶段的一步成苗培养基为 Ms+0．5 mg／L 2，4一D+1．0 mg／L
KT，90 d左右方可得到再生植株，植株分化率为 74％，每个外植体上分化的块茎数为 5．61土1．04。附加
NAA与 BA两种激素对一步成苗培养基进行优化，筛选出一步成苗最佳培养基 MS+0．5 mg／L NAA+0．5
mg／L BA，60 d后就可直接发育成完整植株，植株分化率为 76％，每个外植体上分化的块茎数高达 9．97土
0．81，对这种培养基上的再生小植株进行移栽，1个月后，移栽成活率达 100％。
关键词：半夏 ；器官发生；一步成苗；植株再生
中图分类号：Q943．1 文献标识码：A 文章编号 ：1000—3142(2007)02—0260—05
In-vitro regeneration of Pinellia
ternata from leaf explants
LUO Cheng-Ke1，2，PENG Zheng-Song1 ，CAI Peng1
(1．Colege of Life Sciences，C ina West Normal University，Nanchong 637002，China；2．Applied Research and
Development Center for the New Technology，Ningxia tiniversity，Yinchuan 750021，China)
Abstract：Leaf blade of Pinellia ternata as explant，a system of rapid propagation was established via comparing two
pathways of direct and indirect organogenesis．The results showed that when the young leaf blade segments were cul—
tured on MS medium supplemented with 0．5 mg／L 2，4一D+1．0 mg／L KT，calus was induced，and the plants were
regenerated in 90 days，and the differentiation frequency was 74 ，each explant produced 5．6 1 4-1．04 tubercles．As
0．5 mg／L NAA and 0．5 mg／L BA were added to the MS medium，the medium was optimized．After 60 days cul—
ture，plants were regenerated directly from the young leaf blade explants without visible calus formation，the differen—
tiation frequency was 76 ，and the tubercles differentiated from each explant reached 9．97土0．81．One month after
transplanting，100 of the plantlets survived．
Key words：Pinellia ternata；organogenesis；one-step culture；plant regeneration
三叶半夏(Pinelia ternata)为天南星科半夏属
多年生草本植物，广泛分布于我国长江流域以及东
北、华北等地区，其块茎被称为半夏，是许多中药配
方及中成药的必要成分，用量较大。半夏具有润燥
化痰、降逆、止呕、抗早孕、抗肿瘤等多种功效(中国
医学科学院药物研究所，1993；江年琼，2001)。近年
来，因其市场走俏和特殊的药用价值倍受国内外关
注。长期依赖采集野生半夏人药的状况，导致野生
资源日益枯竭，迫使人们试用半夏属近缘植物作为
替代品使用(吴艳，2003)，但近缘属植物的药效一直
收稿 日期：2006-04-27 修回日期：2006—11—2O
基金项目：四川青年科技基金 (05ZQ026—041)；宁夏大学青年教师科研启动基金 (QN0522)[Supported by Science and Technology
Foundation for Youth Scholars of Sichuan Province(05ZQ026—041)；Initial Scientific Research Foundation for Youth Teachers of Ningxia
University(QN0522)]
作者简介：罗成科(1979一)，男(回族)，宁夏海原人，硕士，主要从事植物细胞、组织培养等研究，(E-mail)chkluo2002@yahoo．corn．cn。
通讯作者(Author for correspondence，E-ma il：pzs8833@163．corn)
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2期 罗成科等：-@半夏叶片一步成苗离体培养技术 261
难以肯定，医药行业仍然希望用道地的三叶半夏入
药。为应市场之需，进行半夏的人工栽培势在必行
(龚成文，2005；马开森等，2004)，但其自然繁殖系数
很低(Peng，2005)，导致人工栽培生产成本高，为此
人工快速繁殖成为亟待解决的一大难题。
组织培养技术是加速繁殖的有效途径。通过愈
伤组织阶段得到再生植株，前人 已做了大量报道
(Shoyama，1983；任家惠等，1983；朱鹏飞等，1985；
苏新，1989；万美亮等，1995；罗光明等，2003)。然而
愈伤组织经长期继代往往会产生大量的突变(其中
绝大多数是不利的)，一些突变可能会降低药效，甚
至危害人畜健康 ，这在医药行业中是必须避免的；最
近有不经过愈伤组织阶段直接得到半夏再生植株的
实验报道(薛建平等，2004；张爱民等，2005)，但其再
生频率还不是很高(分化率 8．3 9／6，每个外植体分化
块茎数 3～5个)。为克服这一难题，我们以叶片为
材料，研究不同激素组合对半夏一步成苗的影响，通
过优化间接器官发生途径，探索出不经过愈伤组织
这一环节的一步成苗快速繁殖培养方法，使其能从
实验室研究成果转变为可直接用于大量生产商品苗
的实用技术体系。
1 材料与方法
1．1外植体与接种
三叶半夏(P．ternata Breit．)采自四川省南充
市西充县境内，经西华师范大学生命科学学院秦自
生研究员鉴定，种植两年后取 3～4 cm长的幼叶作
为外植体。外植体灭菌方法：自来水冲洗 1 h，然后
在超净工作台上用 7O 9，6酒精消毒 30 S，再在 0．1
升汞溶液中灭菌 10 min，无菌水冲洗 5～6次，自叶
柄顶端剪取叶片，远轴面向下，接种在培养基表面。
每瓶接种 5个叶片，每处理 3～4瓶，重复 3次，共
5O个外植体。
1．2培养基
基本培养基均为 MS。按实验设计添加生长调
节物质组合。培养基均附加蔗糖 30 g／L，琼脂 7．0
g／L，pH5．8。培养基分装于 150 mL的三角瓶中，
每瓶 25 mL，均在 121℃、1．1 kg／cm高温高压灭菌
15 min。
1．3培养条件
培养温度为 25±2℃，光照周期为 12 h·d～，
光照强度为 2 OOO～3 000／~mol·m-。·s- 。
1．4结果调查与统计分析
叶片接种后，每隔 2 d观察 1次，记录外植体的
脱分化和再分化过程以及愈伤组织的色泽、质地、根
芽分化的先后顺序和试管苗的生长状况等性状，3O
d后统计诱导率(愈伤组织诱导率一产生愈伤组织
的叶片数／接种的叶片总数×100 )；40 d后统计
分化率(分化率一分化出块茎的愈伤组织块数／总愈
伤组织块数 ×i00 ，分化率=分化出块茎的总叶
片数／接种叶片总数×100 9，6)；统计每个外植体分化
的块茎数(每个外植体分化的块茎数一分化出的块
茎总数／分化出块茎的总愈伤组织块数，每个外植体
分化的块茎数=分化出的块茎总数／分化出块茎的
总叶片数)；实验数据经 T测验后，用 ANOVA进行
分析 。
2 结果与分析
2．1间接器官发生和植株再生
2．1．1愈伤组织的形成及形态发生 以叶片切块培
养，接种后 11 d，外植体开始上翘或拱起，切El端开
始膨大，颜色变浅，约 25 d左右形成淡黄色、结构松
散的愈伤组织。30 d后 ，可见从愈伤组织上出现白
色绒毛状物，随后绒毛状物中间伸出许多的突起，这
些突起迅速伸长成为密被白色绒毛的细根。50 d
后，在生根的愈伤组织表面分化出绿色的芽点，芽点
后来增大形成球状体，类似于自然生长的珠芽，其上
生叶。球状体连接着根和芽的绿苗，90 d左右形成
了结构完整的再生植株。
表 1 2，4-D对半夏离体叶片一步成苗的影响
Table 1 Effect of 2．4一D on the one-step
culture of excised leaf in P．ter 口t口
同-N中平均数后有相同字母时差异显著性未达到 a一0．05水
平。下同。
Same letter in the column means no significant difference at a一
0．05 according to Duncan’s multiple test．The same below．
2．1．2 2，4一D对半夏 离体叶片一步成苗的影响
KT浓度为 1．0 mg／L时，2，4一D的浓度明显地影响
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262 广 西 植 物 27卷
愈伤组织的诱导、分化及成苗情况，其结果见表 1。
不加2，4一D时，不形成愈伤组织，而是直接从外植体
上长出球状 体，分化 出芽 ，产生极少量根 或无根形
成。加入 2，4一D后均能产生愈伤组织 ，但 随 2，4一D
浓度(O．5～2．0 mg／L)的增加，愈伤组织诱导率从
6O 下降到3O ，每个外植体分化的块茎数从 5．61
±1．04个减少到没有块茎分化。当 2，4一D浓度为
2．0 mg／L时，甚至无分化。0．5 mg／L 2，4一D和 1．0
mg／L KT的组合 ，1．0 mg／L 2，4一D和 1．0 mg／L
KT的组合都有利于根的分化，但 0．5 mg／L 2，4一D
和 1．0 mg／L KT的组合所形成的根较健壮，根系发
达；而 1．0 mg／L 2，4一D和 1．0 mg／L KT的组合形
成的根稀少。在所有的激素组合中，0．5 mg／L 2，4一
D和 1．0 mg／L KT的激素组合有利于半夏离体叶
片一步成苗，因为它的愈伤组织诱导率为 6O ，分
化率为74 ，每个外植体分化的块茎数最高，达
图版 工 A．分化出球状体(小块茎)和绒毛状根；B．分化出苗；c．形成正常根；D，E．再生小植株；F_移栽三个半月后的再生植株。
Plate I A：Diferentiated glomerations(tubercles)and viliform roots；B：Diferentiated seedlings；c：Formed normal roots；D
E：Regenerated plantlet F：The plantlets transplanted after three and a half months．
5．61±1．04个 。
2．2直接器官发生和植株再生
2．2．1脱分化及形态发生 以叶片切块培养，接种
后7 d，外植体开始上翘或拱起，切口端开始膨大，颜
色变浅，约 24 d左右在增厚的边缘没有明显的愈伤
组织形成，而是出现白色绒毛状物，28 d后绒毛状
物中间伸出许多的突起，这些突起分化成绿色的芽
点，后来扩展至整个外植体表面，不久下方迅速伸长
成为密被白色绒毛的细根(图版 I：A)。芽点不久
增大形成球状体，类似于自然生长的珠芽，其上生
叶。球状体连接着根和芽的绿苗，60 d左右形成了
结构完整的再生植株(图版 I：B、C、D、E)。
2．2．2 NAA对半夏离体叶片一步成苗的影响 BA
浓度为 0．5 mg／L时，NAA的浓度明显地影响着外
植体的分化及成苗情况，其结果见表 2。不加 NAA
时，外植体的分化率很低，为 4％，而且每个外植体
上分化出的块茎数较少，仅 3个，根、苗都显得不健
壮。加入NAA后明显提高了分化率，但随 NAA浓
度(O．1～4．0 rag／L)的增加，分化率先从 61 增加
到 76 ，然后又下降到 48 ；平均每个外植体分化
的块茎数从 8．99±1．06个逐渐减少到 5．94±0．47
个。NAA浓度为0．1 mg／L时，外植体分化的块茎
小；NAA浓度在 0．5～4．0 mg／L范围内时，外植体
分化的块茎大 。只有当 NAA浓度为 0．5 mg／L时，
植株的分化率和每个外植体上分化的块茎数达到最
高，分别为 76 和 9．97±0．81。
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2期 罗成科等：三叶半夏叶片一步成苗离体培养技术 263
2．2．3组培苗的移栽 采用 四种方式对 MS+0．5
mg／L NAA+0．5 mg／L BA培养基上的组培苗进
行移栽。一个月后的观察结果表明，四种不同的移
栽方式对再生小植株的成活有一定影响(表 3)，其中
Ⅳ为最佳移栽方式，成活率高达 ioo％(图版I：F)。
表 2 NAA对半夏离体叶片一步成苗的影响
Table 2 Effect of NAA on the one-step culture
of excised leaf in P．ternata
表 3 移栽方式对再生小植株成活率的影响
Table 3 Effects of different transplant way on survival
rate of regenerated plantlets
3 讨论
3．1外植体的选择
在半夏的组织培养中，前人曾用块茎，茎尖，珠
芽，叶柄，叶片，嫩茎段，种子等均实现了外植体的脱
分化和植株的再生，但究竟用哪个外植体效果最佳，
众说不一。任家惠等(1983)、韩献忠等(1989)、朱忠
荣等(1991)认为叶片的诱导能力较其它器官强，万
美亮等(1995)认为叶柄的诱导能力最好，夏海武等
(1994)、罗光明等(2003)的结果表明块茎最适合于
作为外植体。白雨等(2003)更是把最佳外植体精细
地划分到了叶柄基部。这说明外植体的脱分化和植
株的再生受多种因子的影响，接种材料的组织部位、
植株年龄、取材季节以及植株的生理状况等都会直
接影响培养效果(江苏省植物组织培养协会，1988)，
另外不同种类、不同浓度激素及其配比以及培养条
件等对培养效果影响很大。为了尽量缩小遗传组成
的差异，本实验中一律采用同一居群的半夏叶片作
为培养材料，取得了良好的效果。之所以选用叶片
是因为，相比其它外植体，叶片易于获得，消毒也容
易，更为重要的是，培养材料用量大时，同一居群中，
换用其他器官作为外植体可能不够，只有叶片数量
最多，能保证组织培养的顺利进行。
3．2不同激素组合对半夏离体叶片一步成苗的影响
植物组织培养再生途径主要为外植体完全脱分
化形成愈伤组织，然后将愈伤组织转移到分化培养
基上分化出芽，再将其转移到生根培养基上诱导生
根，但该途径较烦琐，种质易产生变异，再生频率不
高。而一步成苗法就是外植体在脱分化后，不需要
转移到分化培养基上，而是直接在原培养基上再分
化，分化的顺序通常是先根后芽，直至形成健壮的全
苗(罗成科等，2003)。其具有的特征是：再生周期
短，再生频率高，易操作，培养程序简单，不影响增殖
率，能保持原种特性，便于大规模生产。半夏的一步
成苗方面，前人作过一些试探性工作，但缺乏系统
性，实验结果中反应不出高频率再生，况且一步成苗
过程中大多要经过愈伤组织阶段。在本研究中，我
们探索了半夏一步成苗的两种途径：一种是经过愈
伤组织阶段的一步成苗，一种是不经过愈伤组织阶
段的一步成苗。其中，后者无论在植株分化率、每个
外植体上分化的块茎数还是成苗时间的早晚上都优
于前者；而且后者一步成苗过程中不经过愈伤组织
这一环节，因而没有突变产生，可以忠实地保留原用
半夏材料的一切遗传特性和药效。所以综合这几个
指标考虑，我们选用 MS+0．5 mg／L NAA+0．5
mg／L BA作为半夏高频率再生的最佳培养基。
半夏组织培养如果激素配比适当，可在一种培
养基上一次性获得试管苗。所用的激素种类和浓度
要兼顾外植体的脱分化及形成健壮的足够多的根和
芽。在本研究新用的 MS+0．5 mg／L 2，4一D+1．0
mg／L KT配方中，细胞分裂素的浓度高于与之搭配
的生长素浓度，这与任家惠等 (1983)、韩献忠等
(1989)、朱忠荣等(1991)、李光胜等(1992)、万美亮
等(1995)的研究结果一致。然而最佳配方 MS+
0．5 mg／L NAA+0．5 mg／L BA中，细胞分裂素的
浓度与所搭配的生长素浓度相当，就其原因有待进
一 步研究 。
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264 广 西 植 物 27卷
3．3组培苗的移栽
组培苗移栽到土壤中，是组培苗从无菌到有菌、
异养到自养和恒定条件到可变环境的剧烈变化过
程，多数植物需要一个炼苗过程，成活率较高。本实
验采用 四种不同方式 ，对根叶完整的再生植株进行
了移栽。通过对比分析表明，组培苗经过一周炼苗，
在蒸煮消毒过的腐质土与细沙的等量混合基质中移
栽 1个月后，成活率达到 100 。实验中发现有些
植株在移栽后的前几天，地上部分生长不良，甚至萎
蔫，但随后几天内又会重新发出芽来，直至形成完整
植株。另外对一些有根无芽、有芽无根和还未明显
根芽分化的小块茎进行了移栽，发现它们也可成活，
这说明半夏试管苗的成活与否取决于新生的小块
茎，小块茎具有分化器官的潜能，这与李光胜等
(1992)的结果一致。关于再生植株的遗传稳定性及
其品质尚有待进一步研究。
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