全 文 ：葛枣猕猴桃叶片蛋白质双向电泳体系的研究
许培磊，秦红艳，刘迎雪，王振兴，范书田，杨义明，艾 军* (中国农业科学院特产研究所，吉林长春 130112)
摘要 ［目的］建立葛枣猕猴桃叶片蛋白质双向电泳体系。［方法］通过对不同的蛋白质提取方法、裂解液配方及 IPG胶条的探索，建
立适应于葛枣猕猴桃叶片双向电泳技术体系。［结果］TCA/丙酮法 +配制裂解液较适用于葛枣猕猴桃叶片蛋白质组分析。最终可获
得蛋白质点丰富、分辨率高的双向电泳图谱，可以检测出 450个清晰的蛋白质点。［结论］该研究为在蛋白质组水平揭示叶片颜色变化
的调控机制奠定基础。
关键词 葛枣猕猴桃;叶片;蛋白质提取;双向电泳
中图分类号 S663． 4 文献标识码 A 文章编号 0517 －6611(2014)22 －07307 －03
Study of Two-dimensional Electrophoresis Platform for Actinidia polygama Leaf Proteomic
XU Pei-lei，AI Jun et al (Institute of Special Wild Economic Animal and Plant Science，Chinese Academy of Agricultural Sciences，
Changchun，Jilin 130112)
Abstract ［Objective］The aim was to establish the two-dimensional electrophoresis platform of Actinidia polygama leaf． ［Method］Different
protein extraction method，cracking fluid formulation and length of the gel strips were tested． ［Ｒesult］The result showed that the manual con-
fect cracking fluid formulation was suitable for the leaf protein dissolution than the sequential extraction kit． 450 protein spots were detected
and the high-resolution two-dimensional electrophoresis map was got． ［Conclusion］The study laid foundation for revealing regulatory mecha-
nism of leaf color changes in proteomics level．
Key words Actinidia Polygama;Leaf;Protein extraction;Two-dimensional gel electrophoresis
基金项目 公益性行业(农业)科研专项(20110337);吉林省科技发展
计划项目(20140204034NY)。
作者简介 许培磊(1984 －)，女，吉林扶余人，助理研究员，硕士，从事
野生果树蛋白质组分析。* 通讯作者，研究员，博士，从事
野生果树资源收集、评价与利用研究。
收稿日期 2014-06-27
葛枣猕猴桃［Actinidia polygama (Sieb． et Zucc．)Max-
im］系猕猴桃科猕猴桃属多年生藤本植物，其果实多汁，酸甜
适口，风味独特，主要含有多糖、有机酸、氨基酸、黄酮、多种
维生素等，还含有较丰富的超氧化物歧化酶［1］，主要分布于
我国东北、华北，朝鲜、日本及苏联远东地区［2］。葛枣醇具有
较高的药用价值［3］，在韩国一直用作治疗风湿性关节炎的民
间药物［4］。
目前，研究者对葛枣猕猴桃的研究多集中在有效化学成
分研究、无性繁殖技术、杂交育种研究、采后生理及产品开发
研究等［5 －8］，尚未见关于葛枣猕猴桃彩叶机理的研究。在其
他植物上，研究者通过色素组成、叶绿体和细胞核等方面对
叶片出现异色的番茄、玉米、小麦等进行了研究［9 －11］，结果发
现，异色叶组织的叶肉细胞出现了差异［12］，超微结构显示，
红檵木叶片由红色变为红绿再变为绿色的过程中叶绿体、基
粒及淀粉均发生了变化［13］。研究者对于叶色变化机制的研
究往往集中在生理生态学上，蛋白质组学应用于分析葛枣猕
猴桃叶色变化机制的研究尚未见报道。笔者以葛枣猕猴桃
不同颜色部分为试验材料，通过对不同蛋白质提取方法、裂
解液配方及 IPG胶条的探索，建立适应于葛枣猕猴桃叶片双
向电泳技术体系，旨在为蛋白质组水平揭示叶片颜色变化的
调控机制奠定基础。
1 材料与方法
1． 1 材料 试验材料采自中国农业科学院特产研究所猕
猴桃圃，于 6月下旬采集部分变为白色的叶片，分别切取白
色与绿色部分，去除主叶脉，作为白色叶片样品与绿色叶片
样品，速冻于液氮中带回实验室，保存在 －80 ℃冰箱中待用。
1． 2 主要试剂 IPG 胶条、SDS、N，N’－甲叉双丙烯酰胺、
TEMED、AP、DTT、TBP、PMSF、载体两性电解质(bio － lyte)、
CHAPS、β －巯基乙醇、矿物油 、低熔点琼脂糖、尿素等试剂、
顺序提取试剂盒购自美国 Bio － Ｒad 公司。碘乙酰胺、硫脲
购自 Sigma公司。PVPP、丙烯酰胺为进口分装。抗坏血酸、甘
氨酸、三氯乙酸、蔗糖、Tris － base、苯酚、EDTA 以及其他常用
试剂均为分析纯。所用水均为 MilliQ 水。
1． 3 主要仪器 分光光度计，PＲOTEAN IEF Cell 等电聚焦
系统，Mini-PＲOTEAN 3 和 PＲOTEANⅡxi Cell 垂直电泳系统，
PDQuest 凝胶图像分析软件均购自美国 Bio － Ｒad 公司。
PowerLook 2100XL 扫描仪购自美国 UMAX 公司。
1． 4 葛枣猕猴桃叶片蛋白质提取方法
1． 4． 1 酚提取法。称取 1 g 叶片迅速液氮研磨，加 0． 1 g
PVPP继续研磨成细粉，向研钵中加入 10 ml 酚提取液(0． 7
mol /L蔗糖，100 mmol /L KCl，50 mmol /L EDTA，50 mmol /L
抗坏血酸，1%PMSF和 2%巯基乙醇 )，化冻后继续研磨成均
浆，转移到 50 ml离心管中，冰上振荡 10 min，加入 10 ml Tris
－饱和酚，冰上振荡 25 min，静置 5 min后，9 500 r /min、4 ℃
离心 30 min。取上清加入等体积的酚提取液，冰上振荡 25
min，静置 5 min后，9 500 r /min、4 ℃离心 30 min，此步骤重复
3次后取上清加入 5倍体积的预冷乙酸铵甲醇溶液，－ 20 ℃
过夜。离心后弃上清，沉淀用 10 ml 冷甲醇洗 4 遍，后用 10
ml冷丙酮洗 4遍，在 －20 ℃挥干备用。
1． 4． 2 TCA/丙酮法。称取 1 g叶片迅速液氮研磨，加 0． 1 g
PVPP继续研磨成细粉，向研钵中加入 10 ml 含 0． 07%巯基乙
醇的 10%TCA冷丙酮溶液继续研磨成匀浆，－20 ℃放置 2 h，
期间振荡数次，9 500 r /min、4 ℃离心30 min，弃上清，悬浮于10
ml含 0． 07%巯基乙醇的冷丙酮中，－20 ℃放置 1 h，期间振荡
数次，9 500 r /min、4 ℃离心30 min，重复悬浮步骤4次，－20 ℃
安徽农业科学，Journal of Anhui Agri． Sci． 2014，42(22):7307 － 7309，7350 责任编辑 李占东 责任校对 况玲玲
DOI:10.13989/j.cnki.0517-6611.2014.22.002
过夜。离心后弃上清，悬浮于 80%冷丙酮中，－20 ℃放置 1 h，
9 500 r /min、4 ℃离心 30 min，沉淀挥干备用。
1． 5 蛋白质裂解方法
1． 5． 1 顺序提取试剂盒。称取 0． 1 g蛋白质粉末于 1． 5 ml
离心管中，加入 100 μl 提取液Ⅰ，搅匀，振荡 10 min后 13 000
r /min、10 ℃离心10 min，上清即为提取液Ⅰ。向第1步沉淀中
加入 100 μl提取液Ⅱ，搅匀，振荡 10 min，13 000 r /min、10 ℃
离心10 min，上清即为提取液Ⅱ。向第2步沉淀中加入100 μl
提取液Ⅲ，搅匀，振荡 10 min，13 000 r /min、10 ℃离心 10 min，
上清即为提取液Ⅲ。
1． 5． 2 配制裂解液。称取蛋白质粉末 0． 1 g于 1． 5 ml离心
管中，加入配好的蛋白质裂解液(7 mol /L 尿素，2 mol /L 硫
脲，4%CHAPS，65 mmol /L DTT，0． 2% Biolyte)，搅匀，振荡 10
min，13 000 r /min、10 ℃离心 10 min，取上清备用。
1． 6 蛋白质定量方法 参照考马斯亮蓝染料结合法检测
蛋白质浓度。
1． 6． 1 Bradford 储备液。称取 175 g G250 溶解在 50 ml
95%乙醇中，再与 100 ml 88%的磷酸混合。
1． 6． 2 Bradford工作液。将 42． 5 ml水、1． 5 ml 95%乙醇、3
ml 88%磷酸和 3 ml Bradford储备液混合，过滤，室温下保存。
在 10 ml水中溶解 10 mg BSA，分装后保存于 －20 ℃冰箱中。
按表 1配制相应浓度的 BSA溶液，测定时取 20 μl样品加入
1 ml Bradford工作液，摇匀后室温下放置 5 min，A595测定吸
光度值。
表 1 牛血清白蛋白标准溶液配制
浓度∥mg /ml BSA∥mg H2O∥ml
0 0 20
0． 2 4 16
0． 4 8 12
0． 6 12 8
0． 8 16 4
1． 0 20 0
1． 7 聚焦方法
1． 7． 1 IPG 7 cm胶条。蛋白质经过定量之后，取 200 μg，用
水化液稀释到 150 μl，加入到 7 cm聚焦盘中，将胶条胶面朝
下慢慢下压，至胶条完全覆盖在蛋白质溶液中，注意不要产
生气泡。放在聚焦仪上被动聚焦 20 ℃，1 h后加入矿物油，
主动水化 20 ℃，50 μA、11 h后在胶条两极垫滤纸片除盐，同
时将多余的未被胶条吸收的蛋白质溶液擦干净。聚焦程序:
250 V，线性升压，1 h;500 V，快速升压，1 h;4 000 V，线性升
压，4 h;4 000 V，快速，20 000 VH;500 V，快速，任意时间。
1． 7． 2 IPG 11 cm胶条。蛋白质经过定量之后，取 300 μg，
用水化液稀释到 185 μl，加入到 11 cm聚焦盘中，将胶条胶面
朝下慢慢下压，至胶条完全覆盖在蛋白质溶液中，注意不要
产生气泡。放在聚焦仪上被动聚焦 17 ℃，1 h 后加入矿物
油，主动水化 17 ℃，50 μA、11 h 后在胶条两极垫滤纸片除
盐，同时将多余的未被胶条吸收的蛋白质溶液擦干净。聚焦
程序:250 V，线性升压，1 h;1 000 V，快速升压，1 h;8 000 V，
线性升压，4 h;8 000 V，快速，40 000 VH;500 V，快速，任意
时间。
1． 8 平衡与 SDS －PAGE 参照焦竹青等［14］的方法。
1． 9 染色与图像分析 参照焦竹青等［14］的方法。
2 结果与分析
2． 1 葛枣猕猴桃叶片蛋白质提取方法的确立 6月下旬葛
枣猕猴桃叶片已经是植株的功能叶片，相对而言不属于幼嫩
组织，因此，先用酚提取法对叶片的总蛋白质进行提取，并用
顺序提取试剂盒对蛋白质进行裂解，结果见图 1。由图 1 可
知，白、绿2种叶片样品在提取液Ⅰ中存在显著差异条带，说明
葛枣猕猴桃的两色组织在蛋白质水平存在差异。在上样量
相同的情况下，提取液Ⅰ的蛋白质条带最少，说明在葛枣猕猴
桃叶片中，高亲水性蛋白质含量较低。提取液Ⅱ与Ⅲ中溶解
的蛋白质最多，对其进行双向电泳，结果见图 2。由图 2 可
知，在图谱中的横纹和竖纹都较多，蛋白质点分离效果很差。
相对于顺序提取试剂盒的裂解效果，配制裂解液的极性
较强，能够得到浓度更高的蛋白质溶液，结果见图 3，但从
SDS-PAGE的效果来看，条带依然存在弥散。
TCA/丙酮法提取蛋白质的含量较低，结合极性较强的
配制裂解液，结果见图 3，相对于酚提取法较为弥散的条带，
TCA/丙酮法提取蛋白质条带清晰，没有太多的杂质，因此初
步确定 TCA/丙酮法 +配制裂解液较适用于葛枣猕猴桃叶片
蛋白质组分析。
注:1．白色叶片采用酚提取法与顺序试剂盒中的提取液 I;2．绿色
叶片采用酚提取法与顺序试剂盒中的提取液 I;3．白色叶片采
用酚提取法与顺序试剂盒中的提取液 II;4．绿色叶片采用酚提
取法与顺序试剂盒中的提取液 II;5．白色叶片采用酚提取法与
顺序试剂盒中的提取液 III;6．绿色叶片采用酚提取法与顺序
试剂盒中的提取液 III。
图 1 葛枣猕猴桃叶片总蛋白质的 SDS － PAGE
2． 2 不同 IPG胶条对分离效果的影响 在确定 TCA/丙酮
法与配制裂解液抽提蛋白质的方法后，对不同长度的 IPG胶条
进行比较分析，7 cm胶条与 11 cm胶条的双向电泳图谱见图
4。由图 4可知，7 cm胶条的 2D-PAGE上横纹较重，高丰度蛋
白质占很大比例，经 PDQuest 软件分析，图上可分辨出 180 个
蛋白质点。相对于7 cm胶条，11 cm胶条中高丰度蛋白质比例
下降，低丰度蛋白质的含量显著增加，且小分子量蛋白质变得
清晰，经软件分析，图上可分辨出 450个蛋白质点。
8037 安徽农业科学 2014 年
图 2 酚提取法与顺序试剂盒中提取液 II，III的双向电泳图谱
注:1与 2．采用酚提取法与配制裂解液;3 与 4．采用 TCA/丙酮法
与配制裂解液。
图 3 酚提取法与 TCA/丙酮法提取叶片蛋白质的 SDS-PAGE
3 结论与讨论
酚提取法与 TCA －丙酮 TCA/丙酮法是植物组织蛋白质
提取最常用的 2 种方法。酚提取法适用于较复杂的植物组
织，TCA/丙酮法较适用于幼嫩的组织［15］，但 2种方法在不同
的植物组织中对蛋白质的提取效果不同，因此在针对一个未
开展过蛋白质组研究的植物而言，2 种提取方法都要进行
尝试。
葛枣猕猴桃叶片中富含酚类、多糖、核酸、微量元素
等［16 －17］，严重影响蛋白质提取效果、等电聚焦及双向电泳图
谱的分辨率。样品制备是建立双向电泳技术体系的重要环
节，也是运用差异蛋白质组学手段研究葛枣猕猴桃叶色变化
机理的首要解决问题。研究表明，TCA －丙酮沉淀法能够有
效降低蛋白质样品中盐、糖类、脂类、核酸等杂质对试验的干
扰［18］，结合极性较强的配制裂解液，能有效地将葛枣猕猴桃
叶片中的蛋白质提取并裂解。
通过对不同蛋白质提取方法、蛋白质裂解方法及 IPG胶
条长度的摸索，建立适用于葛枣猕猴桃叶片蛋白质的提取方
图 4 不同 IPG胶条长度对蛋白质点分离效果的影响
(下转第 7350页)
903742卷 22期 许培磊等 葛枣猕猴桃叶片蛋白质双向电泳体系的研究
表 4 果实调查测定结果
品种 硬度∥kg /cm2 果皮颜色 果肉颜色 含糖量∥%
红勋 1号 14． 27 深红 红色 13． 47
冰心 1号 13． 27 黄 淡黄 13． 87
红星 4号 14． 77 黄红 淡黄 13． 60
安 1号 12． 93 黄 淡黄 14． 70
红星 7号 14． 60 洋红 淡黄 13． 55
红星 1号 11． 40 条红 淡黄 13． 50
红星 5号 12． 53 全红 淡黄 11． 00
冰心 2号 12． 27 黄色带条红 淡黄 13． 05
红星 2号 13． 43 条红 青白 13． 29
k9 12． 20 条红 青白 12． 80
2 －4 12． 60 条红 青白 12． 30
311 11． 60 条红 青白 12． 70
黄海棠(CK) 10． 80 条红 青白 10． 70
号 ＞红星 5号 ＞冰心 2号 ＞2 －4 ＞ k9 ＞311 ＞黄海棠;总酸含
量为红勋 1号 ＞冰心 1号 ＞红星 7号 ＞安 1号 ＞红星 4号 ＞
冰心 2号 ＞红星 1 号 ＞红星 5 号 ＞红星 2 号 ＞ k9 ＞ 2 － 4 ＞
311 ＞黄海棠。冰心 1号、红星 1号、红星 5号、冰心 2号、k9、
311、黄海棠果形指数是 0． 8 ～ 0． 9，为圆形或近圆形;安 1 号、
红星 2号果形指数是 0． 8 ～ 0． 6，为扁圆形;红勋 1 号、红星 4
号、2 －4果形指数是 0． 9 ～1． 0，为椭圆形或圆锥形;红星 7号
果形指数是 1． 0以上，为长圆形。
3 结论
(1)高酸海棠的 13个佳系具有早实特性，在试点均能完
成萌动、展叶、新梢生长、开花、结果、封顶和落叶等树木生长
的全物候期，且高酸海棠13个佳系各品种之间的物候期差
表 5 果实加工性能对比调查结果
品种
VC
mg /kg
总酸
g /kg
果形指数
可溶性固
形物含量∥%
风味
红勋 1号 56． 6 17． 32 0． 94 13． 5 酸
冰心 1号 40． 4 16． 14 0． 90 14． 0 酸
红星 4号 42． 4 11． 54 0． 92 14． 2 甜酸
安 1号 40． 2 11． 62 0． 74 14． 8 甜酸
红星 7号 36． 0 12． 58 1． 12 12． 2 甜酸
红星 1号 32． 1 9． 76 0． 82 12． 2 甜酸
红星 5号 30． 9 7． 86 0． 83 11． 2 甜酸
冰心 2号 30． 8 10． 49 0． 88 13． 5 酸
红星 2号 31． 0 7． 34 0． 76 13． 3 酸甜
k9 30． 4 6． 95 0． 89 17． 2 香甜
2 －4 30． 7 6． 15 9． 30 11． 3 酸
311 28． 0 6． 07 0． 85 15． 2 香甜
黄海棠(CK) 20． 8 6． 02 0． 86 15． 6 甜酸
异不大。
(2)花芽结果比例红勋 1号和红星 4号表现最高。
(3)单株产量红勋 1号和冰心 1号较其他佳系高。
(4)综合 VC 含量和总酸含量来看，红勋 1 号、红星 4 号
和冰心 1号加工性能较高。
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104 －107．
(上接第 7309页)
法及双向电泳技术体系，即采用 TCA/丙酮法提取，配制裂解
液裂解，11 cm IPG胶条，300 μg 蛋白质上样量，主动水化可
以获得蛋白质点丰富、分辨率高的双向电泳图谱。
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0537 安徽农业科学 2014年